גירוי מוחי עמוק עם fMRI סימולטני במכרסמים

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה סטנדרטית להדמיה תפקודית בתהודה המגנטית בו זמנית וגירוי מוחי עמוק במכרסמים. השימוש בשילוב של כלים ניסיוניים האמורים, מאפשר החקירה של פעילות במורד הזרם העולמית בתגובה לגירוי חשמלי בכמעט כל יעד במוח.

Abstract

על מנת להמחיש את התגובות עצביות הגלובליות או במורד לגירוי מוחי עמוק (DBS) לעבר מטרות שונות, פיתחנו פרוטוקול לשימוש ברמת חמצן בדם הדמיה תלויה (BOLD) תפקודית בתהודה מגנטית (fMRI) כדי מכרסמים תמונה עם DBS בו זמנית. DBS fMRI מציג מספר האתגרים טכניים, כולל דיוק של השתלת האלקטרודה, חפצי MR נוצרו על ידי אלקטרודה, הבחירה של הרדמה ושיתוק כדי למזער השפעות עצביות תוך ביטול תנועה של בעלי חיים, ותחזוקה של פרמטרים פיסיולוגיים במקביל, סטייה ממנו יכולים לבלבל אות BOLD. המעבדה שלנו פיתחה סדרה של נהלים שאינם מסוגל להתגבר על רוב הבעיות אפשריות אלה. לגירוי חשמלי, משמשת microelectrode דו קוטבי טונגסטן תוצרת בית, הוכנס stereotactically באתר הגירוי בנושא ההרדמה. כהכנה להדמיה, מכרסמים הם קבועים בכיסוי ראש מפלסטיק והועבר לשעמם את המגנט. להרגעה ושיתוק במהלך סריקה, קוקטייל של dexmedetomidine וpancuronium הוא החדיר ברציפות, יחד עם מינון מינימאלי של isoflurane; הכנה זו ממזערת את אפקט תקרת BOLD של חומרי הרדמה נדיפים. בדוגמא של ניסוי זה, גירוי של גרעין subthalamic (STN) מייצר תגובות BOLD שהם נצפו בעיקר באזורים בקליפת המוח ipsilateral, שמרכזו בקליפת המוח מוטורי. DBS סימולטני וfMRI מאפשר האפנון חד משמעי של מעגלים עצביים תלוי במיקום גירוי ופרמטרי גירוי, ומאפשרים תצפית של מודולציות העצבית ללא משוא פנים אזוריים. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעות במורד הזרם של ויסות מעגלים עצביים כמעט בכל אזור במוח, עם השלכות על DBS הן ניסיוני והקליני.

Introduction

קביעת ההשפעות במורד הזרם הגלובלית של פעילות מעגלים עצבית מהווה אתגר גדול ומטרה לתחומים רבים של מדעי המוח מערכות. מחסור בכלים זמין כרגע שלענות על צורך זה, ובכך יש ביקוש לנגישות מוגברת של מערכי הניסוי המתאימים. שיטה אחת כזו להערכת התוצאה הגלובלית של הפעלת מעגלים עצבית מסתמכת על היישום בו זמני של גירוי מוחי העמוק חשמלי (DBS) וה-MRI התפקודי (fMRI). DBS-fMRI מאפשר זיהוי של תגובות במורד הזרם להפעלת מעגלים על קנה מידה מרחבי גדול, ויכול להיות מיושם בכמעט כל יעד גירוי. כלים זה מתאים מאוד למחקרים פרה translational, כוללים האפיון של תגובות לגירוי בתדר גבוה טיפולי.

בנוסף לגישה לסורק MRI מתאים, ניסויי DBS-fMRI מוצלחים דורשים התחשבות במספר variables, כולל סוג האלקטרודה, שיטת הרגעה, ותחזוקה של פרמטרים פיסיולוגיים. לדוגמא, בחירת האלקטרודה צריכה להיות מבוססת על גורמים הנוגעים ליעילות גירוי (למשל. גודל עופרת ומוליכות, מונו לעומת דו קוטבית), כמו גם תאימות MR וגודל חפץ האלקטרודה. חפצי האלקטרודה משתנים בהתאם לחומר האלקטרודה וגודל, כמו גם רצף הסריקה משמש; בדיקות שלפני ניסוי יסודיים צריכה להיות מועסקות על מנת לקבוע את סוג האלקטרודה המתאים לכל מחקר. באופן כללי, אלקטרודות טונגסטן Microwire מומלצות לפרוטוקול זה. בחירה של שיתוק והרגעה צריכה להיעשות כדי לשתק ביעילות בבעלי החיים ולהפחית את ההשפעות מדכאות של תרופות הרגעה מסוימות באות ברמת דם בחמצן תלויה (BOLD). לבסוף, זה הוא קריטי כדי לשמור על בעלי החיים בפרמטרים פיסיולוגיים אופטימליים, הכוללים טמפרטורת גוף וריווי חמצן.

