의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

요약

우리는 해양 바다 토끼 신경계의 해부를 설명 군소 마취 후, 단기 - 조직 문화에 대한 신경과 패치 클램프 기법을 통해 단일 ​​셀 이온 전류의 녹음 격리.

초록

해양 복족류 연체 동물 군소 californica는 학습과 기억의 연구에서 특히 의미와 신경계 기능의 모델로 오래된 역사를 가지고 있습니다. 이러한 연구의 일반적인 준비는 감각과의 motoneurons은 최소한의 해부 동물에 그대로 유지 또는 개별 감각과의 motoneurons의 기술적 정교한 신경 세포 공동 배양되는 것입니다. 덜 일반적인 명목상 동종 신경의 작은 클러스터 단기 문화에 하나의 세포로 해리되는 격리 된 신경 세포의 준비입니다. 이러한 고립 된 세포 패치 클램프 기법, 이러한 컨덕턴스의 대상으로 변조를 사용하여 이온 전류의 생물 물리학 적 특성에 유용합니다. 이러한 문화를 준비하기위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. 프로토콜은 흉막과 구강 신경절 쉽게 식별 글루타메이트 감각 뉴런을 활용하고, 그들의 분리와 최소한의 유지 보수를 설명 I혈청없이 며칠 동안 N 문화.

서문

해양 opistobranch 연체 동물, 군소은 수십 년 동안 유용하게 신경 생물학 모델이다. 그것은 가장 이니와 고전적 조건 ^{7, 8의} 모델로 알려져 있습니다. 이 모델의 학습과 기억에 대한 연구는 그가 Arvid Carlsson의 폴 Greengard ^10과 공유 상에 에릭 칸델 Eric R. Kandel을 위해 2000 년에 생리학 또는 의학에 노벨상을 수상했다. 감소 준비에서 전기 녹음과 관련된 연구는, 어떤이 무척추 동물의 신경계의 요소는 신경과 동물에서 해부와 근육이 부착 군소의 개별 뉴런의 역할을 명료 도움이 떠났다. 군소 학습 구성 정확한 분자 메커니즘의 식별하지만, 종종 개별 기증자 동물의 하나 하나를 얻은 또 다른 기술, 장기 감각 신경 세포의 공동 문화와 motoneuron을 고용하고 배양 접시 ²¹ 시냅스를 형성 할 수 .

우리는 다른 사람 ^{1, 3, 6, 14, 15, 16} 신경이 명목상으로 균일 한 뉴런의 클러스터 해리 단기 문화를 만들기 위해 장기 실험에서뿐만 아니라 자신의 인내로이 모델에서 타겟팅 할 수 있습니다 발견되는 용이성을 악용 한 하는 우리는 패치 클램프 구성에서 전압 클램프에서 이온 전류를 공부합니다. 많은 군소 뉴런은 오랫동안 실험 조작을위한 시간을 허용하는 클램핑 패치의 반복 라운드까지 서있다. 이 기술은 같은 복부 신경절의 neurosecretory 가방 세포와 분리 우리가 설명 흉막 및 구강 신경의 감각 신경으로 신경 유용합니다,하지만 매우 큰 뉴런> 60 μm의 같은 L7으로 직경 또는 R2 복부 신경절. 우리는 다른 설명 감각 - motoneuron 공동 배양과는 달리, 우리의 문화에서 군소 혈청을 사용하지 않습니다. 이 절차를 사용하여 얻은 대부분의 뉴런은 t에 대한 프로세스없이됩니다그는 전체 셀 전압 녹화를 촉진 문화의 첫 48 시간,하지만 그 새싹과 영양분 및 / 또는 성장 인자의 부족으로 사망하기 전에 약 14 일 동안 축삭과 다른 프로세스를 자세히 설명합니다.

