隔离的感觉神经元中<em&gt;海兔丫</em谷氨酸能电流膜片钳记录

摘要

我们描述了解剖海洋海兔的神经系统海兔

摘要

海洋腹足类软体动物海兔丫有悠长的历史，作为神经系统的功能模型，在学习和记忆研究中具有特别重要的意义。这类研究的典型制剂在其中的感觉和运动神经元保持不变在微创解剖动物，或技术上精心制作的个人感觉和运动神经元的神经细胞共同培养。不太常见的是孤立的小群名义上均匀的神经元是神经制剂，其中分离成单个细胞在短期文化。这种分离的细胞是有用的生物物理特性，使用膜片钳技术，和有针对性的调制这些电导的离子电流。准备这种文化的一种协议。该协议需要容易识别谷氨酸胸膜和颊神经节的感觉神经元中的优势，并介绍了他们的分离和最小的维护，我N培养无血清几天。

引言

的海洋opistobranch软体动物， 海兔 ，几十年来一直是一个有用的神经生物学模型。它最出名的习惯和古典空调^7，8作为一种模式。在这个模型中对学习和记忆的研究获得了诺贝尔生理学或医学奖的埃里克·坎德尔在2000年，他与阿尔维德·卡尔松和保罗·格林加德¹⁰奖品。研究涉及电气录制减少制剂，这种无脊椎动物的神经系统的元素，从动物解剖与神经和肌肉的左连接，这些都有助于阐明海兔的单个神经元的角色。的确切的分子机制，构成海兔学习识别然而，通常采用的另一种技术，长期共培养的感觉神经元和运动神经元，获得从单个供体动物，并允许以形成突触在培养皿²¹ 。

我们和其他^{1，3，6，14，15，16}利用难易程度，确定在这个模型中的神经元可以有针对性的，以及他们的耐力在长期的实验，使游离短期名义上均匀的神经元集群文化我们研究离子电流电压钳下膜片钳配置。许多海兔的神经元站起来，反复多轮膜片钳技术，以便有时间为持久的实验操作。该技术是非常有用的，如神经内分泌袋腹神经节细胞，和我们在这里描述的解离的胸腔和颊神经节的感觉神经元的神经元，但不适合非常大的神经元大于60微米直径的，如L7或R2腹神经节。我们不采用海兔血清在我们的文化，不同的是感觉，运动神经元共培养别处描述。大多数神经元将不使用此程序获得流程为t他第一次在培养的48小时，方便拍摄​​全细胞电压，但将发芽，约14天死于缺乏的营养物质和/或生长因子的前阐述轴突和其他进程。

该技术生产出每盘50-100个神经元的原代培养的颊和胸膜神经节区域从生理记录。此协议是有用的研究人员在研究单细胞生理学方面的实验，需要无数的实验复制每只动物。这产生一对配对培养由于分离成左，右hemiganglia的靶细胞的解剖，允许匹配的处理的和对照培养物的研究中受益。

该协议的目标颊簇（BSC）的口腔神经节的神经元，并胸膜ventrocaudal（PVC）胸膜神经节神经元。这些细胞是全细胞电压记录和显示ROBUS的适当大小吨谷氨酸回应。讨论的方法是适合大多数在海兔神经系统的神经节。

