Cellules de mammifères autonome bioluminescentes pour la surveillance continue et en temps réel de la cytotoxicité

Résumé

Les cellules de mammifères exprimant la cassette du gène de bioluminescence bactérienne ( Lux) Produire de la lumière de manière autonome. La dynamique bioluminescentes résultant lors de l'exposition chimique a été démontrée pour tenir compte des effets du traitement sur la croissance cellulaire et le métabolisme, ce qui rend ces cellules un, outil peu coûteux en temps réel continue dépistage toxicité qui peut être facilement adaptée pour l'automatisation à haut débit.

Résumé

Basés sur les cellules de mammifères dans des essais in vitro ont été largement utilisés comme alternatives à l'expérimentation animale pour les études toxicologiques mais ont été limités en raison des coûts financiers et temporels élevés de la préparation d'échantillons en parallèle qui sont rendues nécessaires en raison de la nature destructrice des méthodes de dépistage luciférase à base de luciole . Cette vidéo décrit l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes, qui ne nécessite pas l'ajout destructrice d'un substrat luciférine, comme une méthode peu coûteuse et facile de surveiller les effets cytotoxiques d'un composé d'intérêt. Cellules de mammifère exprimant de manière stable la bioluminescence bactérienne plein (luxCDABEfrp) de la cassette du gène de produire de manière autonome un signal optique que des pics à 490 nm, sans l'addition d'un substrat de luciférine coûteux et susceptibles d'interférer, l'excitation par une source d'énergie externe, ou la destruction de l'échantillon qui est traditionnellement effectué au cours de la procédure d'imagerie optiques. Cette indépendance de la stimulation extérieure place la charge pour maintenir la réaction de bioluminescence uniquement de la cellule, ce qui signifie que le signal qui en résulte est détectée seulement au cours du métabolisme actif. Cette caractéristique rend la lignée cellulaire lux exprimant un excellent candidat pour une utilisation comme biosentinel contre les effets cytotoxiques parce que les changements dans la production de bioluminescence sont révélateurs d'effets négatifs sur la croissance cellulaire et du métabolisme. De même, le caractère autonome et le manque de destruction de l'échantillon requis permet l'imagerie répétée du même échantillon en temps réel tout au long de la période d'exposition aux substances toxiques et peuvent être effectuées sur plusieurs échantillons en utilisant l'équipement d'imagerie existant de manière automatisée.

Introduction

Aux États-Unis, les produits pharmaceutiques et autres produits destinés à la consommation humaine nécessitent une évaluation approfondie avant qu'ils soient approuvés pour utilisation par les consommateurs par la Food and Drug Administration. Le fardeau financier pour réaliser ce test est placé sur le développeur ^1, ce qui augmente considérablement le coût de développement de nouveaux composés et donc se traduit par une augmentation des coûts pour les consommateurs. Alors que traditionnellement une grande partie de ce dépistage a utilisé des sujets animaux pour agir comme mandataires pour des hôtes humains, ce qui s'est avéré être un grand fardeau financier, avec un montant estimé à 2,8 milliards de dollars dépensés chaque année sur ADME / Tox (adsorption, distribution, métabolisme, excrétion et toxicité ) le dépistage seul ² et preuves croissantes suggérant que les modèles animaux ne peuvent pas prédire de façon fiable les réponses toxicologiques humains ^3. Par conséquent, dans les tests de cellules humaines in vitro basée sur la culture a gagné en popularité au cours des deux dernières décennies en raison de sa relativement faiblecoût, un débit plus élevé et une meilleure représentation de la biodisponibilité de l'homme et de la toxicologie ^4. Méthodes de dépistage de toxicité culture à base de cellules actuelles emploient divers paramètres, tels que la mesure des niveaux d'ATP, le dépistage de l'activité des enzymes cytoplasmiques endogène disponibles, pour sonder l'intégrité de la membrane cellulaire, ou suivre le niveau de l'activité mitochondriale, pour évaluer la viabilité cellulaire ^{5 , 6.} Cependant, quel que soit le critère choisi, ces méthodes nécessitent tous la destruction de l'échantillon avant que les mesures peuvent être prises, ainsi que la production de données à un seul moment. En conséquence, un grand nombre d'échantillons doivent être préparés et traités en parallèle des études de base de la cinétique toxicologiques, ajoutant encore du coût et de la main-d'œuvre nécessaire pour le développement de nouveaux composés. Alternativement, des tests utilisant sécrétées luciférase comme Gaussia luciférase ^7, Vargula luciférase ⁸ et ⁹ Metridia luciféraseont été développés qui éliminent la nécessité de lyse cellulaire et nécessitent une fraction des médias pour la mesure du point de terminaison, cependant, ceux-ci sont encore limitées à l'échantillonnage à des moments prédéterminés et nécessite également l'ajout de substrats exogènes lumière d'activation.

