Isolation des neurones sensoriels de<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Patch pour les enregistrements de serrage des courants glutamatergiques

Résumé

Nous décrivons la dissection du système nerveux du lièvre marin mer Aplysie Après anesthésie, l'isolement de neurones pour la culture des tissus court terme, et des enregistrements de courants ioniques de cellules isolées par la technique de patch-clamp.

Résumé

Le mollusque gastéropode marin Aplysia californica a une histoire vénérable comme un modèle de fonctionnement du système nerveux, avec une importance particulière dans les études sur l'apprentissage et la mémoire. Les préparations typiques de ces études sont ceux dans lesquels le sensoriel et motoneurones sont laissées intactes chez un animal très peu disséqué, ou une co-culture neuronale techniquement complexe d'sensorielle individuelle et motoneurones. Moins commun est la préparation neuronale isolée dans laquelle de petits groupes de neurones théoriquement homogènes sont dissociées en cellules isolées en culture à court terme. Ces cellules isolées sont utiles pour la caractérisation biophysique des courants ioniques en utilisant des techniques de patch-clamp, et la modulation ciblée de ces conductances. Un protocole pour la préparation de ces cultures est décrite. Le protocole met à profit les neurones sensoriels glutamatergique facilement identifiables des ganglions pleural et buccale, et décrit leur dissociation et un entretien minimal in culture pendant plusieurs jours sans sérum.

Introduction

Le mollusque opistobranch marin, l'aplysie, a été un modèle neurobiologique utile pour de nombreuses décennies. Il est surtout connu comme un modèle d'habituation et le conditionnement classique ^{7, 8.} Les études sur l'apprentissage et la mémoire dans ce modèle a remporté le prix Nobel de physiologie ou médecine en 2000 pour Eric R. Kandel, dans un prix qu'il a partagé avec Arvid Carlsson et Paul Greengard ^10. Les études portant sur ​​les enregistrements électriques de réduction des préparations, dans lequel les éléments du système nerveux de cet invertébré sont disséqués à partir de l'animal avec les nerfs et les muscles laissée en place, ont contribué à élucider le rôle des neurones individuels chez l'aplysie. Identification des mécanismes moléculaires précis qui constituent l'apprentissage chez l'aplysie cependant souvent utilisé une autre technique, à long terme des co-cultures d'un neurone sensoriel et un motoneurone, obtenu un par un à partir d'animaux de chaque donateur et a permis de former une synapse à la boîte de culture ²¹ .

Nous et d'autres ^{1, 3, 6, 14, 15, 16} ont exploité la facilité avec laquelle les neurones identifiés peuvent être ciblés dans ce modèle ainsi que leur endurance dans des expériences à long terme pour rendre les cultures à court terme dissociées de groupes de neurones théoriquement homogènes dans lequel nous étudions courants ioniques sous la bride de tension dans la configuration de patch-clamp. Beaucoup de neurones aplysie résistent à des cycles répétés de patch-clamp pour laisser le temps aux manipulations expérimentales de longue durée. La technique est utile pour les neurones, comme les cellules de sac neurosécrétoires du ganglion abdominal, et les neurones sensoriels des ganglions pleural et buccale dont dissociation que nous décrivons ici, mais pas pour les très grands neurones> 60 um de diamètre, comme L7 ou R2 le ganglion abdominal. Nous n'employons pas aplysie sérum dans nos cultures, à la différence des co-cultures sensori-motoneurones décrites ailleurs. La plupart des neurones obtenus en utilisant cette procédure seront sans processus de til 48 premières heures de culture, ce qui facilite l'enregistrement complet de la tension de la cellule, mais sera ensuite germer et élaborer des axones et d'autres processus pour environ 14 jours avant de mourir d'un manque de nutriments et / ou des facteurs de croissance.

Cette technique permet de produire des cultures primaires de neurones 50-100 par boîte de régions physiologiquement documentés des ganglions buccale et pleural. Ce protocole est utile pour les chercheurs qui étudient les aspects de la physiologie de la cellule unique dans les expériences qui nécessitent de nombreuses expérimental reproduit par animal. Il produit une paire assortie des cultures dues à la séparation anatomique des cellules cibles dans hemiganglia gauche et droite, permettant des études qui bénéficient d'un traitement adapté et les cultures témoins.

