Isolamento dei neuroni sensoriali<em&gt; Aplysia californica</em&gt; Per Bloccare Registrazioni patch di correnti glutamatergico

Riepilogo

Descriviamo la dissezione del sistema nervoso della marina mare lepre Aplysia Dopo l'anestesia, l'isolamento dei neuroni per termine cultura dei tessuti di breve, e registrazioni di correnti di singolo ione delle cellule attraverso la tecnica del patch clamp.

Abstract

La marina Aplysia californica mollusco gasteropode ha una storia venerabile come un modello di funzione del sistema nervoso, con particolare rilievo negli studi di apprendimento e memoria. Le preparazioni tipiche per questo tipo di studi sono quelli in cui la sensoriali e motoneuroni sono lasciati intatti in un animale minimamente sezionato, o di un elaborato tecnico neuronale co-coltura di sensoriale individuale e motoneuroni. Meno comune è l'isolato preparazione neuronale in cui piccoli gruppi di neuroni nominalmente omogenee sono dissociate in singole cellule in coltura a breve termine. Tali cellule isolate sono utili per la caratterizzazione biofisica di correnti ioniche con tecniche di patch clamp, e modulazione mirato di questi conduttanze. Un protocollo per la preparazione di tali colture è descritto. Il protocollo sfrutta le facilmente identificabili neuroni sensoriali glutammatergiche dei gangli pleurico e buccale, e descrive la loro dissociazione e la manutenzione minima in coltura per diversi giorni senza siero.

Introduzione

Il mollusco opistobranch marino, Aplysia, è stato un modello neurobiologico utile per molti decenni. E 'meglio conosciuto come modello di assuefazione e di condizionamento classico ^{7, 8.} Gli studi sull'apprendimento e la memoria in questo modello ha vinto il premio Nobel per la fisiologia o la medicina nel 2000 per Eric R. Kandel, in un premio che divideva con Arvid Carlsson e Paul Greengard ^10. Gli studi che coinvolgono registrazioni elettriche da preparativi ridotti, in cui gli elementi del sistema nervoso di questo invertebrato sono sezionati dall'animale con nervi e muscoli che si trovino, hanno contribuito a chiarire i ruoli dei singoli neuroni in Aplysia. Identificazione dei meccanismi molecolari precisi che costituiscono l'apprendimento in Aplysia però, spesso utilizzato un'altra tecnica, a lungo termine co-colture di un neurone sensoriale e di un motoneurone, ottenuto uno per uno dai singoli animali donatori e ha permesso di formare una sinapsi nel piatto cultura ²¹ .

Noi e altri ^{1, 3, 6, 14, 15, 16,} abbiamo sfruttato la facilità con cui identificare i neuroni possono essere mirati in questo modello, così come la loro resistenza in esperimenti a lungo termine per rendere le culture a breve termine dissociate di gruppi di neuroni nominalmente omogenee in cui studiarne correnti ioniche sotto voltage clamp nella configurazione di patch clamp. Molti neuroni Aplysia resistono a ripetuti cicli di patch di bloccaggio per consentire il tempo per le manipolazioni sperimentali di lunga durata. La tecnica è utile per i neuroni, come le cellule del sacchetto neurosecretory del ganglio addominale, ei neuroni sensoriali dei gangli pleurico e buccali cui dissociazione descriviamo qui, ma non per molto grandi neuroni> 60 micron di diametro, come L7 o R2 di il ganglio addominale. Noi non utilizziamo Aplysia siero nelle nostre culture, a differenza dei sensori-motoneurone co-culture descritte altrove. La maggior parte dei neuroni ottenuti con questa procedura sono senza processi per tegli prima 48 ore di cultura, facilitando intera registrazione tensione di cella, ma poi germogliare e elaborare assoni e di altri processi per circa 14 giorni prima di morire per mancanza di nutrienti e / o fattori di crescita.

Questa tecnica produce colture primarie di neuroni per 50-100 piatto da regioni fisiologicamente documentate dei gangli buccale e della pleura. Questo protocollo è utile per i ricercatori che studiano gli aspetti della singola fisiologia cellulare in esperimenti che richiedono numerosi sperimentale repliche per animale. Si produce una coppia di culture dovute alla separazione anatomica delle cellule bersaglio in hemiganglia destra e sinistra, permettendo studi che beneficio dal trattamento accoppiati e colture di controllo.

