Sitotoksisite Sürekli ve gerçek zamanlı izlenmesi için özerk Bioluminescent Memeli Hücre

Özet

Bakteriyel biyolüminesans gen kasetinin ifade eden memeli hücreleri ( Lux) Özerk ışık üretirler. Kimyasal maruz kalma üzerine çıkan biyolüminesens dinamikleri bu hücrelerin kolayca yüksek verimli otomasyon için adapte edilebilir bir ucuz, sürekli, gerçek zamanlı toksisite tarama aracı yapma, hücresel büyüme ve metabolizma üzerindeki tedavi etkilerini yansıtacak şekilde gösterilmiştir.

Özet

Memeli hücre tabanlı in vitro deneyleri yaygın olarak toksikolojik çalışmalar için hayvanlar üzerinde test alternatif olarak istihdam edilmiştir ama nedeniyle ateşböceği lusiferaz-tabanlı tarama yöntemlerinin yıkıcı doğası zorunlu paralel numune hazırlama, yüksek para ve zaman maliyetleri nedeniyle sınırlı kalmıştır . Bu video ilgi çekici bir bileşik olan sitotoksik etkilerinin izlenmesi için bir ucuz ve kolay bir yöntem olarak, bir lusiferin substratının yıkıcı ilave gerektirmeyen Bağımsız biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını tarif etmektedir. Stabil bir şekilde tam bakteriyel biyolüminesans (luxCDABEfrp) geni ifade kaseti, memeli hücreleri bağımsız olarak bir optik sinyal üreten bir harici enerji kaynağı, ya da geleneksel bir numunenin tahrip edilmesi pahalı ve muhtemelen müdahale lusiferin substratının, uyarma ilavesi olmadan 490 nm pik optik görüntüleme işlemi sırasında yapılans. Dış stimülasyon gelen bu bağımsızlık çıkan sinyal sadece aktif metabolizma sırasında tespit, yani sadece hücre bioluminescent reaksiyon korumak için yük getirmektedir. Biyolüminesans üretiminde değişimler hücre büyümesi ve metabolizması üzerindeki olumsuz etkilerin bir göstergesi olduğundan, bu özellik, lux-eksprese eden hücre soyu sitotoksik etkilerine karşı biosentinel olarak kullanım için mükemmel bir aday yapar. Benzer bir şekilde, gerekli örnek imha özerk doğası ve eksikliği zehiri maruz kalma süresi boyunca gerçek zamanlı olarak aynı numune üzerinde tekrar görüntüleme izin verir ve otomatik bir şekilde mevcut görüntüleme ekipmanı kullanarak çoklu örnekler yardımıyla gerçekleştirilebilir.

Giriş

Onlar Gıda ve İlaç İdaresi tarafından tüketici kullanım için onaylanmıştır önce ABD'de, insan tüketimine yönelik ilaç ve diğer ürünleri kapsamlı bir değerlendirme gerektirir. Bu testinin yapılması için mali yük büyük ölçüde tüketiciler için artan maliyet yeni bileşik geliştirme ve bu nedenle çevirir maliyetini artırır geliştirici ^1, yerleştirilir. Bu tarama geleneksel olarak çok insan ana için temsilci olarak vekaleten Hayvanlar üzerinde kullanılan olsa da, bu (Tox / ADME adsorpsiyon, dağılım, metabolizma, boşaltım ve toksisite her yıl harcanan yaklaşık 2800000000 $ ile, büyük bir mali yük olduğu kanıtlanmıştır ) Tek başına tarama ² ve hayvan modellerinde güvenilir insan toksikolojik yanıtları ³ tahmin edemez düşündüren montaj kanıtlar. Bu nedenle, in vitro insan hücre kültürü tabanlı test nedeniyle nispeten daha düşük olan son yirmi yılda popülerlik kazanmıştırmaliyet, daha yüksek verim ve insan biyoyararlanım ve toksikoloji ⁴ daha iyi temsil. Mevcut hücre kültürü bazlı toksisite tarama yöntemleri hücre canlılığı ⁵ değerlendirmek için, hücresel membran bütünlüğünü sondalama veya mitokondriyal aktivite düzeyi izleme, endojen olarak mevcut sitoplazmik enzimlerin aktivitesinin taranması, örneğin ATP seviyelerinin ölçümü gibi, uç noktalar, istihdam ^{, 6.} Ölçümler ve böylece tek bir zaman noktasında veri üreten alınabilir önce Ancak, ne olursa olsun seçilen nokta dolayı, bu yöntemler her numunenin imha gerektirir. Sonuç olarak, çok sayıda numune hazırlanmış ve temel toksikolojik kinetik çalışmalar için paralel olarak tedavi, daha yeni bir bileşik geliştirilmesi için gerekli maliyet ve iş gücü ekleyerek olması gerekir. Alternatif olarak, bu tür tahliller kullanılarak Gaussia ⁷ lusiferaz, Vargula lusiferaz ⁸ ve ⁹ Metridia lusiferaz gibi lusiferaz salgılananhücre parçalama için olan ihtiyacı ortadan kaldırır ve son nokta ölçümü için, ortamın bir kısmını gerektirir, ancak, yine de bu önceden belirlenmiş zaman noktalarında, örnekleme ile sınırlıdır ve ayrıca dışsal ışık aktive edici yüzeyler ilavesi gerektiren geliştirilmiştir.

