Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Резюме

Млекопитающих, клетки, экспрессирующие кассеты бактериальный ген биолюминесценции ( Lux) Дает свет автономно. Полученное биолюминесцентного динамики при химическом воздействии были продемонстрированы с учетом эффектов лечения на клеточный рост и обмен веществ, что делает эти клетки недорогой, непрерывно, в режиме реального времени токсичность скрининг инструмент, который может быть легко адаптирован для высокой пропускной автоматизации.

Аннотация

Млекопитающих клеточной основанный в анализах пробирке были широко использованы в качестве альтернативы тестированию на животных для токсикологических исследований, но были ограничены из-за высоких затратах времени и денег параллельных пробоподготовки, которые необходимым из-за деструктивный характер люциферазы светлячка основе методы скрининга . Это видео описывает использование автономно биолюминесцентного клетки млекопитающих, которые не требуют разрушительной добавлением субстрата люциферин, как недорогой и легкий способ мониторинга цитотоксические эффекты соединение, представляющее интерес. Клетки млекопитающих, стабильно экспрессирующих полный бактериальный биолюминесценции (luxCDABEfrp) генной кассеты, автономно производить оптический сигнал, что пики при 490 нм без добавления дорогих и, возможно мешающего люциферин подложки, возбуждение от внешнего источника энергии или разрушение образца, который традиционно выполняется во время процедуры оптических изображенийс. Эта независимость от внешней стимуляции возлагает для поддержания биолюминесцентного реакции только на клетки, а это означает, что результирующий сигнал обнаруживается только во время активного метаболизма. Эта характеристика делает люкс-клеточной линии, экспрессирующей превосходным кандидатом для использования в качестве biosentinel против цитотоксических эффектов из-за изменений в биолюминесцентного производства свидетельствуют о неблагоприятное воздействие на клеточный рост и метаболизм. Кроме того, автономный характер и отсутствие необходимых разрушения образца позволяет повторять изображений одного и того же образца в режиме реального времени на протяжении всего периода воздействия токсических веществ и может быть выполнена в нескольких образцах с использованием существующего оборудования изображений в автоматическом режиме.

Введение

В США, фармацевтических препаратов и других продуктов, предназначенных для потребления человеком, требуют обширных оценки до их утверждения для использования потребителем по контролю за продуктами и лекарствами. Финансовое бремя для выполнения этого тестирования находится на ¹ разработчика, что существенно увеличивает стоимость разработки новых соединений и, следовательно, приводит к увеличению стоимости для потребителей. Хотя традиционно большая часть этого скрининга использовали животных, когда их действовать в качестве прокси для человека хозяев, это оказалась большая финансовая нагрузка, по оценкам, 2,8 миллиарда долларов ежегодно тратятся на ADME / Токе (адсорбция, распределение, метаболизм, экскреция и токсичность ) скрининг Alone ² и монтаж доказательств того, что животные модели не могут достоверно предсказать человека токсикологических ответов ^3. Таким образом, в пробирке клетки человека культуры на основе тестирования приобрел популярность в течение последних двух десятилетий из-за его относительно низкуюстоимость, более высокую пропускную способность, и лучшего представления человека биодоступность и токсикологии ^4. Текущий клеточной культуре методов, основанных на токсичность скрининга используют различные конечные точки, такие, как измерение уровней АТФ, скрининг активности эндогенной доступны цитоплазматические ферменты, зондирование целостность клеточной мембраны, или отслеживание уровня активности митохондрий для оценки жизнеспособности клеток ^{пять , 6.} Однако, независимо от конечной точки выбраны, эти методы требуют разрушения образца до измерения могут быть приняты, при этом производит только данные в одной точке времени. В результате большое количество образцов должны быть подготовлены и обрабатывают параллельно для основных токсикологических исследований кинетики, опять же к увеличению стоимости труда и необходимых для развития нового соединения. Кроме того, анализов с помощью секретируемых люциферазы, такие как Gaussia люциферазы ^7, Vargula люциферазы ⁸ и ⁹ Метридиумы люциферазыБыли разработаны, что устраняет необходимость лизиса клеток и требуют фракцию носителя для конечной точки измерения, однако, они все еще ограничено выборки в заданных точках времени, а также требует добавления экзогенного свет активирующий субстратов.

