Autonomamente bioluminescenti cellule di mammifero per la continua e monitoraggio in tempo reale di citotossicità

Riepilogo

Cellule di mammifero che esprimono la cassetta genica bioluminescenza batterica ( Lux) Produrre luce autonomamente. I conseguenti dinamiche bioluminescenti su di esposizione chimica è stata dimostrata in modo da riflettere gli effetti del trattamento sulla crescita cellulare e il metabolismo, rendendo queste cellule un poco costoso, continua, in tempo reale strumento di screening di tossicità che può essere facilmente adattato per l'automazione ad alta velocità.

Abstract

Cellule di mammifero, con sede in vitro sono stati ampiamente utilizzati come alternative alla sperimentazione animale per gli studi tossicologici, ma sono stati limitati a causa degli elevati costi monetari e di tempo di preparazione del campione parallelo che rese necessarie a causa della natura distruttiva di lucciola luciferasi metodi di screening basati su . Questo video descrive l'utilizzazione di cellule di mammifero autonomamente bioluminescenti, che non richiedono l'aggiunta distruttiva di un substrato luciferina, come un metodo economico e facile per monitorare gli effetti citotossici di un composto di interesse. Cellule di mammifero che esprimono stabilmente la bioluminescenza batterica totale (luxCDABEfrp) cassetta genica autonomamente producono un segnale ottico che picchi a 490 nm senza l'aggiunta di un substrato luciferina costoso e suscettibili d'interferire, eccitazione da una fonte di energia esterna, o la distruzione del campione che è tradizionalmente eseguito durante la procedura di imaging otticos. Questa indipendenza dalla stimolazione esterna pone l'onere per mantenere la reazione di bioluminescenza sulla sola cella, il che significa che il segnale risultante viene rilevato solo durante metabolismo attivo. Questa caratteristica rende la linea cellulare lux esprimono un ottimo candidato per l'uso come un biosentinel contro gli effetti citotossici in quanto i cambiamenti nella produzione bioluminescenti sono indicativi di effetti negativi sulla crescita cellulare e il metabolismo. Analogamente, la natura autonoma e la mancanza di distruzione campionamento richiesto permette ripetuta esposizione dello stesso campione in tempo reale durante il periodo di esposizione tossica e possono essere eseguite su più campioni utilizzando apparecchiatura di immagine esistente in modo automatico.

Introduzione

Negli Stati Uniti, i prodotti farmaceutici e di altri prodotti destinati al consumo umano richiedono una valutazione prima di essere approvati per l'uso del consumatore da parte della Food and Drug Administration. L'onere finanziario per l'esecuzione di questo test è posto sulla sviluppatore ^1, che aumenta sostanzialmente il costo di sviluppo nuovo composto e quindi si traduce in un aumento dei costi per i consumatori. Mentre tradizionalmente molto di questo screening è utilizzato soggetti animali di agire come proxy per ospiti umani, questo ha dimostrato di essere un grande onere finanziario, con una cifra stimata di 2,8 miliardi dollari spesi ogni anno in ADME / Tox (assorbimento, distribuzione, metabolismo, escrezione e tossicità ) lo screening solo ² e la crescente evidenza che suggerisce che i modelli animali non possono prevedere in modo affidabile le risposte tossicologici umani ^3. Pertanto, in fase di test delle cellule umane in vitro cultura basata ha guadagnato popolarità nel corso degli ultimi due decenni a causa della sua relativamente bassadei costi, maggiore produttività e una migliore rappresentazione della biodisponibilità umana e tossicologia ^4. Attuali metodi di screening coltura cellulare basati tossicità impiegano vari endpoint, come la misurazione dei livelli di ATP, screening l'attività di enzimi citoplasmatici disponibili endogenamente, sondando l'integrità della membrana cellulare, o di monitoraggio del livello di attività mitocondriale, per valutare la vitalità cellulare ^{5 , 6.} Tuttavia, indipendentemente l'endpoint prescelta, tutti questi metodi richiedono la distruzione del campione prima misurazioni possono essere prese, quindi solo produrre dati in un singolo punto di tempo. Di conseguenza, un gran numero di campioni devono essere preparati e trattati in parallelo per studi di base cinetica tossicologici, di nuovo aggiungendo al costo e la manodopera necessaria per nuovo sviluppo composto. In alternativa, saggi di luciferasi utilizzando secreti come Gaussia luciferasi ^7, Vargula luciferasi ^{8, 9} e Metridia luciferasiè stato sviluppato che eliminano la necessità di lisi cellulare e richiedono una frazione dei mezzi per la misura finale, tuttavia, questi vengono ancora limitata a campionamento in punti di tempo predeterminati e inoltre richiede l'aggiunta di substrati luce-attivanti esogeni.