研究方案

1。细胞的制备

1. 在第1天，体重和麻醉动物。
   1. 称取30 G-1公斤动物。麻醉1:1海水量在5-10动物：等渗氯化镁。 6H ₂ 0 1小时，同时通气诸如电动水族馆空气泵连接的气石。
2. 准备夹层用品。
   1. 组装干净的夹层托盘用不锈钢直针，如面料销。组装几个培养皿中含有人工海水（ASW 见表1和表3）+青霉素/链霉素（P / S）。
   2. 已经准备好一个低功耗的显微镜。有干净的清扫工具准备好了，，如肋鼻子和精细的手术钳，罚款和大型手术剪刀。喷仪器70％isopropol酒精使用前晾干。
3. 将动物解剖托盘。
   1. 位置动物腹侧下来在解剖托盘。引脚动物通过的体壁边界parapodial，但避免尾部和头部，背表面暴露生殖器槽的边缘
   2. 在慢速运转的冷自来水冲洗背水面。从挤压瓶沿生殖器槽和头顶以上的应用光流70％isopropol酒精，。
4. 最初的切口。
   1. 使用一个低功率显微镜（ 见表2）和反射光观察生殖器槽来源于前壳边缘点，拉紧保持与带肋鼻钳组织褶皱的这个原点的左侧，而剪断一个浅洞体壁光滑，平整面积只是用细剪刀角度生殖器槽右侧的所有的方式通过。
   2. 应观察淋巴倒孔，有时带着它的腹神经节和胃。
5. 扩大切口。
   1. 使用大剪刀扩大日ë键切口前方之间的点rhinophores的，同时与下刀片上拉，以避免割伤肠道。将观察内部器官，洒出的切口。
6. 取出神经节。
   1. 托盘重新定位和重新聚焦显微镜头区域。
   2. 使用干净的镊子和细剪刀，取出头节被撞断在一个点形成头部的神经节的神经食管周围成环移除胸膜踏板和脑的神经节为一组。
   3. 坚持腹侧食道取出颊神经节。
   4. 取出腹腔神经节，通过削减4大神经连接词的问题，从这个节。
7. 隔离节利息。
   1. 除了修剪头神经节，留下的长度为连接到每个神经节到至少等于直径的神经节还连接词，这会妨碍酶消化过的在下一步骤中感兴趣的细胞。
   2. 将每个目标腱鞘通过ASW + P / S，用干净的镊子之间移动冲洗冲洗2次。
   3. 如果针对PVC的细胞，离开的右侧胸腔hemiganglion的附加到右踏板hemiganglion的，，同样离开所附左踏板hemiganglion的左胸腔hemiganglion。
   4. 丢弃不需要的神经节和动物的其余部分根据公认的研​​究实践。
8. 酶消化神经节。
   1. 对于每一个神经节，准备1毫升酶液组成为3.75毫克1毫克中性蛋白酶，透明质酸酶和0.3克每毫升反潜型胶原酶XI + P / S在15毫升的聚丙烯锥形管。
   2. 地方冲洗节在酶溶液中，并紧紧地盖上盖子。将管在其一侧旋转振动筛13-5小时通宵（ 见表2），以缓慢的速度在约23℃（室温）。
9. 准备培养皿。
   1. 显微切割前（2日），制备聚-D-赖氨酸（PDL）涂层的培养皿，在组织培养罩。添加约0.5毫升PDL（0.2毫克/毫升的无菌水）〜25分钟35毫米的培养皿的中心。
   2. 用无菌水冲洗PDL的3倍。使其干燥。紫外线灭菌的板。
10. 第2天隔离神经元。
    1. 填充35 mm培养皿PDL涂层和ASW + P / S约0.5毫升的紫外线消毒，否则干燥的菜里面创建一个小岛媒体的中心。这是可以做到板凳上，组织培养罩外。应准备一个菜，每个细胞群从hemiganglion。
    2. 准备一个直径100毫米的解剖盘由SYLGARD涂层固化5毫米深的剥离面，配备几个大小被用来作为引脚和探头（ 见表3）精细解剖针。这个菜与70％isopropol酒精冲洗，然后用反潜+ P / S，终于科幻LL反潜+ P / S
11. 准备显微切割技术的消化，神经节。
    1. 倒入溶液中含有的酶消化胸腔踏板和颊神经节解剖盘。
    2. 将菜在舞台上的一个黑色的表面下的反射光显微镜。
    3. 使用所附的结缔组织，牵制每个胸膜踏板hemiganglion的背侧。该组织将软，不耐拉伸。
12. 显微切割PVC神经元。
    1. 使用2对干净的细镊子，拿着一对作为探针，镊子精细解剖针，隔离PVC细胞从胸腔hemiganglion。酶消化将已删除或破碎的结缔组织鞘覆盖PVC集群，但细胞会坚持到另一个。
    2. 使用探头分离这些细胞从踏板胸膜结缔组织^18，然后让细胞簇下降的底部剥离菜。
13. 将培养皿中的神经元。
    1. 到稍微火抛光一次性玻璃巴斯德吸管的尖端轻轻的吸吮集群，然后分配到媒体岛在培养皿慢慢小心，以避免引入气泡准备好的35毫米培养皿中的细胞转移群集进入吸管。重复并放入一个单独的培养皿的其他hemiganglion PVC集群隔离。
14. 显微切割和BSC神经元转移。
    1. 引脚口腔神经节腹侧，与照顾不遗余力感兴趣的细胞。重复步骤2 BSC细胞簇的颊神经节¹⁰ 1.12。
    2. 分离PVC和BSC神经元会产生4个培养皿中的神经元集群：2道菜含BSC集群和2道菜含有PVC集群。丢弃其余的节，并预留100毫米解剖盘。
15. Dissoc第十一条细胞簇。
    1. 将在舞台上的低功耗显微镜培养皿中的细胞，并取下后盖。
    2. 游离的PVC轻轻弹培养皿的底部相邻的用细解剖针钳举行的小区集群的集群。轻拂挖针尖端的塑料盘底部仿佛试图挖掘出斑点的塑料。当与塑料摩擦释放针点，敲击波通过介质分裂细胞附近的丛。
    3. 可能需要5-10笔触，几乎完全分解的细胞，但它是更好地留下小的细胞群而比轻弹太多，免得被破坏的细胞，通过机械纯粹的。
    4. 更换覆盖和重复与其他文化的菜肴。
16. 存储细胞培养。
    1. 将培养皿包含媒体与分离的细胞在其中心岛屿一个大容器，允许空气流通，如150×25毫米的圆形塑料培养皿中，这个菜放在培养箱中集至17°C。
    2. 安装在腔室开放的湿度作为源盘水。离开一夜之间不受干扰。细胞将坚持以聚-D-赖氨酸涂层中心的菜。
17. 洪水培养皿。
    1. 第3天，轻轻地涌入2.5毫升反潜菜+ P / S检查并用倒置的细胞培养显微镜计数细胞。存放在17℃培养箱中培养。