Le protocole vise buccales S cluster (BSC) des neurones du ganglion buccal et ventrocaudal (PVC) des neurones du ganglion pleural pleurale. Ces cellules sont d'une taille appropriée pour l'ensemble des enregistrements de tension cellulaires et ROBUS d'affichaget réponses glutamatergique. La méthodologie discuté est approprié pour la plupart des ganglions du système nerveux chez l'aplysie.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Le Jour 1, peser et anesthésier des animaux.
   1. Peser un g-1 kg animale 30. Anesthésier des volumes d'animaux 5-10 de 1:1 eau de mer: MgCl isotonique. 6H ₂ 0 pendant 1 h sous aération, comme une pompe à air d'aquarium électrique avec airstone joint.
2. Préparer les fournitures de dissection.
   1. Assembler le plateau de dissection propre avec des épingles droites en acier inoxydable, tels que des broches en tissu. Assembler plusieurs boîtes de Pétri contenant l'eau de mer artificielle (ASW; voir les tableaux 1 et 3) + pénicilline / streptomycine (P / S).
   2. Soyez prêt à un microscope de faible puissance. Disposer d'instruments de dissection propre prête, comme le nez nervuré et pinces chirurgicales fines, et de fin et de grands ciseaux chirurgicaux. Vaporiser les instruments avec 70% d'alcool isopropol avant utilisation et laisser sécher.
3. animaux de la position sur le plateau de dissection.
   1. Position animaux face ventrale vers le bas dans le bac de dissection. Pin animauxtravers des bords de la paroi du corps et les frontières parapodiale, mais il faut éviter la queue et la tête, pour exposer la surface dorsale et la gorge génitales
   2. Rincer la surface dorsale dans l'eau à exécution lente robinet d'eau froide. Appliquez un léger courant d'alcool à 70% isopropol d'une pissette le long de la rainure génitales et sur le dessus de la tête.
4. Faire l'incision initiale.
   1. En utilisant un microscope de faible puissance (voir tableau 2) et la lumière réfléchie pour observer l'endroit où la gorge génitale provient de la marge de coquille antérieure, maintenez tendue avec une pince à côtes-nez un pli de tissu à la gauche de cette origine, alors coupant une faible terrer tout au long de l', zone plane et lisse de la paroi du corps juste à droite de la gorge génitales avec des ciseaux coudés fines.
   2. Hémolymphe doit être observé pour verser du trou, parfois entraînant avec lui le ganglion abdominal et de l'estomac.
5. Développez l'incision.
   1. Utilisez de grands ciseaux pour étendre èmee incision en avant jusqu'à un point situé entre les rhinophores, tout en tirant vers le haut par la lame inférieure afin d'éviter d'entailler le tube digestif. Les organes internes seront observées à déborder hors de l'incision.
6. Retirer les noyaux.
   1. Repositionner le plateau et de recentrer le microscope sur la région de la tête.
   2. En utilisant des pinces et ciseaux propres fins, enlever les ganglions de la tête en coupant à un moment donné les nerfs qui forment les ganglions de la tête dans un anneau autour de l'œsophage pour enlever pleural-pédale et cérébrale ganglions tant que groupe.
   3. Retirez le ganglion buccal qui adhère à la face ventrale de l'œsophage.
   4. Retirez le ganglion abdominal en coupant les 4 grandes conjonctions nerveuses que d'émission de ce ganglion.
7. Isoler ganglions d'intérêt.
   1. Garniture ganglions de la tête en dehors, en laissant une longueur de connecteurs attachés à chaque ganglion d'intérêt qui est égale à au moins le diamètre du ganglion, ce qui va ralentir la digestion enzymatique sur-des cellules d'intérêt dans l'étape suivante.
   2. Mettez chaque ganglion cible par 2 rinçages de ASW + P / S, se déplaçant entre rinçages avec pinces propres.
   3. Si le ciblage des cellules PVC, laisser le droit hemiganglion pleural attachée au droit hemiganglion de la pédale, et même laisser le hemiganglion pleural gauche attachée à la hemiganglion de la pédale gauche.
   4. Jeter les ganglions non désirées et le reste de l'animal, selon la pratique de la recherche acceptée.
8. Enzymatique digérer les ganglions.
   1. Pour chaque ganglion, préparer 1 ml de solution d'enzymes consistant en 3,75 mg dispase, 1 mg de hyaluronidase et 0,3 g de la collagénase de type XI par ml de ASW + P / S dans un tube conique de polypropylène de 15 ml.
   2. Lieu rincé ganglions dans une solution d'enzyme et fixez le bouchon. Placer le tube sur le côté sur un agitateur rotatif (voir le tableau 2) à vitesse lente pour 13-5 h pendant la nuit à environ 23 ° C (température ambiante).
9. Préparer l'des boîtes de culture.
