설치류에 동시 fMRI를 깊은 뇌 자극

요약

이 프로토콜은 설치류에서 동시에 기능성 자기 공명 영상과 깊은 두뇌 자극을위한 표준 방법을 설명합니다. 이러한 실험 도구를 함께 사용은 거의 모든 뇌 대상에 전기 자극에 대한 응답으로 글로벌 다운 스트림 활동의 탐사 할 수 있습니다.

초록

다양한 대상에 깊은 뇌 자극 (DBS)에 대한 글로벌 및 다운 스트림의 연결 반응을 시각화하기 위해, 우리는 혈액의 산소 수준의 종속 (BOLD) 기능성 자기 공명 영상 (fMRI) 동시 DBS와 이미지 설치류를 사용하기위한 프로토콜을 개발했습니다. DBS의 fMRI 전극 주입 정밀도를 포함하는 다수의 기술적 문제를, 선물, MR을 동시에 동물의 움직임, 그리고 생리 학적 매개 변수의 유지 보수를 제거하면서 모든 신경 세포의 영향을 최소화하기 위해 마취 및 마비의 전극, 선택에 의해 만들어진 유물, 편차가있는 혼동 할 수있는 BOLD 신호. 우리의 실험실이 가능한 대부분의 문제를 극복 할 수있는 일련의 절차를 개발했습니다. 전기 자극의 경우, 집에서 만든 텅스텐 바이폴라 미세 전극은 마취 제목에 자극이 사이트에서 정위 삽입, 사용됩니다. 영상을 준비, 설치류는 플라스틱 투구에 고정되어마그넷 보어로 전송. 스캔하는 동안 진정 작용과 마비를 들어, dexmedetomidine과 pancuronium의 칵테일은 지속적으로 이소 플루 란 최소한의 복용량과 함께 주입되고,이 혼합물은 휘발성 마취제의 BOLD 천장 효과를 최소화 할 수 있습니다. 이 예제 실험에서 시상 하부 핵 (STN)의 자극은 운동 피질을 중심으로, 동측 대뇌 피질의 지역에서 주로 관찰된다 BOLD 반응을 생산하고 있습니다. 동시 DBS와 fMRI를 자극 위치와 자극의 매개 변수에 대한 신경 회로의 명확한 변조 따라 허용하고, 지역 편견의 연결 변조의 관찰을 허용합니다. 이 기술은 실험과 임상 모두 DBS에 대한 의미와 함께, 거의 모든 뇌 영역에서 신경 회로를 변조의 하류 효과를 탐구하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

신경 회로의 활동의 글로벌 다운 스트림 효과를 결정하는 시스템 신경 과학의 여러 분야에 대한 주요 도전과 목표를 나타냅니다. 전통의 소수는이 요구를 충족 현재 사용할 수 있으며, 따라서 적절한 실험 셋업이 쉽게 사용이 요구되고있다. 신경 회로 활성화의 글로벌 결과를 평가하기위한 하나의 방법은 뇌 심부 전기 자극 (DBS)과 기능적 MRI (fMRI를)의 동시 응용 프로그램에 의존합니다. DBS-의 fMRI는 큰 공간적 스케일 회로 활성화에 하류 반응의 검출을 허용하고, 실질적으로 어떤 자극 타겟에 적용될 수있다. 이 도구 세트는 치료 고주파 자극에 대한 반응의 특성을 포함하여 번역 전임상 연구에 매우 적합하다.

적합한 MRI 스캐너에 접근 이외에, 성공적인 DBS-의 fMRI 실험 variabl의 수의 고려가 필요전극 형, 진정 방법 및 생체 변수의 유지 보수 등 에스. 예를 들어, 전극의 선택은 자극 효과 (예. 리드 크기 및 컨덕턴스, 모노 - 대 바이폴라)뿐만 아니라 MR 호환성 이슈 및 전극 크기와 관련된 요인에 근거한다. 전극 아티팩트는 전극 재료와 크기뿐만 아니라, 사용 된 스캔 순서에 의해서, 철저한 사전 실험 테스트는 각 연구에 적합한 전극 유형을 결정하기 위해 사용되어야한다. 일반적으로, 텅스텐 마이크로 와이어 전극은이 프로토콜에 대한 권장합니다. 중풍 및 진정제의 어워드 효과적으로 동물을 고정화하고 혈액 산소 수준 의존 (BOLD) 신호에서 특정 진정제의 억제 효과를 줄이기 위하여 만들어 져야한다. 마지막으로는 체온, 산소 포화도 등 최적의 생리 학적 파라미터에 동물을 유지하는 것이 중요하다.