이 기술은 구강 및 흉막 신경의 생리적 문서화 지역의 접시 당 50-100 뉴런의 차 문화를 생산하고 있습니다. 이 프로토콜은 연구자들이 다양한 실험은 동물마다 복제 요구하는 실험에서 단일 세포 생리학의 여러 측면을 연구하는 데 유용합니다. 그것은 일치 처리 및 통제 문화에서 공부하는 혜택을 허용, 왼쪽과 오른쪽 hemiganglia에 표적 세포의 해부학 적 분리에 의한 문화의 일치하는 쌍을 생성합니다.

프로토콜은 구강 신경의 구강 S 클러스터 (BSC) 뉴런, 그리고 흉막 신경절의 흉막 ventrocaudal (PVC) 뉴런을 대상으로합니다. 이러한 세포는 전체 셀 전압 녹음 및 디스플레이 robus에 적절한 사이즈입니다T 글루타메이트 반응. 논의 방법론은 군소 신경계에있는 대부분의 신경에 적합합니다.

프로토콜

1. 세포의 준비

1. 1 일에, 무게와 동물을 마취.
   1. 30 G-1kg 동물의 무게. 등장 MgCl : 1시 1분 해수의 5-10 동물의 볼륨을 마취. 이러한 연결 airstone와 전기 수족관 공기 펌프로 통기와 함께 1 시간 동안 6H ₂ 0.
2. 해부 용품을 준비합니다.
   1. 같은 패브릭 핀으로 스테인레스 스틸 직선 핀, 깨끗 해부 트레이를 조립합니다. + 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S). 여러 배양 인공 해수를 포함하는 요리 (표 1 및 3 참조 ASW)을 조립
   2. 준비 저전력 현미경이있다. 깨끗한 절개 악기와 같은 늑골이있는 코와 미세 수술 집게로 준비하고, 정밀하고 큰 수술 가위있다. 사용하기 전에 70 % isopropol 알코올과 악기를 스프레이하고 건조 할 수 있습니다.
3. 절개 트레이에 위치 동물입니다.
   1. 절개 트레이에 위치 동물의 복부 측면 아래로. 핀 동물신체 벽 parapodial 테두리 만 등의 표면을 노출, 꼬리와 머리를 방지하고 성기 홈의 가장자리를 통해
   2. 실행 속도가 느린 차가운 수돗물 등의 표면을 씻어. 성기 홈을 따라 스퀴즈 병 및 머리의 정상에 70 % isopropol 알코올의 빛 스트림을 적용합니다.
4. 초기 절개를합니다.
   1. 얕은을 자르기에있는 동안 저전력 현미경을 사용하여 (표 2 참조) 성기 홈이 전방 쉘 여백에서 유래 점을 관찰 할 수 빛의 반사, tautly, 늑골 코 집게이 원점의 왼쪽에 조직의 배 홀드 잘 각도 가위로 성기 홈의 오른쪽에 몸을 벽의 부드럽고 평평한 지역을 통해 모든 방법을 구멍입니다.
   2. 혈 림프는 때때로 그것으로 복부 신경절과 위장을 들고 구멍에서 부어 관찰해야한다.
5. 절개를 확장합니다.
   1. 일을 확장하는 큰 가위를 사용하여전방 rhinophores 사이의 지점에 전자 절개, 낮은 블레이드 위쪽으로 당기면서하면 직감을 새김 눈 방지 할 수 있습니다. 내부 장기를 절개 밖으로 유출 관찰됩니다.
6. 신경을 제거합니다.
   1. 트레이를 옮기고 머리 지역에 현미경을 재조명.