הפרוטוקול שפיתחנו לDBS-FMRI מתגבר רבים של מכשולים הפוטנציאליים אלה, ובידות שלנו, מספק תוצאות חזקות ועקביות. בנוסף, הפרוצדורות הללו ניתן לאמץ בקלות לשילוב של fMRI עם שיטות גירוי חלופיות, כוללים גירוי optogenetic.

Protocol

הצהרת אתיקה: הליך זה הוא בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות הנחיות למחקר בבעלי חיים (מדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה), והוא אושר על ידי האוניברסיטה של ​​ועדת טיפול בבעלי חיים ושימוש המוסדית צפון קרוליינה.

1. השתלת האלקטרודה

הצעד הראשון הוא השתלת אלקטרודה. בשלב זה, האלקטרודה מושתלת באופן חד צדדי לתוך גרעין subthalamic (STN), גרעין קטן עם משמעות translational לטיפול במחלת פרקינסון באמצעות השיטות הבאות:

1. לעקר את כל הציוד כירורגי באמצעות החיטוי, או תמיסת חיטוי בי מעוקר אינו אפשרי (למשל על סטריליות אלקטרודה) הערה:. זה ניתוח הישרדות לטווח קצר, ולכן טכניקת aseptic היא חיונית. לאחר ניתוח, ניתן הדמיה בעלי חיים לאחר תקופה קצרה התאוששות (48 שעות) או עד מספר שבועות מאוחר יותר.
2. להרדים את העכברוש (חולדות המבוגרת ספראג-Dawley 250-400 ז) באמצעות isoflurane 2.5% מנוהל באמצעות אינטובציה endotracheal והנשמה של בעלי חיים קטנים. תקן את החולדה למסגרת ניתוחית stereotactic ולהכין את האתר תוך שימוש בטכניקות הניתוחי מזוהמות.
3. להכין ולהבטיח כי האלקטרודה היא סטרילי. האלקטרודה Microwire טונגסטן 2 ערוצי תוצרת בית משמשת לצורך הליך זה, אם כי סוגי האלקטרודה MRI תואם רבים יעבדו. סוג האלקטרודה משמש עשוי להשפיע על האזור של רקמה הפגועה באופן מכאני על ידי ההליך, באזור של רקמת מגורה, והדיוק של השתלה, וכך להשפיע על תוצאת הניסוי הכוללת. אם סוג האלקטרודה הוא לא מסוגל להיות autoclaved, השתמש povidone-יוד חיטוי לעקר את האלקטרודה ככל אפשרי.
4. מספריים באמצעות להסיר את הקרקפת על האתר של השתלה בקוטר של כ 1.5 סנטימטר, לחשוף גבחת ולמבדה בגולגולת. הסר את השריר וfascia שמעל הגולגולתולהפסיק את כל דימום באמצעות electrocautery.
5. לגרד את פני השטח הגולגולת בכיוונים רבים עם אזמל כדי לשפר את ההידבקות של דבק דנטלי (שלב 1.8). רמת גבחת ומבדה בכיוון האופקי.
6. . למקד STN, ב3.6 מ"מ אחורי לגבחת ו2.5 מ"מ לרוחב קו אמצע, להשתמש במקדחה חשמלית קטן שקצו כדי ליצור חור בר מדידה כ 1.5 מ"מ קוטר הערה: המיקום המדויק של STN בהתייחסות לstereotaxic קואורדינטות רשאי להשתנות על ידי זן של עכברים, משקל, ומין. יש להשתמש בחולדות מבוגרים מאותו המין כדי למזער כל שינוי במיקום. במידת האפשר, יש להשתמש בסריקות אנטומיים טרום מבצעיות או הקלטות חשמל במהלך ניתוח כדי לזהות את מיקום STN על בסיס נושא בודד. יתר על כן, אתרי סיום אלקטרודה צריכים להיות מאומתים בהיסטולוגיה כדי להבטיח דיוק היעד.
   1. להפוך בזהירות חתך בדורה, ולהשתמש במלקחיים בוטים קטנים כדי להזיז את הדורה לצדדים של החור דואר. לעצור כל דימום באמצעות צמר גפן סטרילי טבול בתמיסת מלח. יצירת חורים לברגים אחד או יותר MR-תואמים) ולהכניס אותם בעדינות בגולגולת עד שהם יציבים. ברגים עשויים להיות ממוקמים בכל מקום שבו הם לא ישבשו את המיקום של המחבר החיצוני לאלקטרודה DBS (למשל. לא ישירות מאחורי ipsilateral STN לאלקטרודה). אנו ממליצים מיקומים בקצוות לרוחב של הגולגולת, באופן אידיאלי ישירות אחוריים לתפר למבדה. בשלב זה, את הגולגולת היא עבה יחסית, מפחיתה את הסבירות שברגים יהיו נזק הקליפה "הערה:. ברגי פליז לחתוך ל 4-5 מ"מ האורך משמשים בפרוטוקול זה, אם כי ברגי פלסטיק גם מתאימים.
7. מניחים את האלקטרודה על זרוע stereotactic, להבטיח כי הוא ישר ואנכי. לגעת באלקטרודה לגבחת, ואז להעביר את האלקטרודה אחורית בדיוק 3.6 מ"מ לגבחת ו2.5 מ"מ לרוחב קו אמצע ולגעת במשטח קליפת המוחעם אלקטרודה. ממשטח קליפת המוח, הכנס את מ"מ 7.8 האלקטרודה ventrally. קואורדינטות אלה נקבעות על ידי התייחסות לאטלס neuroanatomical ^1.
8. מניחים שכבה של דבק דנטלי על הגולגולת כולל את הברגים בגולגולת ובנקודת כניסה האלקטרודה. חכה עד שהמלט הוא קשוח לפני הסרת האלקטרודה מהמסגרת stereotactic לחלוטין. בנד האלקטרודה אחורה ולהשתמש במלט נוסף כדי לכסות את שאר דרכי האלקטרודה ומחבר לעמידות.