Örnek gerekli imha zararına yanı sıra substratlar maliyeti ortadan kaldırmak için önlemek için, bir insan hücre hattı benzer canlı hücreler sürekli olarak izlenmesi için izin vermek için tam bakteriyel biyolüminesans (lux) gen kasetinin (luxCDABEfrp) ifade eden tasarlandı floresan-boya tabanlı canlı hücre görüntüleme için, ancak ek foton-aktive edici ve mikroskobik inceleme prosedürler olmaksızın. Bu hücre hattı, böylece numunenin imha kaçınarak, yapısal olarak dış uyarılması için gerek olmaksızın sürekli, doğrudan saptanması için bir optik sinyal üretme yeteneğine sahiptir. Mekanik olarak, bu hücrelerden üretilen bioluminescent sinyal nedens luxAB şekillendirilmiş lusiferaz enzim indirgenmiş riboflavin fosfat varlığında (FRP geni tarafından FMN ikinci geri kazanılır FMNH _2, uzun zincirli bir yağ aldehid (endojen maddeleri kullanarak luxCDE gen ürünleri tarafından sentezlenen ve rejenere) oksidasyonunu katalize zaman ürün) ve moleküler oksijen ^10. Konakçı hücre içinde, lux kaset ekspresyonu bu nedenle üretilen ve hücre yıkımı veya eksogen bir substrat ilave edilmeden tespit edilmesi ışık sağlar. Benzer şekilde, lux genler ve endojen olarak mevcut FMN ve O ₂ cosubstrates ve FMNH ₂ FMN dönüşüm destekleyen bir ortamın bakım gereksinimi, arasındaki etkileşim, elde edilen biyolüminesans sinyali sadece oturma tespit edilebilir olmasını sağlar , metabolik olarak aktif hücrelerin.

Bu gereksinimler daha önce o lüks-bas göstermek için istismar edilmiştired bioluminescent çıktı hücresel nüfus büyüklüğü ¹¹ ve zehirli bileşik maruz kalma bir doz-yanıt moda ¹² autobioluminescent üretim bozar ile güçlü ilişkilidir. Burada toksisite testi için autobioluminescent memeli hücrelerinin uygulama doğrulamak için temsili bir örnek olarak bilinen DNA hasarına aktivitesi ile bleomisin ailesinin bir antibiyotik otomatik toksikolojik tarama göstermek için, daha önce karakterize edilen autobioluminescent insan embriyonik böbrek (HEK293) hücre hattı ¹¹ kullanır.

Protokol

1. Hücre Hazırlanması

1. Sıvı azot donmuş stok biyolüminesans HEK293 hücreleri bir şişe elde etmek ve Dulbecco'nun Modifiye Edilmiş Eagle% 10 cenin sığır serumu ile desteklenmiş ortamı (DMEM), 0.01 mM esansiyel olmayan amino asitler, 1 x antibiyotik antimikotik ve T, 0.01 mM sodyum piruvat onları büyümeye 37, ₇₅ doku kültürü şişesi ° C ve% 5 _CO2.
   Not: Medya ve ek parçaları hücre hatları göre değişir ve bu nedenle buna göre seçilmelidir.
2. Yenile orta her kapsamlı kadar 2-3 gün ~ 80% izdiham.
   Not: gerekli hücrelerin miktarı deneysel tasarım dayalı olacaktır. Gerekirse, daha fazla hücre alt kültüre ile elde edilebilir.
3. Testleri için hasat hücreleri.
   1. Orta kaldırmak ve fosfat hücreleri yıkayın şişeye yavaşça dönen ve daha sonra çıkarılır ve PBS ile peynir salin (PBS).
   2. 2 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe tripsin ve eklemeveya hücre kadar şişesi müstakil.
   3. PBS içinde müstakil hücreleri toplamak ve temiz bir santrifüj tüpü içine aktarabilirsiniz.
      Not: nonadherent hücre hatları santrifüj, ayrı hücrelere kullanılan ve PBS ile bir kez yıkayın varsa.
4. Hemasitometre ya da başka hücre sayımı sistemi kullanılarak toplam hücre sayısı belirlenir.
5. 5 dakika boyunca 300 x g'de hücre süspansiyonu santrifüj. Süpernatantı atın ve taze, önceden ısıtılmış orta hücreleri tekrar süspansiyon.
6. Opak bir çok-çukurlu plaka bireysel kuyular içine hücre çekirdeği eşit sayıda. Bu örnekte, plaka 5 x 10 siyah 24 oyuklu plakanın her kuyuya, 1 ml'lik bir hacimde ⁵ hücreleri. Plaka üç kopya halinde kuyularda ortamına ait eşit bir hacmi negatif kontrol olarak hareket eder.
   Not: her iyi kaplama hücrelerin sayısı esnek ve ayrı deneyler için optimize edilebilir. Her bioluminescent hücre hattı için, deneysel hücre sayısı ve biolumi arasındaki ilişkiyi belirlemeknescent çıkış yanı sıra, en az saptanabilir hücre önce herhangi bir toksisite testleri sayılır. Standart koşullar altında görüntüleme nüfusun boyutlarda geniş bir aralığı (örneğin, 1 x ^Ekim 3-1 x 10 hücre ⁶⁾ karşısında yer alan bu tedbir, biyolüminesans yapmak için.
7. Aşağıda tarif edildiği gibi test bileşik (ler) ile birlikte hücre tedavisi.