Чтобы избежать ущерб необходимой разрушение образца, а также устранить затраты на подложках, линии клеток человека была разработана, который выражает полную бактериальной биолюминесценции (люкс) генной кассеты (luxCDABEfrp) для обеспечения непрерывного мониторинга живых клеток, который похож для флуоресцентных красителей на основе изображений живых клеток, но без дополнительных фотонов активирующих и микроскопические процедуры расследования. Эта клеточна лини способна конститутивно производства оптического сигнала для непрерывного прямого обнаружения без необходимости внешней стимуляции, что позволяет избежать разрушения образца. Механистически биолюминесцентного сигнала, генерируемого из этих клеток приводитх годов, когда luxAB сформированный люциферазы фермент катализирует окисление длинноцепочечных жирных альдегида (синтезированы и регенерируют luxCDE продуктов гена с использованием эндогенных субстратов) в присутствии пониженной рибофлавин фосфат (FMNH _2, который рециркулируют из FMN геном, FRP Продукт) и молекулярного кислорода ^10. Экспрессия люкс кассеты в клетку-хозяина таким образом позволяет свету быть произведены и обнаружить без клеточной деструкции или экзогенный того подложки. Кроме того, взаимодействие между лк генов и эндогенно доступны FMN и O ₂ cosubstrates, и потребность в поддержании среды, которая может поддерживать преобразование FMN в FMNH _2, гарантирует, что полученное биолюминесцентного сигнала могут быть обнаружены только у живых , метаболически активные клетки.

Эти требования были ранее использованы, чтобы продемонстрировать, что люкс-BasЭд биолюминесцентными выходе сильно коррелирует с сотовыми численности населения, что ¹¹ и токсического воздействия соединений ухудшает autobioluminescent производства в доза-реакция моды ^12. Здесь мы используем ранее характеризуется autobioluminescent эмбриональной почки человека (НЕК 293), клеточную линию ¹¹ для демонстрации автоматизированной токсикологические скрининг антибиотика блеомицина семьи с известными ДНК повреждающим активность в качестве представительного примера для проверки применения autobioluminescent клетках млекопитающих для испытаний на токсичность.

протокол

1. Подготовка клеток

1. Восстановление флакон биолюминесцентного НЕК293 из жидкого азота замороженного и выращивают их в среде Игла, модифицированную по Дульбекко (DMEM) с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки, 0,01 мМ заменимых аминокислот, 1 антибиотикам противогрибковым и 0,01 мМ пирувата натрия в Т ₇₅ культуре ткани колбы при 37 ° С и 5% СО _2.
   Примечание: Средства массовой информации и дополнительные компоненты, зависит от клеточных линий и, следовательно, должны быть выбраны соответственно.
2. Обновить среды каждые 2-3 дня до достижения ~ 80% слияния.
   Примечание: количество клеток необходимо будет основано на эксперимента. При необходимости более клетки могут быть получены путем пересева.
3. Урожай клетки для тестирования.
   1. Удалить среды и промыть клетки забуференным фосфатом физиологическим раствором (PBS), осторожно закрученных колбу и затем отбрасывание отработанного PBS.
   2. Добавить трипсина и инкубировали при 37 ° С в течение 2 мин,или пока клетки не были отделены от колбы.
   3. Сбор отдельных клеток в PBS и передавать их в чистую пробирку центрифуги.
      Примечание: Если не прилипшие клеточных линий используются отдельные клетки центрифугированием и промывают один раз PBS.
4. Определение общего количества клеток с использованием гемацитометра или другой системы подсчета клетки.
5. Центрифуга клеточной суспензии при 300 мкг в течение 5 мин. Удалите супернатант и ресуспендирования клеток в свежей, предварительно нагретой среде.
6. Семенной равное число клеток в отдельные лунки из непрозрачного мульти-луночный планшет. В этом примере пластина 5 × 10 ^{5 клеток} в объеме 1 мл в каждую лунку черный 24-луночный планшет. Пластина равный объем среды в трех лунках в качестве отрицательного контроля.
   Примечание: число клеток высевали в каждую лунку является гибким и может быть оптимизирована для отдельных экспериментов. Для каждого биолюминесцентными клеточной линии, экспериментально определить соотношение между числом клеток и bioluminescent выход, а также минимальный обнаруживаемый клетки считать до любых тестов на токсичность. Чтобы сделать это, мера биолюминесценции в широком диапазоне размеров популяции (например, 1 × 10 ^{-3 до} 1 × 10 ^{6 клеток)} в стандартных условиях изображений.
7. Лечение клетки с тестированием соединения (соединений), как описано ниже.