Per evitare danno di distruzione campione requisito nonché per eliminare il costo di substrati, una linea cellulare umana è stato ingegnerizzato che esprime la piena bioluminescenza batterica (lux) cassetta genica (luxCDABEfrp) per permettere il monitoraggio continuo di cellule vive che è simile a fluorescenza-dye imaging cellulare dal vivo a base, ma senza le ulteriori procedure di indagine fotone-attivanti e microscopiche. Questa linea cellulare è in grado di produrre costitutivamente un segnale ottico per la continua, rilevamento diretto senza bisogno di stimolazione esterna, evitando così la distruzione del campione. Meccanicamente, il segnale bioluminescente generato da queste cellule risultas quando l'enzima luciferasi luxAB-formata catalizza l'ossidazione di un grasso a catena lunga aldeide (sintetizzato e rigenerata dai prodotti genici luxCDE utilizzano substrati endogeni) in presenza di una ridotta riboflavina fosfato (FMNH _2, che viene riciclata dalla FMN dal gene frp prodotto) e ossigeno molecolare ^10. Espressione del lux cassetta nella cellula ospite consente quindi leggera da produrre e accertata, senza distruzione cellulare o esogena aggiunta del substrato. Allo stesso modo, l'interazione tra i geni lux e la FMN disponibile endogena, e O ₂ cofermenti, e l'obbligo per il mantenimento di un ambiente in grado di supportare la conversione di FMN a FMNH _2, assicura che il segnale bioluminescente risultante può essere rilevata solo da vivere , cellule metabolicamente attive.

Questi requisiti sono stati precedentemente sfruttato per dimostrare che lux-based uscita bioluminescente è strettamente correlato con le dimensioni della popolazione cellulare ¹¹ e che l'esposizione composto tossico compromette produzione autobioluminescent in modo dose-risposta ^12. Qui usiamo un autobioluminescent rene embrionale umano precedentemente caratterizzato (HEK293) linea cellulare ¹¹ per dimostrare lo screening tossicologico automatizzata di un antibiotico della famiglia bleomicina con nota DNA attività dannosa come un esempio rappresentativo per convalidare l'applicazione di cellule di mammiferi autobioluminescent per test di tossicità.

Protocollo

1. Preparazione delle cellule

1. Recuperare una fiala di bioluminescenti HEK293 cellule dal liquido azoto magazzino congelati e li crescere in mezzo di coltura di Dulbecco modificato (DMEM) supplementato con 10% di siero fetale bovino, 0,01 mM aminoacidi non essenziali, 1x antibiotico-antimicotico, e 0,01 mM sodio piruvato in una T pallone di coltura tissutale a 37 ₇₅ ° C e 5% di CO _2.
   Nota: I mezzi di comunicazione e dei componenti supplementari variano in base a linee cellulari e quindi dovrebbero essere scelti di conseguenza.
2. Refresh media ogni 2-3 giorni fino a raggiungere ~ 80% di confluenza.
   Nota: La quantità di cellule necessario sarà basato sul disegno sperimentale. Se necessario, più celle possono essere ottenuti con subcoltura.
3. Celle di raccolta per il test.
   1. Rimuovere il supporto e lavare le cellule con tampone fosfato (PBS), ruotando delicatamente il pallone e poi scartando l'speso PBS.
   2. Aggiungere tripsina e incubare a 37 ° C per 2 min,o fino a quando le cellule si sono staccati dal pallone.
   3. Raccogliere le cellule distaccate in PBS e trasferirli in una provetta pulita.
      Nota: se le linee di cellule non aderenti sono usate, celle separate per centrifugazione e lavare una volta con PBS.
4. Determinare il numero totale delle cellule utilizzando un emocitometro o altro sistema di conteggio delle cellule.
5. Centrifugare la sospensione cellulare a 300 xg per 5 min. Eliminare il supernatante e risospendere le cellule in terreno fresco, preriscaldata.
6. Seed ugual numero di celle in singoli pozzetti di una piastra multi-bene opaca. In questo esempio, la piastra 5 x 10 ⁵ cellule in un volume di 1 ml in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti nero. Piastra di un uguale volume di medie pozzetti in triplicato di agire come controllo negativo.
   Nota: Il numero di cellule piastrate in ciascun pozzetto è flessibile e può essere ottimizzata per esperimenti singoli. Per ciascuna linea cellulare bioluminescente, sperimentalmente determinare il rapporto tra numero di cellule e bioluminescent uscita, così come la cellula minima rilevabile contano prima di eventuali prove di tossicità. Per fare questo, misura bioluminescenza in una vasta gamma di dimensioni della popolazione (per esempio, 1 x ^3-01 Ottobre x 10 ⁶ cellule) in condizioni standardizzate di imaging.
7. Trattamento di cellule con il composto di test (s) come descritto di seguito.