우리는 DBS를 위해 개발 한 프로토콜-의 fMRI는 이러한 잠재적 인 많은 장애물을 극복하고, 우리의 손에, 강력하고 일관된 결과를 제공합니다. 또한,이 실험 절차는 용이 optogenetic 자극 포함한 대안 자극 방법의 fMRI와의 조합을 채용 할 수있다.

프로토콜

윤리 성명 :이 절차는 동물 연구 (실험 동물의 관리 및 사용을위한 설명서)를위한 건강 지침의 국립 연구소에 따라와 노스 캐롤라이나 기관 동물 관리 및 사용위원회의 대학에 의해 승인됩니다.

1. 전극 이식

첫 번째 단계는 전극의 주입이다. 이 단계에서, 전극은 일방적으로 시상 하부 핵 (STN), 다음 방법을 사용하여 파킨슨 병 치료를위한 병진 유의성 작은 ​​핵으로 주입된다 :

1. .이 단기적인 생존 수술입니다, 따라서 무균 기술이 필수적이다 : 고압 증기 멸균이 주 (전극 불임에 대한 예) 할 수없는 오토 클레이브, 또는 소독액을 사용하여 모든 수술 장비를 소독. 수술 후, 동물은 짧은 회복 기간 (48 시간) 후 또는 몇 주까지 영상화 할 수 있습니다 나중에.
2. 기관 내 삽관 및 작은 동물 인공 호흡기를 통해 관리 2.5 % 이소 플루 란 (isoflurane)을 사용하여 쥐 (성인 흰쥐 2백50-4백g)를 마취. 정위 수술 프레임에 쥐를 수정하고 무균 기술을 사용하여 수술 부위를 준비합니다.
3. 준비하고 전극은 멸균 있는지 확인합니다. 많은 MRI 호환 전극 유형은 작동하지만 집에서 만든 2 채널 텅스텐 마이크로 와이어 전극은이 절차에 사용됩니다. 사용 된 전극 형 따라서 전체적인 실험 결과에 영향을 미치는, 기계적 절차, 자극 된 조직 영역 및 주입 정확도에 의해 손상된 조직 영역에 영향을 미칠 수있다. 전극 형은 멸균 될 수없는 경우에, 가능한 한 작게 전극 살균 포비돈 요오드 방부제를 사용한다.
4. 사용 가위는 두개골에 브레 그마 및 람다을 밝히기 위해서, 약 1.5 cm의 직경 주입의 사이트를 통해 두피를 제거합니다. 두개골을 덮는 근육과 근막을 제거모든 전기 소를 사용하여 출혈을 중지합니다.
5. 치과 용 시멘트의 접착력 (단계 1.8)을 개선하기 위해 메스 여러 방향으로 두개골 표면을 손상. 수평 방향 레벨 브레 그마 및 람다.
6. . 브레 그마 3.6 mm 후방에서 STN을 대상으로 정중선 옆 2.5 mm는, 직경 약 1.5 mm를 측정하는 버 구멍을 만들 수있는 작은 팁 전기 드릴을 사용하려면 : 좌표를 정위를 참조하는 STN의 정확한 위치는 모른다 쥐의 피로, 체중, 성별에 따라 다릅니다. 같은 성별의 성인 쥐 위치에 어떤 변화를 최소화하기 위해 사용되어야한다. 가능하면, 미리 연산 해부 검사 또는 수술 전기 녹음 개별 제목 기준 STN 위치를 식별하기 위해 사용되어야한다. 또한, 전극 종단 사이트 조직 학적 목표 정확도를 보장하기 위해 검증되어야한다.
   1. 조심스럽게 경질에 절개를하고, 일의 측면에 경질을 이동하는 작은 무딘 집게를 사용전자 홀. 식염수에 적신 멸균면을 사용하여 출혈을 중지합니다. 하나 이상의 MR-호환 나사 구멍)을 생성하고이 안정 될 때까지 두개골 부드럽게을 삽입합니다. 나사는이 DBS 전극의 외부 커넥터의 위치에 방해가되지 않습니다 어떤 위치에 배치 될 수있다 (예를 들면.하지 직접 전극에 STN의 동측 뒤에). 우리는 이상적으로 직접 람다 봉합에 후부, 두개골의 측면 가장자리에 배치를 권장합니다. 이 시점에서, 두개골 나사 피질 손상 될 가능성을 감소, 상대적으로 두께가 "주 :. 플라스틱 나사도 적합하지만, 길이 4-5 ㎜로 절단 금관 악기 나사,이 프로토콜에 사용됩니다.
7. 똑바로 수직임을 보장 정위 팔에 전극을 배치합니다. 브레 그마에 전극을 터치 한 후 대뇌 피질의 표면을 중간 선 및 터치 정확히 3.6 mm의 브레 그마에 후방 2.5 mm 측면 전극으로 이동전극. 대뇌 피질의 표면에서 배쪽으로 전극 7.8 mm를 삽입합니다. 이 좌표는 신경 해부학 아틀라스 ^1을 참조하여 결정된다.
8. 두개골 나사와 전극 삽입 지점을 포함하여 두개골을 통해 치과 용 시멘트의 레이어를 놓습니다. 시멘트가 완전히 전에 정위 프레임에서 전극을 제거하는 경화 될 때까지 기다립니다. 벤드 전극은 이전 버전과 내구성 전극 기관 및 커넥터의 나머지 부분을 충당하기 위해 추가로 시멘트를 사용합니다.