2. Химической подготовки

1. Подготовьте химических проходит испытания в виде концентрированного раствора. В этом примере используют 100 мг / мл маточного раствора антибиотика блеомицина семьи.
   Примечание: Для минимизации потенциальных транспортного средства на основе токсические эффекты, особенно если органический растворитель используют в качестве средства для химической того, рекомендуется, чтобы исходной концентрации по меньшей мере в 1000 раз нужного после приложения концентрации.
2. Добавить подготовленную запас химических непосредственно к клеткам. В этом примере доза антибиотика интерес в конечной концентрации 100, 200, 300 и 400 мкг / мл в трискладчатый скважин. Оставьте трех скважин клеток необработанными в качестве контроля.
   Примечание: Конечная концентрация целевой химический должны быть выбраны на основе конкретных экспериментальных целей. Широком диапазоне концентраций, как правило, испытания для получения полного спектра токсические эффекты.

3. Обработки изображений и анализа данных

1. Сразу же после химической того, поместите пластину в визуализации палаты подходящим инструментом для получения изображения и измерения биолюминесценции.
2. Измерение биолюминесценции каждые 15 минут в течение 24 часов периода использования 10 мин Время интегрирования для каждого чтения.
   Примечание: время интегрирования использованы в этом примере, для каждой пластины основы и может быть отрегулирован для измерения для каждого а основе с использованием других люминометров выбора. Время интегрирования также может быть скорректирована в зависимости от выбранного биолюминесцентными клеточной линии. Потому биолюминесценции производится автономно без разрушения клеток или любой внешней стимуляции, читатьIngs может быть принято в любой желаемый момент времени для выполнения конкретных экспериментальных целей.
3. Количественная оценка интенсивности биолюминесценции из каждой лунки путем определения области интересов использовании совместимого программного обеспечения. Отображение светового потока либо в виде общего потока (фотонов / сек) или средний блеск (фотонов / сек / см ² / steridian) каждого образца.

Результаты

В этом исследовании, динамика autobioluminescent НЕК293 наблюдали непрерывно в течение периода 24 ч в ответ на воздействие антибиотиков (рис. 1). Токсическое действие этого антибиотика, который является членом семейства, известного блеомицин, чтобы убить живых клеток путем связывания с Д?...

Обсуждение

Этот метод демонстрирует использование автономно биолюминесцентного клетках млекопитающих, как в пробирке цитотоксичность скрининга, который позволяет живых клеток в постоянно контролироваться в течение жизни. Этот протокол является гибкой и может быть модифицирована для кон?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
IVIS Lumina	PerkinElmer		Other IVIS models and PMT-based plate readers can also be used
Living Imaging 2.0	PerkinElmer		Newer updates of this software is available
75 cm2 cell culture treated flasks	Corning	430641
6-well tissue culture-treated plates	Costar	07-200-83
Black 24-well plate	Greiner Bio-One	662174	96- or 384-well plates can be used for higher throughput applications
Phosphate buffered saline	Hyclone	SH30910
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), phenol red-free	Hyclone	SH30284
Fetal bovine serum	Hyclone	SH3091003
Nonessential amino acids, 100x	Life Technologies	11140050
Antibiotic-antimycotic, 100x	Life Technologies	15240062
Sodium pyruvate, 100mM	Life Technologies	11360070
Zeocin, 100 mg/ml	Life Technologies	R25001
Tripsin, 0.05%	Life Technologies	25300062