2。电

的方法是标准膜片钳已经描述的在许多文本（ 如索克曼和内尔^{，1995）16。}此协议将细胞≤100 pF电容，或细胞<60微米直径在3日和4日的协议。细胞没有过程的最佳记录。下面特别的体贴离子适用于：

1. 可容纳较大的小区，Axopatch 200B上的放大器设置为β= 0.1的配置设置。可能会导致非常大的电流激活细胞逃避电压钳。取代的ASW的解决方案（ 例如氯化钠取代的一小部分的不渗透，氯化N-甲基-D-葡糖胺盐含量）可用于减少全细胞电流的幅值。
2. 纤维填充的硼硅补丁移液管移液管拉出器上拉半回填与450 mM的KCl和其它盐（ 见表1）组成的细胞内的解决方案（ICS）是合适的，并应具有约0.5-1兆欧的电阻。如果所需的特定的离子电流的隔离，例如，Na ^+的电流的K ^{+，K +}电流在该溶液中的情况下，可以与其他离子如Cs ^​​+的取代。 ICS以浸透阴离子Cl ^-的更换也是必要的，如果需要一个更自然的ICS^9。
3. 细胞> 1小时长的录音有可能在室温强劲。录音3日和4日的协议，是最佳的对应培养24-48小时。 48小时后，有困难形成千兆欧姆海豹，或许是因为在细胞表面的糖被阐述，空间夹紧过程的产物所造成的问题。这些细胞是有用的，但是，非膜片钳毒理学的研究，如在<14天，即可以完成。
4. ASW和重力给料溶液的移动设备被分配的其他解决方案，以及细胞内的溶液中，应进行过滤，通过一个安装在注射器上的0.2微米Acrodisk的过滤器（ 表3），以消除微粒千兆欧姆封接形成干扰。
5. 脱敏时，会发生使用如D-天门冬氨酸（D-天冬氨酸）受体激动剂，因此建议〜1-2分钟的应用程序之间的激动剂。反之，增强作用，经常观察到的快速重复应用阳离子如L-谷氨酸（L-Glu浓度）的激动剂。
6. 如L-Glu浓度的激动剂激活的电流，可以研究应用激动剂与picospritzer吸管。此吸移管被拉到补丁吸管相同，并包含在ASW的激动剂。在此吸移管的前端时的重力给料溶液的移动设备的流出管的下方，并以45°角从流出管（ 图2F），激动剂会迅速洗涤相差的细胞，将被最小化脱敏。激动剂移液管应建立相对的补丁吸管90°或更大的角度。

结果

在这个协议中的对象内的神经节的感觉神经元的位置，BSC和PVC的神经元是如图1中所示。 BSC的神经元位于口腔神经节的腹侧面向远离的颊质量，完整的神经节（ 图1A），表面上在2个对称的椭圆形集群。 PVC神经元形成双边的，V形的簇，环绕胸神经节的背侧表面向中心轴（ 图1B）。这些感觉神经元的神经节内的刻板位置具有的优点，但缺少的右边或左边的群集?...

讨论

这里所描述的解离技术产生感觉神经元的文化含有50-100孤立的神经元穿插着小神经胶质细胞和其他不明身份的细胞数。在协议中最重要的步骤是神经节时，保持在酶溶液，轻弹，打散成单个细胞的群集消化的细胞簇的解离。内切酶消化（步骤1.8），必须在可用的温度下进行了优化。在23℃缓慢摇动，13小时是足以消化的的BSC集群while15小时是最佳的PVC集群。在培养皿中的细胞产量低，是由于没有足?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.