2. fMRI הכנה

השלב השני הוא ההתקנה לfMRI, כוללים מיקום של הסליל וההתקנה של ציוד ניטור פיסיולוגי.

1. לאבטח את ראשו של בעל החיים כדי למנוע תנועה במהלך סריקת הערה:. מערכת הבר intraauricular פלסטיק מותאם אישית משמשת כאן לקיבוע ראש. הנח את הברים לתוך תעלות האוזן ומאובטחת לכיסוי הראש, כך שהראש מסתובב בצורה חלקה בהדואר כיוון אנכי ללא סיבוב אופקי. אבטח את מיקום הראש על ידי תיקון השיניים העליונות למנגנון.
2. הרדימי העכברוש לחלוטין ולפקח CO גאות סוף ₂ כדי להבטיח יציבות לאורך כל הסריקות. כדי לשמור על CO גאות סוף ההרדמה, אוורור ובקרה ₂ רמות במהלך הסריקה, מערכת אוורור חיה הקטנה MR-תואם בשילוב עם מכשיר אדים isoflurane משמשת כאן, אם כי מגוון רחב של חומרי הרדמה והרגעה עשוי לשמש באופן דומה. הגדר את מכונת ההנשמה ל45 נשימות / דקה עם נפח בינוני, כ 500 מיליליטר / דקה של אוויר כהתחלת נפח. הגדר את isoflurane עד 2% ולהעביר את החולדה לחדר הסריקה. צרף הפלט של מכונת ההנשמה להטובוס של החולדה ולחץ בחוזקה כדי לאבטח. Capnometry צריך להיות שנרכש באמצעות צינור המחובר באופן מדויק למחבר הטובוס ככל האפשר. התאם אוורור נפח לייצר CO סוף הגאות ₂ של 2.6% ל.3.3%.
3. השתמש בבעל חיים קטן MR-תואם להכניס את החולדה לסורק עם אמבט מים חמים במחזור לבקרת טמפרטורה. תדביק את הכרית של האמבטיה על בעל ולכסות אותו עם נייר סופג נקי. מניחים את החולדה על מיטת המים החמים.
4. ניטור של רמות טמפרטורה ופחמן דו חמצני הינו חיוני לfMRI BOLD, ואילו רוויון חמצן בעורקים ואת קצב לב גם פרמטרים פיסיולוגיים שימושיים. הכנס בדיקה טמפרטורה רקטלית MR-תואמת וקלטת אותו לבסיס של הזנב, ולאחר מכן להתאים את הטמפרטורה של המים באמבטיה כדי לשמור על טמפרטורת גוף נורמלית ב 37 ° C. לפקח הרוויה עורקי חמצן וקצב לב באמצעות מערכת oximetry קטנה של בעלי חיים דופק, שמירתם ב95-98% ו250-350 פעימות לדקה, בהתאמה, אשר עשוי להשתנות בהתאם לסוג של הרדמה בשימוש. ריווי חמצן וקצב לב מושפעים גם על ידי עומק של הרדמה, אוורור נפח וקצב תחלופת אוויר. אוורור שיעור נפח וייתכן שיהיה צורךלהיות מאוזנת בזהירות כדי לשמור על רמות נאותות סוף הגאות CO ₂ וריווי חמצן נאות.
5. סליל פני השטח דרוש לרכישת fMRI BOLD. מניחים את הסליל לפני השטח קרוב אל פני השטח של הראש ככל האפשר. מובטחים ברגע, הנח משחת שיניים על פני השטח של הראש על כובע הבטון על מנת לצמצם חפצי רגישות קרובים לפני שטח מוח הערה:. אנו משתמשים בסליל משטח משדר תוצרת בית עם קוטר פנימי של כ 1.6 סנטימטר, אם כי סלילי משטח גדולים יותר עשויים להיות משמש כדי לייעל את תגובת BOLD באזורים קורטיקליים עמוקים יותר.
6. חבר את האלקטרודה מגרה למערכת ממריץ החשמלי לתכנות הערה:. אנו משתמשים TTL לתכנות מחוייט מפעילה מערכת הקשורה לגירוי דו קוטבי כדי לספק פולסים חשמליים מסונכרנים לעירורי RF מסריקות MR.
7. להרגעה ושיתוק במהלך רכישת נתוני ה-fMRI, השתמש קוקטייל של dexmedetomidine (0.1מ"ג / קילוגרם / שעה, IP) וpancuronium (1 מ"ג / קילוגרם / שעה, IP), בשילוב עם isoflurane במינון נמוך ב0.5% כדי למנוע פעילות אפילפטיים ^2. עירוי תרופות, יש להשתמש במשאבת מזרק MR-תואם אם המשאבה היא להיות ממוקמת בסביבה המגנטית. לחלופין, משאבת noncompatible עשויה להיות ממוקמת מחוץ לסביבה המגנטית בלבד שצינורות צנתר מורחבים משמש.