Pour éviter, au détriment de la destruction de l'échantillon requise ainsi que d'éliminer le coût de substrats, d'une lignée cellulaire humaine a été conçu, qui exprime la bioluminescence bactérienne plein (lux) de la cassette de gène (luxCDABEfrp) pour permettre un suivi continu de cellules vivantes qui est semblable à l'imagerie des cellules vivantes fluorescente à base de colorant, mais sans que les procédures d'enquête photon d'activation et microscopiques supplémentaires. Cette lignée cellulaire est capable de produire de façon constitutive d'un signal optique pour la détection directe en continu sans avoir besoin de stimulation externe, évitant ainsi la destruction de l'échantillon. Mécaniquement, le signal de bioluminescence produite à partir de ces cellules résultes lorsque l'enzyme luciférase luxAB formé catalyse l'oxydation d'un aldéhyde gras à longue chaîne (synthétisé et régénérée par les produits des gènes luxCDE utilisant des substrats endogènes) en présence d'une réduction de phosphate de riboflavine _(FMNH2, qui est recyclé à partir de FMN par le gène FRP produit) et de l'oxygène moléculaire ^10. L'expression de la cassette lux dans la cellule-hôte permet donc de la lumière à être produit et détecté sans destruction cellulaire ou une addition de substrat exogène. De même, l'interaction entre les gènes lux et la FMN disponible endogène, et O ₂ co-substrats, et l'exigence de maintien d'un environnement qui peut soutenir la conversion des FMN à _FMNH2, assure que le signal de bioluminescence qui en résulte ne peut être détectée de vivre , les cellules métaboliquement actives.

Ces exigences ont déjà été exploités pour démontrer que lux-Based sortie bioluminescence est fortement corrélée avec la taille de la population cellulaire ¹¹ et que l'exposition au composé toxique altère production autobioluminescent de façon dose-réponse ^12. Ici, nous utilisons un rein embryonnaire humain autobioluminescent précédemment caractérisé (HEK293) de ligne de la cellule ¹¹ de démontrer le dépistage toxicologique automatisé d'un antibiotique de la famille de la bléomycine avec activité endommageant l'ADN connu comme un exemple représentatif pour valider la demande de cellules de mammifères autobioluminescent pour les tests de toxicité.

Protocole

1. Préparation des cellules

1. Récupérez un flacon de cellules bioluminescentes HEK293 de l'azote stock congelé liquide et les cultiver dans un milieu de Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de veau foetal, 0,01 mm acides aminés non essentiels, 1x antibiotiques antimycosiques et 0,01 mM pyruvate de sodium dans un T ₇₅ flacon de culture tissulaire à 37 ° C et 5% de CO _2.
   Remarque: Les médias et les composants supplémentaires varient en fonction de lignées cellulaires et doivent donc être choisis en conséquence.
2. Actualiser moyenne tous les 2-3 jours jusqu'à atteindre ~ 80% de confluence.
   Note: La quantité de cellules nécessaires sera basé sur la conception expérimentale. Si nécessaire, d'autres cellules peuvent être obtenues par repiquage.
3. Récolte des cellules pour les tests.
   1. Retirez le support et laver les cellules avec du phosphate salin (PBS) tamponné en remuant doucement le ballon et ensuite jeter le passé PBS.
   2. Ajouter la trypsine et incuber à 37 ° C pendant 2 min,ou jusqu'à ce que les cellules sont détachées de la fiole.
   3. Recueillir les cellules individuelles dans PBS et les transférer dans un tube à centrifuger propre.
      Remarque: Si les lignées cellulaires non adhérentes sont utilisés, des cellules séparées par centrifugation et les laver une fois avec PBS.
4. Déterminer le nombre total de cellules en utilisant un hématimètre ou tout autre système de comptage cellulaire.
5. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 g pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans l'eau douce, moyen préchauffé.
6. un nombre égal de graines de cellules dans des puits individuels d'une plaque multi-puits opaque. Dans cet exemple, la plaque 5 x 10 ⁵ cellules dans un volume de 1 ml dans chaque puits d'une plaque de 24 puits noir. Plate un volume égal de milieu dans les puits en triple pour agir comme contrôle négatif.
   Note: Le nombre de cellules étalées dans chaque puits est flexible et peut être optimisée pour des expériences individuelles. Pour chaque ligne de cellules de bioluminescence, de déterminer expérimentalement la relation entre le nombre de cellules et biolumiNESCent sortie, ainsi que la cellule minimale détectable comptent avant tout test de toxicité. Pour ce faire, mesurer la bioluminescence à travers un large éventail de tailles de population (par exemple, 1 x 10 ³ à 1 x 10 ⁶ cellules) dans des conditions d'imagerie standardisés.
7. Traiter les cellules avec un composé de test (s) tel que décrit ci-dessous.