Il protocollo mira buccali S a grappolo (BSC) neuroni del ganglio buccale e pleuriche ventrocaudal (PVC) neuroni del ganglio pleurico. Queste cellule sono in una dimensione appropriata per intere registrazioni di tensione delle cellule e ROBUS visualizzazionet risposte glutamatergiche. La metodologia discusso è appropriato per la maggior gangli del sistema nervoso Aplysia.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Il giorno 1, pesare e anestetizzare animali.
   1. Pesare 30 g-1 kg di animale. Anestetizzare in 5-10 volumi di animali di acqua di mare: 01:01 MgCl isotonica. 6H ₂ 0 per 1 ora con aerazione ad esempio una pompa di aria dell'acquario elettrica con airstone allegata.
2. Preparare forniture di dissezione.
   1. Assemblare vassoio dissezione pulita con perni diritti inox quali spine tessuto. Assemblare diverse piastre di Petri contenenti acqua di mare artificiale (ASW; vedi tabelle 1 e 3) + penicillina / streptomicina (P / S).
   2. Avere pronto un microscopio a bassa potenza. Avere gli strumenti di dissezione pulita pronta, come ad esempio il naso a coste e una pinza sottile chirurgici, e fine e grandi forbici chirurgiche. Spruzzare gli strumenti con il 70% di alcol isopropol prima dell'uso e lasciare asciugare.
3. Posizione animale sul vassoio dissezione.
   1. Posizione animale lato ventrale verso il basso nel vassoio dissezione. Animale Pinattraverso bordi della parete del corpo e confini parapodial, ma evitare la coda e la testa, per esporre la superficie dorsale e il solco genitale
   2. Sciacquare la superficie dorsale in acqua fredda con esecuzione lenta. Applicare un leggero flusso di 70% di alcol isopropol da una bottiglia di compressione lungo la scanalatura genitale e sopra la parte superiore della testa.
4. Fai l'incisione iniziale.
   1. Utilizzando un microscopio a bassa potenza (vedere Tabella 2) e riflessa per osservare il punto in cui la scanalatura genitale origina dal margine anteriore guscio, teso tenere con una pinza Poly-naso una piega di tessuto a sinistra di questa origine, mentre snipping un superficiale Hole il percorso attraverso il liscio, zona pianeggiante della parete del corpo appena a destra della scanalatura genitale con sottili forbici angolate.
   2. Emolinfa deve essere osservato per versare dal foro, talvolta portando con sé il ganglio addominale e stomaco.
5. Espandere l'incisione.
   1. Utilizzare forbici grandi per espandere °incisione e anteriormente ad un punto tra le rhinophores, mentre si tira verso l'alto con la lama inferiore per evitare intaccare l'intestino. Gli organi interni saranno osservate per fuoriuscire l'incisione.
6. Rimuovere i gangli.
   1. Riposizionare il vassoio e rimettere a fuoco il microscopio sulla regione della testa.
   2. Utilizzando pinze pulite e forbici sottili, togliere i gangli testa da troncare a un certo punto i nervi che costituiscono i gangli testa in un anello intorno all'esofago per rimuovere pleurico-pedale e cerebrale gangli come gruppo.
   3. Rimuovere il ganglio buccale che aderisce al lato ventrale dell'esofago.
   4. Rimuovere il ganglio addominale tagliando le 4 grandi connettivi nervosi che emettono da questo ganglio.
7. Isolare gangli di interesse.
   1. Tagliare testa gangli a parte, lasciando una lunghezza dei connettivi collegati a ciascun ganglio di interesse che è pari ad almeno il diametro del ganglio, questo ritarderà enzima sopra-digestionedelle cellule di interesse nella fase successiva.
   2. Mettere ogni ganglio obiettivo attraverso 2 risciacqui di ASW + P / S, muovendosi tra risciacqui con pinzette pulite.
   3. Se il targeting delle cellule del PVC, lasciare il giusto hemiganglion pleurico collegato al diritto hemiganglion pedale, e allo stesso modo lasciare il hemiganglion pleurico sinistro attaccato al pedale hemiganglion sinistra.
   4. Scartare gangli indesiderati e il resto dell'animale secondo la prassi di ricerca accettato.
8. Enzimaticamente digerire i gangli.
   1. Per ciascun ganglio, preparare 1 ml di soluzione enzimatica costituito 3,75 mg dispasi, 1 mg ialuronidasi e 0,3 g collagenasi tipo XI per ml di ASW + P / S in un tubo da 15 ml polipropilene.
   2. Luogo risciacquato gangli nella soluzione enzimatica e fissare il tappo. Posizionare il tubo su un lato su un agitatore rotante (vedi tabella 2) a bassa velocità per 13-5 ore durante la notte a circa 23 ° C (temperatura ambiente).
9. Preparare ilpiatti della cultura.
   1. Prima di microdissezione (Day 2), preparare poli-D-lisina (PDL) rivestite piatti della cultura in una cappa di coltura di tessuti. Aggiungere 0,5 ml ~ PDL (0,2 mg / ml di acqua sterile) al centro di un piatto 35 millimetri a ~ 25 min.