3. fMRI נתונים Acquistion

הצעד השלישי הוא רכישת ה-fMRI, כולל מיקום, shimming, סריקות אנטומיות, וסריקות תפקודיות. מערכת טסלה 9.4 עם סליל משטח תוצרת בית משמשת כאן, אם כי טכניקה זו עשויה להיות מותאמת למערכות גבוהה תחום אחרים ומסחרית שנעשתה סלילי ה-MRI.

1. הכנס את החולדה לתוך הסורק והעמדה במרכז המגנט. השתמש בתמונת הסקאוט שלושה מטוס למרכז דווקא את החולדה בתוך המגנט ביחס לאזורים במוח של עניין, וFASTMAP shimming לhomogenize השדה המגנטי באזורים של עניין.
2. השתמש ברצף T2 המשוקלל sagittal נדיר (FOV, 2.56 x 2.56 ² סנטימטר; גודל מטריצה, 256 x 256; עובי פרוס, 1.5 מ"מ; TR / TE, 1500/11 ms; פקטור נדיר, 8; Flip זווית, 180 °) כדי למצוא את מיקומו של השליך הקדמי, וליישר את התמונות הבאות למיקום זה. יישר סריקות שמונה פרוסה-ירייה אחת GE-EPI (FOV, 2.56 x 2.56 ² סנטימטר; גודל מטריצה, 96 x 96, שחזר ל128 x 128; עובי פרוס, 1 מ"מ; TR / TE, 1000-1014 ms) לנקודה זו עם אורינטצית העטרה.
3. עבור סריקות תפקודיות, השתמש 70 סריקות EPI רצופות עם 1 החלטה שנייה זמנית מסונכרנת לפלט הגירוי, מוגדרת 20 שאר שניות, 10 גירוי שניות, ואחריו שאר 40 שניות. לאפשר מינימום של 90 שניות בין סריקות כדי לאפשר התאוששות עצבים וכלי דם. לרכוש סריקות חוזרות ונשנות מרובות בכל פרמטר גירוי כדי לשפר את יחס אות לרעש על ידי ממוצע. השתמש בסדרה של סריקות דמה (בדרך כלל 4-8) מייד לפני הסריקה להפחתת רעש. לאשר את תגובת BOLD בעת רכישת תמונה כדי להבטיח את הצלחתו של הניסוי בשיטה המתוארת בסעיף 4, אם כי המיצוע, coregistration וגולגולת הפשטה ניתן לדלג בהגדרה זו.
4. לאחר הסריקה פונקציונלית היא מלאה, להשתמש ברצף T2 המשוקלל נדיר ספין הד (FOV, 2.56 x 2.56 ² סנטימטר; גודל מטריצה, 256 x 256; עובי פרוס, 1 מ"מ; TR / TE, 2500/33 ms; ממוצעים, 8 ) כדי למדוד את המיקום האנטומי של האלקטרודה in vivo. לרכוש חלקי העטרה ועל sagittal מרובים כדי למדוד את הקצה של חפץ האלקטרודה לאורך קדמי / אחורי, צירי הגחון המדיאלי / לרוחב ועל גב / ולאשר מיקום האלקטרודה. מיקרוסקופיה תהודה מגנטית ברזולוציה גבוהה (FOV, 1.8 x 1.28 סנטימטר; גודל מטריצה, 360 x 256; עובי פרוס, 0.5 מ"מ; TR / TE, 2500/12.6 ms; גורם נדיר, 8; ממוצעים, 280) ניתן להשתמש כדי לבחון את מיקום מדויק של דרכי האלקטרודה לאחר ההסרה בכבודלמבני neuroanatomical סמוכים ולאשר את הדיוק של אלקטרודה מיקום ^3.