   1. Avant de microdissection (Jour 2), préparer poly-D-lysine (PDL) revêtus des boîtes de culture dans une hotte de culture de tissus. Ajouter 0,5 ml ~ PDL (0,2 mg / ml d'eau stérile) au centre d'une boîte de 35 mm à environ 25 min.
   2. Rincer PDL 3x avec de l'eau stérile. Laisser sécher. UV-stériliser les plaques.
10. Jour 2 Isoler les neurones.
    1. Remplissez le centre de 35 mm plats qui étaient PDL-couché et UV stérilisés avec environ 0,5 ml d'ASW + P / S pour créer un îlot de support dans le plat autrement sec. Ceci peut être effectué sur le banc, en dehors de la hotte de culture de tissus. Un plat doit être préparé pour chaque groupe de cellules provenant d'un hemiganglion.
    2. Soyez prêt à un diamètre plat de dissection 100 mm faite par Sylgard revêtement et le durcissement d'un mm surface de dissection profonde 5, équipé avec des épingles de dissection fines de plusieurs tailles pour être utilisés comme des épingles et des sondes (voir le tableau 3). Rincez ce plat avec 70% d'alcool isopropol, puis avec ASW + P / S, et enfin fill avec ASW + P / S.
11. Préparer microdissection des ganglions digéré.
    1. Verser la solution contenant l'enzyme la pleural pédale et buccale ganglions digéré dans le plat de dissection.
    2. Placez le plat sur la platine du microscope sur une surface noir sous une lumière réfléchie.
    3. Utilisation du tissu conjonctif joint, épingler chaque côté dorsal hemiganglion pleural pédale vers le haut. Les tissus seront doux et intolérant d'étirement.
12. Microdissect neurones PVC.
    1. Utilisation de deux paires de pinces fines propres, et tenant une tige de dissection fine dans une paire de pinces en tant que sonde, d'isoler les cellules à partir d'un PVC hemiganglion pleural. Enzyme de digestion aura enlevé ou brisé en dehors de la gaine de tissu conjonctif recouvrant la grappe de PVC, mais les cellules adhèrent les unes aux autres.
    2. Utilisez la sonde pour détacher ces cellules du conjonctif pédale pleural ^18, puis de laisser tomber la grappe de cellules au fond de la dissectionAntenne.
13. Transfert neurones à plat de la culture.
    1. Transférer le groupe de cellules à un mm boîte de culture préparé 35 en aspirant doucement le cluster dans la pointe d'un incendie poli jetable pipette Pasteur en verre légèrement, puis distribuer lentement dans l'île médias dans une boîte de culture, en prenant soin d'éviter d'introduire des bulles d'air dans la pipette. Répétez l'isolement de la grappe PVC de l'autre hemiganglion et le placer dans une boîte de culture distincte.
14. Microdissect et transférer neurones BSC.
    1. Pin sur la face ventrale du ganglion buccal vers le haut, avec un soin d'épargner les cellules d'intérêt. Répétez l'étape 1.12 avec les 2 groupes de cellules BSC du ganglion buccal ^10.
    2. Isolation des neurones PVC et BSC produira 4 boîtes de culture contenant des amas de neurones: 2 plats contenant des groupes BSC et 2 plats avec des grappes de PVC. Jeter le reste des ganglions et mettre de côté le plat 100 mm de dissection.
15. Dissociate les amas cellulaires.
    1. Placez une boîte de culture contenant des cellules sur la scène du microscope de faible puissance et retirez le couvercle.
    2. Dissocier le groupe PVC en tapotant doucement le bas de la boîte de culture à côté de l'amas de cellules avec une épingle de dissection très bien tenus avec des pinces. Flicking est de creuser la pointe de la broche dans la matière plastique du fond de la boîte comme pour essayer de creuser une tache de plastique. Lorsque friction avec le plastique libère le point de tige, une onde de percussion est produite par le média qui se brise le massif voisin de cellules.
    3. 5-10 films peuvent être nécessaires pour près de dissocier complètement les cellules, mais il est préférable de laisser de petits amas de cellules plutôt que de feuilleter trop peur que les cellules soient détruits par pure mécanique.
    4. Replacer le couvercle et répéter avec d'autres boîtes de culture.
16. Stockez des cultures cellulaires.
    1. Placez les boîtes de culture contenant des îles médias dans leurs centres avec des cellules dissociées enun grand conteneur qui permet la circulation d'air, tel qu'un x 25 mm ronde boîte de Pétri en matière plastique 150, et de placer ce plat dans un incubateur réglé à 17 ° C.
    2. Installation dans la chambre d'un récipient ouvert d'eau comme source d'humidité. Laisser reposer une nuit. Les cellules adhèrent à la couche de poly-D-lysine dans le centre du plat.
17. des boîtes de culture de crue.
    1. Au jour 3, inonder doucement les plats avec 2,5 ml d'ASW + P / S. Examiner, pour compter le nombre de cellules à l'aide d'un microscope de culture cellulaire inversée. Stocker dans le 17 ° C incubateur.