2. Préparation chimique

1. Préparer la substance chimique testée comme une solution stock concentrée. Dans cet exemple, utiliser un 100 mg / ml de solution mère d'un antibiotique de la famille de la bléomycine.
   Note: Afin de minimiser les effets toxiques potentiels basés véhicule, surtout si un solvant organique est utilisé comme un véhicule pour l'addition de produits chimiques, il est recommandé que la concentration de l'action soit au moins 1000 fois la concentration post-application souhaitée.
2. Ajouter le bouillon chimique préparé directement dans les cellules. Dans cet exemple, la dose de l'antibiotique d'intérêt à des concentrations finales de 100, 200, 300 et 400 pg / ml dans triplicate puits. Laisser trois puits de cellules non traitées comme témoins.
   Note: La concentration finale de la substance chimique cible doit être choisi en fonction des objectifs expérimentaux spécifiques. Une large gamme de concentrations est normalement testé pour obtenir un éventail complet des effets toxiques.

3. Imagerie et analyse des données

1. Immédiatement après l'addition de produits chimiques, de placer la plaque dans la chambre de formation d'image de l 'instrument approprié pour l'acquisition d'images et la mesure de la bioluminescence.
2. bioluminescence de mesure toutes les 15 minutes sur une période de 24 heures avec un temps d'intégration de 10 min pour chaque lecture.
   Note: Le temps d'intégration utilisé dans cet exemple est une base par plaque et peut être réglé pour la mesure sur une base par puits en utilisant d'autres luminomètres de choix. Le temps d'intégration peut également être ajustée en fonction de la lignée cellulaire bioluminescente choisie. Parce que la bioluminescence est produite de manière autonome, sans destruction cellulaire ou toute stimulation externe, lisezréunions peuvent être prises à tout point dans le temps désiré pour atteindre les objectifs expérimentaux spécifiques.
3. Quantifier l'intensité de bioluminescence à partir de chaque puits par identification d'une région d'intérêt en utilisant un logiciel compatible. Afficher la sortie de lumière soit en tant que le flux total (photons / seconde), soit la luminance moyenne (photons / seconde / cm ² / steridian) de chaque échantillon.

Résultats

Dans cette étude, la dynamique des cellules autobioluminescent HEK293 ont été surveillés en continu sur une période de 24 heures en réponse à l'exposition aux antibiotiques (Figure 1). Les effets toxiques de cet antibiotique, qui est un membre de la famille de la bléomycine connus pour tuer les cellules vivantes en se liant à et cliver l'ADN ^13, ont été démontrés par l'intermédiaire d'une diminution de la production de bioluminescence par rapport aux cellules non...

Discussion

Cette méthode illustre l'utilisation de cellules de mammifères autonome bioluminescentes comme un test de dépistage de la cytotoxicité in vitro qui permet aux cellules vivantes à être surveillés en permanence au cours de leur vie. Ce protocole est flexible et peut être modifié pour tenir compte des conditions expérimentales spécifiques selon les besoins. Par exemple, l'expérience présentée ici est approprié pour le suivi des effets toxiques aigus, mais peut être adapté pour év...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062