2. Preparazione chimica

1. Preparare la sostanza chimica in fase di test da una soluzione madre concentrata. In questo esempio, utilizzare un 100 mg / ml soluzione madre di un antibiotico della famiglia bleomicina.
   Nota: Per minimizzare potenziali effetti tossici veicolo basati, specialmente se un solvente organico viene usato come veicolo per addizione chimica, si raccomanda che la concentrazione magazzino sia almeno 1000 volte la concentrazione post-applicazione desiderata.
2. Aggiungere il brodo chimico preparato direttamente alle cellule. In questo esempio, la dose di antibiotico di interesse a concentrazioni finali di 100, 200, 300 e 400 mcg / ml in triplicate pozzi. Lasciare tre pozzi di cellule non trattate come controlli.
   Nota: La concentrazione finale della sostanza chimica di destinazione deve essere scelto sulla base di obiettivi sperimentali specifici. Una vasta gamma di concentrazioni è normalmente testato per ottenere uno spettro di effetti tossici.

3. Imaging e analisi dei dati

1. Subito dopo aggiunta chimica, pone la placca nella camera di imaging di strumento appropriato per l'acquisizione delle immagini e la misurazione bioluminescenza.
2. Bioluminescenza misura ogni 15 min per un periodo hr 24 utilizzando un tempo di integrazione 10 min per ogni lettura.
   Nota: Il tempo di integrazione utilizzato in questo esempio è su una base per-piastra e può essere regolato per la misura su una base per-pozzetto usando altri luminometri di scelta. Il tempo di integrazione può essere regolata in base alla linea cellulare bioluminescente scelto. Perché bioluminescenza è prodotto autonomamente senza distruzione cellulare o qualsiasi stimolo esterno, leggereIngs possono essere prese in qualsiasi punto temporale desiderato per soddisfare gli obiettivi sperimentali specifici.
3. Quantificare l'intensità bioluminescente da ogni pozzetto identificando una regione di interesse utilizzando software compatibile. Visualizzare l'emissione di luce sia come flusso totale (fotoni / secondo) o la radianza media (fotoni / secondo / cm ² / steridian) di ciascun campione.

Risultati

In questo studio, la dinamica di autobioluminescent HEK293 sono state monitorate continuamente per un periodo di 24 ore in risposta all'esposizione antibiotico (Figura 1). Gli effetti tossici di questo antibiotico, che è un membro della famiglia bleomicina conosciuti per uccidere cellule viventi legandosi al DNA e aderire ^13, sono stati dimostrati attraverso una diminuzione della produzione bioluminescente rispetto alle cellule non trattate, che può essere direttamente visualizzati attr...

Discussione

Questo metodo viene illustrato l'utilizzo di cellule di mammifero in autonomia bioluminescenti come dosaggio di screening citotossicità in vitro che permette alle cellule Live per essere monitorati continuamente durante la loro vita. Questo protocollo è flessibile e può essere modificato per accomodare condizioni sperimentali specifiche come richiesto. Per esempio, l'esperimento qui presentato è adatto per l'inseguimento effetti tossici acuti, ma può essere adattato per valutare gli ef...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062