תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Summary

תאי יונקים המבטאים את קלטת גן פליטת אור (החיידקים לוקס) לייצר אור באופן עצמאי. דינמיקת bioluminescent נובעת בעת החשיפה כימית הוכח כדי לשקף את השפעות הטיפול על גדילה וחילוף חומרים תאיים, מה שהופך את התאים האלה כלי זול, רציף, בזמן אמת רעילות הקרנה שיכול בקלות להיות מותאם לאוטומציה תפוקה גבוהה.

Abstract

תא המבוסס במבחני חוץ גופית יונקים כבר מועסק באופן נרחב כחלופות לניסויים בבעלי החיים למחקרי toxicological אבל היו מוגבל בשל העלויות הכספיות הגבוהות של זמן והכנת מדגם מקביל המתחייבות עקב הטבע ההרסני של שיטות הקרנה מבוססות לוציפראז גחלילית . סרטון זה מתאר את הניצול של תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent, אשר אינם דורש תוספת ההרסנית של מצע luciferin, כשיטת זולה וקלילה לניטור ההשפעות הרעילים של תרכובת של עניין. תאי יונקים ביציבות להביע פליטת אור חיידקים מלאה (luxCDABEfrp) קלטת גן אוטונומי לייצר אותות אופטיים שפסגות ב 490 ננומטר ללא תוספת של מצע יקר ואולי מפריע luciferin, עירור על ידי מקור אנרגיה חיצוני, או הרס של המדגם שהוא באופן מסורתי מבוצע במהלך הליך הדמיה אופטיים. עצמאות זו מגירוי חיצוני מציבה את נטל לשמירה על תגובת bioluminescent אך ורק בתא, כלומר את האות שנוצרה הוא זוהה רק במהלך חילוף חומרים פעילים. מאפיין זה הופך את קו התא מבטא-Lux מועמד מצוין לשימוש כbiosentinel כנגד השפעות רעילות בגלל שינויים בייצור bioluminescent מצביעים על השפעות שליליות על צמיחה וחילוף חומרים תאיים. כמו כן, האופי האוטונומי וחוסר הרס מדגם הנדרש מאפשר הדמיה חוזרת ונשנית של אותו המדגם בזמן אמת לאורך כל תקופת חשיפת toxicant ויכולים להתבצע על פני מספר רב של דגימות ציוד הדמיה קיים בשימוש באופן אוטומטי.

Introduction

בארה"ב, תרופות ומוצרים אחרים המיועדים למאכל אדם דורשים הערכה מקיפה לפני שהם מאושרים לשימוש על ידי הצרכנים מזון והתרופות אמריקניות. נטל הכספי לביצוע בדיקה זו מושם על ¹ מפתח, אשר מגביר באופן משמעותי את עלות פיתוח מתחם חדש ולכן מיתרגם התייקרות לצרכנים. אמנם באופן מסורתי הרבה יותר של הקרנה זו מנוצל נושאי בעלי חיים לפעול כשליחים למארחי אדם, זה הוכיח להיות נטל כספי גדול, עם הערכת 2.8 מליארד דולרים בילו מדי שנה על ADME / Tox (ספיחה, הפצה, חילוף חומרים, הפרשה, ורעילות ) הקרנה לבד ² וראיות מצטברות המצביעות על כך מודלים של בעלי חיים לא יכולים לחזות מהימן תגובות toxicological אדם ^3. לכן, בבדיקת תא מבוססת התרבות אנושית מבחנה צברה פופולריות בשני העשורים האחרונים בשלה נמוך יחסיתעלות, תפוקה גבוהה יותר, וייצוג טוב יותר של זמינות ביולוגית וטוקסיקולוגיה ⁴ אנושיים. שיטות הקרנה רעילות המבוססות על תרבות התא נוכחית להעסיק נקודות קצה שונות, כגון מדידת רמות ה-ATP, הקרנת הפעילות של אנזימים זמינים cytoplasmic endogenously, חיטוט היושרה של קרום התא, או מעקב אחר רמת הפעילות של המיטוכונדריה, כדי להעריך את הכדאיות סלולרית ^{5 , 6.} עם זאת, ללא קשר לנקודה הסיום שנבחר, שיטות אלו דורשות כל ההרס של המדגם לפני ניתן לקחת מדידות, ובכך לייצר נתונים רק בנקודת זמן אחת. כתוצאה מכך, מספר גדול של דגימות צריכים להיות מוכן ולטפל במקביל ללימודי קינטיקה toxicological בסיסיים, שוב מוסיפים לעלויות והעבודה הנדרשת לפיתוח מתחם החדש. לחלופין, באמצעות מבחני מופרשים לוציפראז כגון Gaussia ⁷ לוציפראז, Vargula לוציפראז ^8, וMetridia לוציפראז ⁹פותחו שמבטל את הצורך בתמוגה תא ודורש חלק מכלי התקשורת למדידת נקודת סיום, לעומת זאת, אלה עדיין מוגבלים לדגימה בנקודות זמן שנקבעו מראש, וגם דורש תוספת של מצעי אור הפעלה חיצוניים.