2. Électrophysiologie

La méthode est raccordement standard de serrage qui a été décrit dans de nombreux textes (par exemple Sakmann et Neher, 1995) ^16. Ce protocole va travailler sur les cellules ≤ 100 pF de capacité, ou des cellules <60 um de diamètre lors des journées 3 et 4 du protocole. Cellules sans processus sont optimales pour l'enregistrement. L'EXAMEN spéciale suivanteions s'appliquent:

1. Grandes cellules peuvent être logés avec le paramètre de configuration sur l'amplificateur 200B Axopatch mis à β = 0,1. Activation de très grandes quantités de courant peut provoquer des cellules d'échapper à la pince de tension. Solutions ASW substitué à la teneur en sel (par exemple une fraction du NaCl substitué avec imperméable chlorure de N-méthyl-D-glucamine) peut être utilisée pour réduire l'ensemble des amplitudes de courant de cellule.
2. Fibre remplis de pipettes de patch borosilicate tiré sur un extracteur pipette et remblayé à mi-chemin avec une solution intracellulaire (ICS) composé de 450 mM KCl et d'autres sels (voir tableau 1) sont adaptés, et doivent avoir une résistance d'environ 0,5-1 MOhms. Si l'isolement des courants ioniques spécifiques est souhaitée, par exemple Na ⁺ courants, en l'absence de courants K, K ⁺ dans cette solution peut être remplacé par d'autres ions tels que Cs ^+. Cl ^- remplacement des ICS avec un anion imperméants est également justifiée si un ICS plus naturelle est souhaitée^9.
3. Les cellules sont robustes> 1 hr-longs enregistrements possibles à la température ambiante. L'enregistrement est optimal aux jours 3 et 4 du protocole, ce qui correspond à 24-48 heures en culture. Après 48 heures il ya difficulté à former des joints de gigaohm, peut-être en raison de l'élaboration d'un glycocalyx sur la surface de la cellule, et les problèmes de blocage de l'espace causés par excroissance du processus. Les cellules sont cependant utile, pour les études de serrage non-patch, comme la toxicologie, qui peuvent être terminés dans <14 d.
4. ASW et d'autres solutions pour être distribuée à partir du dispositif de la solution d'alimentation par gravité, ainsi que la solution intracellulaire, doivent être filtrées à travers une seringue montée sur 0,2 um filtre Acrodisk (tableau 3) pour éliminer les fines particules qui interfèrent avec la formation du joint d'étanchéité gigaohm.
5. Désensibilisation lors de l'utilisation des agonistes tels que D-aspartate (D-Asp), donc ~ 1-2 min entre les applications d'agonistes est recommandée. En revanche, la potentialisation est souvent observé avec application répétée rapidecation d'agonistes tels que la L-glutamate (L-Glu).
6. courants activés agonistes tels que la L-Glu peuvent être étudiés en appliquant des agonistes de la pipette Picospritzer. Cette pipette est tiré le même que celui de la pipette de patch et contient agoniste à ASW. Lorsque l'extrémité de cette pipette est positionnée au-dessous du tuyau de décharge du dispositif de la solution d'alimentation par gravité, et à un angle de 45 ° à partir de la conduite d'écoulement de sortie (figure 2F), agoniste sera rapidement éliminé par lavage à partir de la cellule, et la désensibilisation sera minimisé. La pipette d'agoniste doit créer un angle de 90 ° ou plus par rapport à la pipette de patch.

Résultats

Les emplacements des neurones sensoriels dans les ganglions qui sont ciblés dans ce protocole, les neurones BSC et PVC sont présentés dans la figure 1. Les neurones BSC sont situés dans deux grappes ovales symétriques sur le côté ventral du ganglion buccal, la surface qui est opposé à la masse dans le ganglion vestibulaire intacte (figure 1A). Les neurones de PVC, forment des grappes en forme de V bilatéraux qui s'enroulent autour de la surface dorsale du ganglion pleural ...

Discussion

Les techniques décrites ici dissociation rendement des cultures de neurones sensoriels contenant 50-100 neurones isolés parsemés de petits nombres de cellules gliales et d'autres cellules non identifiés. Les étapes les plus critiques dans le protocole sont les temps les ganglions restent en solution enzymatique, et en tapotant, la dissociation des amas de cellules digérées pour briser la grappe en cellules individuelles. digestion par des enzymes (étape 1.8) doit être optimisée à la température disponibl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.