2. fMRI를 준비

두 번째 단계는 생리적 모니터링 장비의 코일 및 설치 위치 등의 fMRI를위한 셋업이다.

1. 스캔하는 동안 움직임을 방지하기 위해 동물의 머리를 고정 참고 :. 사용자 지정 플라스틱 intraauricular 바 시스템이 머리 고정 용 여기에 사용됩니다. 귀 운하에 막대를 놓고 머리가 일에 원활하게 회전되도록 투구에 고정수평 방향의 회전 전자 수직 방향. 장치에 상부 치아를 고정하여 머리의 위치를​​ 고정합니다.
2. 완전히 쥐를 마취하고 모든 검사를 통해 안정성을 보장하기 위해 최종 갯벌 CO _2를 모니터링 할 수 있습니다. 마취 및 진정 작용 화제의 다양성이 유사한 방식으로 사용될 수도 있지만 마취, 환기 및 조절 단부 조력 CO에게 스캔하는 _동안이 수준을 유지하기 위해, 이소 플루 란 기화기와 결합 MR 호환 작은 동물 환기 시스템은, 여기에서 사용된다. 시작 볼륨으로 공기의 적당한 볼륨, 약 500 ㎖ / 분으로 45 호흡 / 분에 인공 호흡기를 설정합니다. 2 %에 이소 플루 란을 설정하고 스캔 방에 쥐를 전송합니다. 쥐의 기관 내 튜브로 인공 호흡기의 출력을 연결하고 보안을 단단히 누릅니다. Capnometry 가능한 기관 내 튜브 커넥터에 가깝게 연결 관을 이용하여 취득한다. 3.3 %에 2.6 %의 호 기말 _{이산화탄소를} 생산하는 환기 볼륨을 조절합니다.
3. 온도 제어를위한 순환 온수 욕조가있는 스캐너에 쥐를 삽입 MR-호환 작은 동물 홀더를 사용합니다. 홀더에 목욕 패드를 테이프와 깨끗한 흡수 종이로 커버. 뜨거운 물 침대에 쥐를 놓습니다.
4. 동맥 산소 포화도와 심박수가 유용 생리 학적 파라미터를하는 동안 온도와 이산화탄소 수준의 모니터링, BOLD의 fMRI에 필수적이다. MR-호환 직장 온도 프로브와 꼬리의 기초에 테이프를 넣고 37 ℃에서 정상 체온을 유지하기 위해 물을 욕조의 온도를 조정 사용 마취제의 유형에 따라 달라질 수있는 각각 95-98%에서 그들을 유지 250-350 BPM, 작은 동물 맥박 산소 시스템을 사용하여 산소 포화도 및 심박수를 모니터링. 산소 포화도와 심박수는 모두 마취, 환기 볼륨 및 환기 속도의 깊이에 의해 영향을 받는다. 환기 볼륨과 속도를해야 할 수도 있습니다정중 적절한 기말 CO ₂ 레벨 및 충분한 산소 포화도를 유지하도록 균형을 이루어야한다.