   2. 깨끗한 포셉 및 미세 가위를 사용하여 한 지점에서 그룹으로 흉막 페달과 대뇌 신경을 제거하는 식도 주위에 반지에 머리 신경절을 형성하는 신경을 절단하는으로 머리 신경절을 제거합니다.
   3. 식도의 복부 측면을 준수 구강 신경절을 제거합니다.
   4. 이 신경절에서 4 큰 신경 접속사가 문제를 절단하여 복부 신경절을 제거합니다.
7. 관심 신경절을 분리합니다.
   1. 신경절의 최소 직경과 동일합니다 그 각각의 신경절에 연결 접속사의 길이를 떠나, 떨어져 머리를 신경 트림,이 효소 지체 과다 소화다음 단계에 대한 관심의 세포.
   2. ASW의 2 헹굼 + 깨끗한 포셉 린스 간 이동 P / S를 통해 각 대상 신경절을 넣어.
   3. PVC 세포를 대상으로하는 경우, 오른쪽 페달 hemiganglion에 연결된 오른쪽 흉막 hemiganglion을두고 마찬가지로 왼쪽 페달 hemiganglion에 연결된 왼쪽 흉막 hemiganglion을 둡니다.
   4. 불필요한 신경 및 허용 연구 방법에 따라 동물의 나머지를 버린다.
8. 효소 신경을 소화.
   1. 각 신경절의 경우, 3.75 MG 디스 파제 (dispase), 1 밀리그램 히알루 및 ASW의 ML 당 0.3 g 콜라 유형 XI로 구성된 효소 용액 1 ㎖를 준비하고 15 ML의 폴리 프로필렌 원뿔 튜브 + P / S.
   2. 장소는 효소 용액에 신경을 씻어서 뚜껑을 꼭 부착합니다. 약 23에서 하룻밤 13-5 시간 동안 느린 속도로 회전하는 셰이커 (표 2 참조)에 자사의 측면에 튜브를 놓습니다 ° C (실내 온도).
9. 준비배양 접시.
   1. microdissection을하기 전에 (2 일), 폴리-D-라이신 (PDL) 코팅 조직 문화 후드에서 배양 접시를 준비합니다. ~ 25 분 35 밀리미터 접시의 중앙에 ~ 0.5 ML PDL를 (0.2 ㎎ / 멸균 ml의 물)를 추가합니다.
   2. 멸균 물을 3 배 PDL을 씻어. 건조하도록 허용합니다. 접시를 UV-소독.
10. 하루에 2 뉴런을 분리합니다.
    1. PDL 코팅과 달리 건조 그릇 안에 미디어의 섬을 만들 ASW + P / S의 약 0.5 ml의 살균 UV 있었다 35mm 요리의 중심을 입력합니다. 이 조직 문화 후드 외부 벤치에 수행 할 수 있습니다. 한 접시 hemiganglion에서 발생하는 각 셀의 클러스터에 대해 준비를해야합니다.
    2. 실 가드 코팅에 의해하고 (표 3 참조) 핀 및 프로브로 사용되는 여러 가지 크기의 미세 해부 핀으로 장착 5mm 깊이 해부 표면을 경화 준비 100 mm 직경 해부 접시가있다. ASW와 + P / S, 그리고 마지막으로 인터넷 다음, 70 % isopropol의 알코올이 요리를 씻어그것은 ASW + P / S로 어떠냐
11. 소화 신경의 microdissection을 준비합니다.
    1. 해부 접시에 소화 흉막 페달 및 구강 신경절을 포함하는 효소 용액을 붓는다.
    2. 반사 조명 아래 검은 색 표면에 대한 현미경의 무대에서 접시를 놓습니다.
    3. 첨부 된 결합 조직을 사용하여 각 흉막 페달 hemiganglion의 등쪽면을 아래로 핀. 조직 부드러운 스트레칭의 관용 될 것입니다.