   2. Sciacquare PDL 3x con acqua sterile. Lasciare asciugare. UV-sterilizzare le piastre.
10. Giorno 2 Isolare i neuroni.
    1. Riempire il centro di 35 piatti mm che erano PDL-rivestito UV e sterilizzato con circa 0,5 ml di ASW + P / S per creare un'isola di supporto all'interno del piatto altrimenti asciutto. Questo può essere fatto in panchina, fuori della cappa coltura tissutale. Un piatto deve essere preparato per ogni gruppo di cellule provenienti da una hemiganglion.
    2. Avere pronto un diametro di 100 millimetri piatto dissezione fatta da Sylgard-rivestimento e guarire una mm superficie dissezione profonda 5, dotato di sottili perni dissezione di varie dimensioni da utilizzare come perni e sonde (cfr. tabella 3). Sciacquare questo piatto con il 70% di alcol isopropol, poi con ASW + P / S, e, infine, fill con ASW + P / S.
11. Preparare microdissezione dei gangli digerito.
    1. Versare la soluzione enzimatica contenente il pleurico-pedale e buccale gangli digerito nel piatto dissezione.
    2. Porre la capsula sul palco del microscopio contro una superficie nera sotto luce riflessa.
    3. Utilizzando il tessuto connettivo allegata, definire con precisione ogni pleurico-pedale hemiganglion lato dorsale alto. I tessuti saranno morbidi e intollerante di stretching.
12. Microdissect neuroni in PVC.
    1. Utilizzando due coppie di pinze sottili puliti, e in possesso di un perno di dissezione multa in un paio di pinze come sonda, isolare le cellule del PVC da un hemiganglion pleurico. Digestione enzimatica avrà rimosso o rotto a parte il tessuto connettivo che copre il cluster PVC, ma le cellule saranno aderire l'una all'altra.
    2. Usare la sonda di staccare queste cellule dal connettivo pedale-pleurica ^18, poi lasciare cadere il cluster cella al fondo della dissezionepiatto.
13. Trasferire i neuroni al piatto cultura.
    1. Trasferire il gruppo di cellule di un mm piatto preparato 35 cultura delicatamente succhiare il cluster nella punta di un po 'incendio lucidato pipetta Pasteur di vetro usa e getta, quindi l'erogazione lentamente nell'isola dei media in una capsula di Petri, facendo attenzione ad evitare l'introduzione di bolle d'aria nella pipetta. Ripetere l'estrazione del cluster PVC dell'altro hemiganglion e posto in una capsula di Petri separato.
14. Microdissect e trasferire i neuroni BSC.
    1. Piedinatura del ganglio buccale lato ventrale, con cura per risparmiare le cellule di interesse. Ripetere il passo 1.12 con le 2 BSC gruppi di cellule del ganglio buccale ^10.
    2. Isolamento di neuroni in PVC e BSC produrrà 4 capsule di Petri contenenti cluster di neuroni: 2 piatti contenenti cluster BSC e 2 piatti contenenti cluster PVC. Scartare il resto dei gangli e mettere da parte il piatto di 100 mm dissezione.
15. Dissociate i gruppi di cellule.
    1. Posizionare un piatto di coltura contenente cellule sul palco del microscopio a bassa potenza e rimuovere il coperchio.
    2. Dissociare il cluster PVC delicatamente sfogliando il fondo del piatto cultura adiacente al cluster cella con un perno dissezione multa tenutasi a pinza. Sfogliando è scavare la punta del perno nella plastica del fondo del piatto come se cercasse di scavare una macchia di plastica. Quando l'attrito con la plastica rilascia il punto di perno, un'onda percussione viene prodotta attraverso il mezzo che si rompe il vicino ammasso di cellule.
    3. 5-10 colpi di frusta possono essere necessari fino a quasi dissociare completamente le cellule, ma è meglio lasciare piccoli gruppi di cellule, piuttosto che a sfogliare troppo timore le cellule distrutte dalla pura meccanica.
    4. Rimontare il coperchio e ripetere con altri piatti della cultura.
16. Conservare le colture cellulari.
    1. Posizionare le piastre di coltura contenenti isole dei media nei loro centri di cellule dissociate inun grande contenitore che permette la circolazione dell'aria, come ad esempio una x 25 millimetri di plastica rotondo piatto 150 Petri, e collocare questo piatto in un incubatore a 17 ° C.
    2. Installare nella camera di una vaschetta aperta di acqua come fonte di umidità. Lasciar riposare durante la notte. Le cellule aderiscono al rivestimento poli-D-lisina nel centro del piatto.
17. Piatti della cultura diluvio.
    1. Il giorno 3, inondare delicatamente i piatti con 2,5 ml di ASW + P / S. Esaminare e contare le cellule utilizzando una cultura microscopio cellula invertito. Conservare nel 17 ° C incubatore.