כדי להימנע מהפגיעה של הרס מדגם הנדרש, כמו גם לחסל את העלות של מצעים, קו תא אנושי תוכנן המבטא את פליטת אור מלא חיידקים (לוקס) קלטת גן (luxCDABEfrp) כדי לאפשר לניטור רציף של תאי חיים, כי הוא דומה להדמית תא החי המבוססת על ניאון צבע, אך ללא הליכי חקירת פוטון-הפעלה ומיקרוסקופים נוספים. קו תא זה מסוגל לייצר constitutively אות אופטי לגילוי מתמשך, ישיר ללא צורך בגירוי חיצוני, ובכך נמנע הרס של המדגם. מכאני, אות bioluminescent שנוצרה מהתאים אלה לגרוםS כאשר אנזים לוציפראז luxAB-בנוי מזרז החמצון של אלדהיד שומן ארוך שרשרת (מסונתז ונוצר מחדש על ידי שימוש במוצרי גן luxCDE מצעי אנדוגני) בנוכחות המופחת ריבופלאבין פוספט ₍₂ FMNH, שממוחזר מFMN על ידי גן FRP מוצר) וחמצן מולקולרי ^10. ביטוי של לוקס הקסטה בתא המארח ולכן מאפשר לאור להיות מיוצר ומזוהה ללא הרס הסלולר או תוספת מצע אקסוגני. בדומה לכך, האינטראקציה בין גנים ולוקס FMN זמין endogenously וcosubstrates O _2, והדרישה לשמירה על סביבה שיכול לתמוך בהמרה של FMN לFMNH _2, מבטיחה שאות bioluminescent כתוצאה מכך יכולה להיות מזוהות רק מהחיים , תאים פעילים מטבולית.

דרישות אלה בעבר נוצלו על מנת להוכיח כי לוקס-basפלט bioluminescent אד קורלציה חזק עם גודל אוכלוסיית הסלולר ¹¹ וכי חשיפת תרכובת רעילה פוגעת בייצור autobioluminescent אופנה מנה תגובה ^12. כאן אנו משתמשים בכליות מתאפיינות בעבר autobioluminescent עוברית אנושית (HEK293) שורת תא ¹¹ כדי להדגים את הקרנת טוקסיקולוגי האוטומטית של אנטיביוטיקה מהמשפחה ידועה bleomycin עם פעילות ה-DNA נזק כדוגמה מייצגת כדי לאמת את היישום של תאי יונקים autobioluminescent לבדיקות רעילות.

Protocol

1. הכנת תא

1. לשחזר בקבוקון של HEK293 תאי bioluminescent ממניות קפוא חנקן נוזלי ולגדל אותם במדיום השתנה Dulbecco של הנשר (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי, 0.01 חומצות אמינו חיוניות מ"מ, 1x האנטיביוטיקה antimycotic, ופירובט נתרן מ"מ 0.01 בT בקבוק תרבית רקמה ₇₅ על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
   הערה: בתקשורת והרכיבים משלימים תשתנינה בהתאם לקווים סלולריים, ולכן יש לבחור בהתאם.
2. רענן כל מדיום 2-3 ימים עד שמגיע ~ מפגש% 80.
   הערה: כמות התאים הנדרשים תהיה מבוססת על עיצוב ניסיוני. במידת צורך, ניתן להשיג יותר תאים על ידי subculturing.
3. קציר תאים לבדיקה.
   1. הסר את המדיום ולשטוף את התאים עם פוספט שנאגרו מלוח (PBS) על ידי בעדינות מתערבל את הבקבוק ולאחר מכן השלכת בילתה PBS.
   2. הוסף טריפסין ולדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות,או עד שהתאים יש מנותק מהבקבוק.
   3. לאסוף את התאים המנותקים בPBS ולהעביר אותם לתוך צינור צנטריפוגות נקי.
      הערה: אם שורות תאי nonadherent משמשות תאים נפרדים, על ידי צנטריפוגה ולשטוף פעם עם PBS.
4. לקבוע את ספירת התאים הכולל שימוש במערכת ספירת תאים אחרות או hemacytometer.
5. צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 במשך 5 דקות. בטל supernatant ו resuspend התאים במדיום טרי, prewarmed.
6. מספר שווה של תאי זרע לתוך בארות בודדות של צלחת רב גם אטומה. בדוגמה זו, צלחת 5 x 10 ⁵ תאים בנפח 1 מ"ל לבאר כל צלחת 24 גם שחורה. צלחת נפח שווה של מדיום בבארות בשלושה עותקים לפעול כביקורת שלילית.
   הערה: מספר התאים מצופה בכל טוב הוא גמיש ויכול להיות מותאם לניסויים בודדים. עבור כל שורת תאי bioluminescent, בניסוי לקבוע את הקשר בין מספר תאים וbiolumiפלט nescent, כמו גם את התא לגילוי מינימאלי לספור לפני כל בדיקות רעילות. כדי לעשות זאת, פליטת אור אמצעי על פני מגוון רחב של גודל אוכלוסייה (לדוגמה, 1 x ^3-01 אוקטובר x 10 ⁶ תאים) בתנאי הדמיה סטנדרטיים.
7. טיפול בתאים עם מתחם בדיקה (ים) כמפורט להלן.