12. PVC 신경을 Microdissect.
    1. 깨끗한 미세 집게 2 쌍을 사용하고 프로브 등 포셉 한 쌍의 미세 절개 핀을 들고, 흉막 hemiganglion에서 PVC 세포를 분리. 효소 분해 제거 또는 PVC 클러스터를 덮고있는 결합 조직 칼집 떨어져 깨진, 아직 세포가 서로를 준수 할 것.
    2. 페달 흉막 결합 ^18에서 이러한 세포를 분리하기 위해 프로브를 사용하여, 다음 해부의 바닥에 세포 클러스터 떨어지게요리.
13. 문화 요리에 신경을 전송합니다.
    1. 부드럽게 공기 방울을 도입하지 않도록주의하고, 그 문화 접시에 매체 섬으로 천천히 분배, 약간 불 광택 일회용 유리 파스퇴르 피펫의 끝으로 클러스터를 빨아들이 준비한 35mm 배양 접시에 세포 클러스터 전송 피펫으로. 별도의 배양 접시에 다른 hemiganglion과 장소의 PVC 클러스터의 분리를 반복합니다.
14. BSC 신경을 Microdissect 및 전송할 수 있습니다.
    1. 관심의 세포를 절약하는주의 최대 구강 신경절 복부 측면을 핀. 구강 신경절 ^(10)의 2 BSC 세포 클러스터와 단계 1.12를 반복합니다.
    2. PVC 클러스터를 포함하는 BSC 클러스터와 2 요리를 포함하는 2 요리 : PVC와 BSC 뉴런의 분리는 신경 세포의 클러스터를 포함하는 4 배양 접시를 생성합니다. 신경의 나머지를 삭제하고 100mm 해부 접시를 따로 설정할 수 있습니다.
15. Dissoc세포 클러스터를 늦.
    1. 저전력 현미경의 무대에 세포를 포함하는 배양 접시를 놓고 덮개를 제거합니다.
    2. 부드럽게 포셉에서 개최 미세 해부 핀 세포 클러스터에 인접한 문화 접시의 바닥을 쓸어 PVC 클러스터를 떼어 놓다. 가볍게 치기는하지만 플라스틱의 반점을 찾아 내려고 노력으로 접시의 바닥의 플라스틱으로 핀의 끝을 파고있다. 플라스틱 마찰 핀 포인트를 놓을 때, 타악기 파가 떨어져 세포의 근처의 덩어리를 나누기 매체를 통해 생산됩니다.
    3. 5-10 제스처는 거의 완전히 세포를 떼어 놓다 필요하지만 세포가 기계적 깎아 지른듯한 의해 파괴되지 않도록 너무 가볍게하기보다는 세포의 작은 클러스터를두고하는 것이 좋습니다 수 있습니다.
    4. 커버 및 기타 문화 요리와 함께 반복을 대체합니다.
16. 세포 배양을 저장합니다.
    1. 해리 세포의 가운데에있는 미디어 제도를 포함하는 배양 접시에 배치같은 150 × 25 mm 둥근 플라스틱 페트리 접시로 공기 순환을 허용하고 17 ° C.에 보육 세트에이 접시를 놓고 대형 컨테이너
    2. 챔버 습도의 소스로 물을 오픈 접시를 설치합니다. 하룻밤 그대로 둡니다. 세포는 접시의 중앙에있는 폴리 - D - 라이신 코팅을 준수합니다.
17. 홍수 문화 요리.
    1. 3 일에 조심스럽게 ASW의 2.5 ML를 요리 홍수 + P / S. 검사 및 역 세포 배양 현미경을 사용하여 세포를 계산합니다. 17 ° C 배양기에있는 상점.