2. Elettrofisiologia

Il metodo è di connessione standard di serraggio che è stato descritto in numerosi testi (es. Sakmann e Neher, 1995) ^16. Questo protocollo funziona su cellule ≤ 100 pF capacitanza, o cellule <60 micron di diametro nei giorni 3 e 4 del protocollo. Cellule senza processi sono ottimali per la registrazione. Il seguente considerat specialeapplicano gli ioni:

1. Celle più grandi possono essere sistemati con l'impostazione di configurazione dell'amplificatore 200B Axopatch impostato a β = 0,1. Attivazione di grandissime correnti può indurre le cellule a sfuggire voltage clamp. Soluzioni ASW sostituita contenuto di sale (per esempio una frazione del NaCl sostituito con impermeabile cloruro N-metil-D-glucammina) possono essere utilizzate per ridurre intera ampiezza della corrente della cella.
2. Fibre piene di pipette di patch borosilicato tirato su un estrattore pipetta e riempita a metà con soluzione intracellulare (ICS), composto da 450 mM KCl e altri sali (vedi Tabella 1) sono adatti, e devono avere la resistenza di circa 0,5-1 MOhm. Se è desiderato isolamento di correnti ioniche specifici, per esempio Na ⁺ correnti in assenza di correnti di K, K ⁺ in questa soluzione può essere sostituita con altri ioni come Cs ^+. Cl ^- sostituzione di ICS con un anione impermeant è anche giustificato se si desidera un ICS più naturale^9.
3. Le cellule sono robusti con> 1 hr-lunghe registrazioni possibili a temperatura ambiente. La registrazione è ottimale nei giorni 3 e 4 del protocollo, che corrispondono a 24-48 ore in cultura. Dopo 48 hr vi è difficoltà a formare guarnizioni gigaohm, forse a causa di elaborazione di un glicocalice sulla superficie cellulare, e problemi di spazio clamp causati dal processo escrescenza. Le cellule sono utili, tuttavia, per gli studi di clamp non di patch, come la tossicologia, che possono essere completati in <14 d.
4. ASW ed altre soluzioni di essere dispensato dal dispositivo soluzione alimentato a gravità, così come la soluzione intracellulare, devono essere filtrati con una siringa montata 0,2 micron filtro Acrodisk (Tabella 3) per eliminare le particelle fini che interferiscono con la formazione sigillo gigaohm.
5. Desensibilizzazione si verifica quando si utilizza agonisti come il D-aspartato (D-Asp), quindi ~ 1-2 minuti tra le applicazioni degli agonisti è raccomandato. Al contrario, il potenziamento è spesso osservato con una rapida applicazione ripetutazione di agonisti come L-glutammato (Glu-L).
6. Agonisti correnti attivati ​​come L-Glu possono essere studiate applicando agonisti con il picospritzer pipetta. Questa pipetta è tirato la stessa della pipetta di patch e contiene agonista in ASW. Quando la punta della pipetta questa è posizionato sotto il tubo di uscita del dispositivo soluzione alimentato a gravità, e con un angolo di 45 ° dal tubo di efflusso (Figura 2F), agonista verrà rapidamente lavato via dalla cella, e desensibilizzazione sarà minimizzata. La pipetta agonista dovrebbe creare un angolo di 90 ° o più rispetto alla pipetta di patch.

Risultati

Le posizioni dei neuroni sensoriali all'interno dei gangli che sono indirizzate in questo protocollo, i neuroni BSC e PVC sono mostrati in Figura 1. I neuroni BSC si trovano in 2 simmetriche grappoli ovale sul lato ventrale del ganglio buccale, la superficie che si affaccia dalla massa buccale nel ganglio intatto (Figura 1A). I neuroni formano PVC, cluster a forma di V bilaterali che avvolgono la superficie dorsale del ganglio pleurico verso l'asse centrale (Figura 1B).<...

Discussione

Le tecniche di dissociazione descritti qui resa culture di neuroni sensoriali contenenti 50-100 neuroni isolati intervallati da un piccolo numero di cellule gliali e di altre cellule non identificati. Le fasi più critiche del protocollo sono il momento i gangli rimangono in soluzione enzimatica, e sfogliando, la dissociazione dei gruppi di cellule digerite a spezzare il gruppo in singole cellule. Digestione enzimatica (passo 1.8) deve essere ottimizzato alla temperatura disponibile. A 23 ° C con agitazione lenta, 13 o...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.