2. תכשיר

1. הכן הכימי שנבדקו כפתרון מניות מרוכז. בדוגמה זו, יש להשתמש בפתרון מניות מ"ל של אנטיביוטיקה ממשפחת bleomycin 100 מ"ג /.
   הערה: כדי למזער את ההשפעות רעילות המבוססות על הרכב פוטנציאליות, במיוחד אם ממס אורגני משמש ככלי לתוספת כימית, מומלץ כי ריכוז מניית להיות לפחות 1,000 פעמים ריכוז שלאחר היישום הרצוי.
2. מוסיף את הציר הכימי המוכן ישירות אל התאים. בדוגמה זו, מינון האנטיביוטיקה של ריבית בריכוזים סופיים של 100, 200, 300, ו -400 מיקרוגרם / מ"ל ​​בתלתplicate בארות. השאר שלוש בארות של תאים שלא טופלו כקבוצת ביקורת.
   הערה: הריכוז הסופי של כימי היעד צריך להיות נבחר על בסיס מטרות ניסוי ספציפית. מגוון רחב של ריכוזים בדרך כלל נבחן להשיג ספקטרום מלא של ההשפעות הרעילות.

3. הדמיה וניתוח נתונים

1. מייד לאחר בנוסף כימי, למקם את הצלחת בחדר ההדמיה של המכשיר המתאים לרכישת תמונה ומדידת פליטת אור.
2. פליטת אור מדוד כל 15 דקות על פני תקופה הפועל 24 שעות באמצעות 10 דקות זמן אינטגרציה לכל קריאה.
   הערה: זמן האינטגרציה בשימוש בדוגמה זו הוא על בסיס לכל צלחת ויכול להיות מותאם למדידה על בסיס לכל היטב באמצעות luminometers אחר של בחירה. יכול גם להיות מותאם זמן האינטגרציה המבוסס על שורת תאי bioluminescent בחר. בגלל פליטת אור מופק עצמאי ללא הרס תא או כל גירוי חיצוני, לקרואניתן לקחת ממצאים בכל נקודת זמן רצויה למלא את מטרות ניסוי ספציפיות.
3. לכמת את עוצמת bioluminescent מכל באר על ידי זיהוי אזור של עניין באמצעות תוכנה תואמת. להציג את פלט האור או כמו השטף הכולל (פוטונים / שני) או קרינה הממוצעת (פוטונים / steridian שני / ² ס"מ /) של כל דגימה.

תוצאות

במחקר זה, את הדינמיקה של תאי autobioluminescent HEK293 נוטרו באופן רציף על פני תקופה הפועל 24 שעות בתגובה לחשיפה לאנטיביוטיקה (איור 1). את ההשפעות הרעילות של האנטיביוטיקה הזה, שהוא חבר של המשפחה הידועה bleomycin להרוג תאי חיים באמצעות קשירה ולביקוע DNA ^13, הודגמו באמצעות יר...

Discussion

שיטה זו מדגימה את שימוש בתאי יונקים אוטונומי bioluminescent כבassay הקרנת cytotoxicity המבחנה המאפשר לתאים חיים כדי להיות במעקב רציף לאורך החיים שלהם. פרוטוקול זה הוא גמיש וניתן לשינוי כדי להתאים לתנאי ניסוי ספציפיים כנדרש. לדוגמה, בניסוי שהוצג כאן מתאים למעקב אחר השפעות ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062