2. 전기 생리학

방법은 (예를 들어 Sakmann 및 Neher, 1995) 수많은 텍스트에 ^16을 설명했습니다 그 죄는 표준 패치입니다. 이 프로토콜은 세포 ≤ 100 PF 커패시턴스, 또는 셀 <프로토콜의 일 3, 4시 60 μm의 직경을 작동합니다. 프로세스가없는 세포는 녹음에 최적입니다. 다음과 같은 특별한 considerat이온이 적용됩니다 :

1. 큰 세포는 β = 0.1로 설정 Axopatch 200B 앰프의 구성 설정을 수용 할 수 있습니다. 매우 큰 전류의 활성화는 세포 전압 클램프를 탈출하는 원인이 될 수 있습니다. ASW 솔루션 (불 침투성 N-메틸-D-글루 카민 염화로 치환 된 염화나트륨의 예를 들어 분수) 소금 함량을 대체 전체 셀 전류 진폭을 줄일 수 있습니다.
2. 피펫 풀러를 뽑아 KCl을 다른 소금 450 ​​밀리미터 (표 1 참조)으로 구성된 세포 내 용액 (ICS)와 중간 채워질 섬유 채워진 붕규산 패치 피펫가 적합하며, 약 0.5 mOhms 온 저항이 있어야합니다. 특정 이온 전류의 차단이 필요한 경우, 예를 들어, 나는 ⁺ K 전류, K ^+이 솔루션의 부재에서 전류와 같은 고사 ⁺ 등의 이온으로 대체 될 수 있습니다. CL ^- 더 자연 ICS가 필요한 경우 impermeant 음이온와 ICS의 교환도 보증^9.
3. 세포는 실온에서 가능> 1 시간 - 긴 녹음과 강력한입니다. 기록 문화의 24-48 시간에 해당하는 일 3 프로토콜의 4 최적입니다. 48 시간 후 어려움 때문에 세포 표면에 glycocalyx의 정교화, 아마 기가 옴 물개를 형성하고, 공정 부산물에 의한 공간 클램프 문제가있다. 세포는 <14 D에 완료 할 수 있습니다와 같은 독극물과 같은 비 패치 클램프 연구를위한 유용한, 그러나이다.
4. ASW와 다른 솔루션 중력 공급 솔루션 장치에서 분배 할뿐만 아니라, 세포 내 솔루션을 통해 필터링해야 기가 옴 씰 형성을 방해 미세 입자를 제거하기 위해 0.2 μm의 Acrodisk 필터 (표 3) 주사기 장착.
5. 같은 D-아스파 라진 산염 (D-ASP)를 같은 작용제를 사용하는 경우 탈감작이 발생하므로 작용제의 응용 프로그램 사이에 1-2 분 ~를 추천합니다. 반대로, 상승 작용은 종종 신속하게 반복 응용과 관찰이러한 L-글루타민산 (L-글루) 등의 작용제의 양이온.
6. 이러한 L-글루 등의 작용제 작동 전류는 picospritzer 피펫 작용제를 적용하여 공부하실 수 있습니다. 이 피펫은 패치 피펫과 동일하게 뽑아 ASW의 작용제를 포함합니다. 이 피펫 팁 중력 공급 솔루션 장치의 유출 파이프 아래에 위치하며, 유출 관 (그림 2F)에서 45 ° 각도로 작용제를 신속하게 셀에서 씻겨되며, 탈감작을 최소화 할 때. 작용제 피펫은 90 ° 또는 패치 피펫에 더 상대의 각도를 만들어야합니다.

결과

이 프로토콜에서 대상으로하는 신경에서 감각 신경의 위치는, BSC 및 PVC 뉴런은 그림 1에 표시됩니다. BSC의 뉴런은 구강 신경절, 그대로 신경절 (그림 1A)에서 구강 질량에서 멀리 얼굴 표면의 복부 측면에 2 대칭 타원형 클러스터에 있습니다. PVC 뉴런은 중앙 축 (그림 1B)쪽으로 흉막 신경의 등쪽 표면의 주위에 래핑하는 양측, V-모양의 클러스터를 형성합니다. ?...

토론

분리 기술은 아교 및 기타 미확인 세포의 작은 숫자와 함께 산재 50-100 고립 된 뉴런을 포함하는 감각 신경 세포의 배양을 얻을 여기에 설명. 프로토콜에서 가장 중요한 단계는 신경 효소 용액에 남아있는 시간이며, 개별 세포로 클러스터를 분열하는 소화 세포 클러스터의 분리를 가볍게 치는. 효소 소화 (단계 1.8) 사용 가능 온도에서 최적화해야합니다. 23 천천히 흔들어 ° C, 13 시간은 BSC 클러스터...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.