2. Kimyasal Hazırlama

1. Bir konsantre stok çözeltisi olarak test edilen kimyasal hazırlayın. Bu örnekte, bir 100 mg / bleomisin ailesinin bir antibiyotik ml stok çözeltisi kullanın.
   Not: organik bir çözücü kimyasal eklenmesi için bir araç olarak kullanıldığında, özellikle de potansiyel taşıyıcı bazlı toksik etkilerini minimuma indirmek için, stok konsantrasyonu, en az 1000 kat, istenen uygulama sonrası konsantrasyon olması önerilir.
2. Doğrudan hücrelere hazırlanan kimyasal stok ekleyin. Bu örnekte, doz nihai konsantrasyonları 100, 200, 300, ve tri 400 ug / ml 'de ilgi antibiyotikkuyu plicate. Tedavi edilmeyen kontrol olarak hücreler üç kuyu bırakın.
   Not: Hedef kimyasal nihai konsantrasyon spesifik deneysel hedeflerine göre seçilmelidir. Konsantrasyonları geniş bir aralık, normalde toksik etkilerin tam bir spektrum elde etmek için test edilir.

3. Görüntüleme ve Veri Analizi

1. Hemen kimyasal ilave edildikten sonra, görüntü elde etme ve biyolüminesans ölçümü için uygun enstrümanın görüntüleme odasında plaka yerleştirin.
2. Her okuma için bir 10 dakika entegrasyon zaman kullanarak 24 saatlik süre içinde önlem biyolüminesans her 15 dk.
   Not: Bu örnekte kullanılan entegrasyon zaman bir başına plaka bazında ve seçtiğiniz diğer luminometreyle kullanılarak her iyi bazında ölçümü için ayarlanabilir. Entegrasyon süresi seçilen bioluminescent hücre hattı dayalı da ayarlanabilir. Biyolüminesans hücre yıkımı ya da herhangi bir dış uyarı olmaksızın özerk üretilir çünkü okumakbulgular spesifik deney amaçları yerine getirmek için arzu edilen herhangi bir zaman noktasında alınabilir.
3. Uyumlu yazılım kullanarak ilgi bir bölge belirleyerek her kuyudan bioluminescent yoğunluğunu ölçmek. Ya toplam akı (fotonlar / saniye) veya her numunenin (fotonlar / cm / saniye ² / steridian) olarak ışık çıkışı görüntüleyin.

Sonuçlar

Bu çalışmada, autobioluminescent HEK293 hücreleri ve dinamikleri spektrumlu antibiyotik (Şekil 1) tepki olarak 24 saatlik bir süre boyunca sürekli olarak izlenmiştir. Bağlanabilen ve DNA ¹³ yarılması ile, canlı hücreleri öldürmek için bilinen bleomisinin ailesinin bir üyesi olan bu antibiyotik, toksik etkileri, Pseudocolor görüntü doğrudan görselleştirilebilir tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla, biyolüminesans üretiminde bir azalma ile ortaya konmuştur (Ş...

Tartışmalar

Bu yöntem, canlı hücreler sürekli olarak kullanım süresi boyunca takip edilmesine olanak in vitro sitotoksisite tarama deneyi, bir özerk olarak biyolüminesans memeli hücrelerinin kullanımını gösterir. Bu protokol, esnek ve gerektiğinde gibi belirli deney koşulları karşılamak için modifiye edilebilir. Örneğin, deney akut toksik etkilerini izleme için uygundur Burada yer ama art arda artan zaman aralıklarında (yani her 24 saat) görüntüleme ve arasında standart enküba...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062