4. fMRI עיבוד נתונים וניתוח

השלב הרביעי הוא עיבוד וניתוח של נתוני ה-fMRI, כוללים דור של מפות תגובה וחישוב של שינוי אות BOLD אחוזים. תוכניות מותאמות אישית הפועלות בסביבת מחשוב כלי תוכנת fMRI מסחריים (למשל MATLAB) או (לדוגמא. SPM, FSL, או AFNI) יכולות להיות מועסקות.

1. בגין עם coregistration תמונה ומיצוע של הנתונים הראשונים בתוך-נושא על ידי תדר, ואחריו על פני-כפוף הערה:. אנו להשיג קודי SPM באמצעות זה.
2. לבצע הפשטת גולגולת כדי להסיר רקמת nonbrain באמצעות אזור המוגדר ידני של עניין (ROI) עם thresholding אות. אלגוריתמי גולגולת הפשטה אוטומטיים יכולים להיות מועסקים.
3. לקמפל מפות תגובה על ידי חישוב מקדם המתאם של הקשר בין מיל BOLDponse לאורך זמן ואת הפרדיגמה הגירוי לכל voxel. עיכוב כמה שניות הפרדיגמה להסביר עיכוב בתגובה המודינמית עשויה להיות נחוץ. רמת הגדרה משמעותית בP <0.05 לאחר תיקון Bonferroni. שיטות סטטיסטיות אחרות יכולות להיות מועסקות. תיקון להשוואות מרובות באמצעות אקראי תיאורית שדה או תיקון ברמת אשכול מבוסס על גאוס אקראי שדה ניתן לבצע במקום של תיקון Bonferroni לניתוח רגיש יותר ⁴ הערה:. העיכוב המודינמית עשוי להשתנות לפי אזורים במוח הממוקדים, סוכנים תרופתיים בשימוש, ופרמטרים פיסיולוגיים. זה חיוני כדי לשלוט בפרמטרים אלה על מנת למנוע השתנות בתוך-נושא ובין-נושאים.
4. לכמת את תגובת BOLD על ידי הגדרת ROI כדי לחלץ נתונים בזמן כמובן. ממוצע שינוי אות אחוזים על פני כל voxels בתוך אותו המבנה האנטומי. גם ניתוח voxel מבחינת השימוש הכללי לינארי הדגם עשוי לשמש ⁵.

תוצאות

נתונים תפקודיים נציג נרכשו על פי הפרוטוקול הנ"ל בחולדה אחת עם אלקטרודה מגרה מושתלת לגרעין subthalamic בצד ימין. איור של התקנה חיונית לרכישת תמונת DBS fMRI מסופק באיור 1. גירוי יושם בקנה אחד עם הפרוטוקול לעיל, עם אמפליטודה של 0.3 mA, תדירות 130 הרץ והרוחב פולס של 0.09 אלפיו?...

Discussion

DBS סימולטני וfMRI מייצגים ערכת כלים ניסיוניות מבטיחים לזיהוי והאפיון של תגובות במורד הזרם העולמית לגירוי מעגלים עצבי, in vivo. היתרון העיקרי של שיטה זו על פני כלים זמינים אחרים, כגון קלטות אלקטרו, טמון בטבע יחסית משוחד של ה-fMRI, לפיה שטח גדול ומגוון של רקמת המוח יכול להי...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)