5. 표면 코일 BOLD fMRI를 획득 필요합니다. 가능한 한 머리의 표면에 가까운 표면 코일을 배치합니다. 일단 확보 뇌 표면 근처 감수성 아티팩트를 감소시키기 위하여 시멘트 캡 헤드의 표면에 치약을 배치 참고. 큰 표면 코일이있을 수 있지만 우리는 약 1.6 cm의 내경이 제 송수신기 표면 코일을 사용 깊은 피질 영역에서 BOLD 반응을 최적화하는 데 사용됩니다.
6. 프로그램 전기 자극 시스템에 자극 전극을 연결 참고 :. 우리는 MR 검사에서 RF의 음원 정보에 동기화 된 전기 펄스를 전달하기 위해 바이폴라 자극기에 연결된 시스템을 트리거 맞춤 프로그램 TTL을 사용합니다.
7. 의 fMRI 데이터 수집 동안 진정 작용과 마비를 들어, (dexmedetomidine의 칵테일을 사용하여 0.1간질 활동 ² 방지하기 위해 0.5 %의 낮은 복용량의 이소 플루 란과 함께 ㎎ / ㎏ / 시간, IP) 및 pancuronium (1 ㎎ / ㎏ / 시간, IP). 펌프는 자기 환경에 배치 될 경우 약물 주입의 경우, MR-호환 주사기 펌프가 사용되어야한다. 대안 적으로, noncompatible 펌프 확장 카테터 튜브를 사용하는 것을 제공 자기 환경 외부에 배치 될 수있다.

3. 의 fMRI 데이터 취득 방식

세 번째 단계는 위치, shimming, 해부학 적 검사 및 기능 검사를 포함, fMRI를 수집합니다. 이 기술은 다른 높은 - 장 시스템에 적응 및 상업적 MRI 코일 제조 될 수 있지만 제 표면 코일 9​​.4 테슬라 시스템은, 여기에서 사용된다.

1. 자석의 중심에 스캐너와 위치에 쥐를 삽입합니다. 정확하게 관심의 뇌 영역에 대한 자석 내에서 쥐의 중심을 세 가지면 스카우트 이미지를 사용하여 FASTMAP는 균질 할 shimming관심 영역에 자기장을 nize.
2. 시상 T2 강조 RARE 순서 (, 매트릭스 크기 256 X 256, 슬라이스 두께 1.5 ㎜, TR / TE, 11분의 1,500 MS, 드물게 계수, 8, 각 플립, 180 ° FOV, 2.56 X 2.56 cm ^2)를 사용하여 앞쪽에 접합면의 위치를​​ 찾고,이 위치 이후의 이미지를 정렬합니다. 이 점에 여덟 조각 단발 GE-EPI 스캔 (TR / TE, 14분의 1,000 MS, 128 x 128의에 복원 행렬의 크기, 96 X 96,,, 슬라이스 두께 1mm FOV, 2.56 X 2.56 cm ^2)에 맞 춥니 다 관상 방향으로.
3. 기능 검사의 경우, 40 초 휴식 한 다음 20 초 휴식으로 설정 자극 출력 동기화 일초 시간 해상도, 10 초 자극과 70 연속 EPI 스캔을 사용합니다. 신경 혈관 복구를 할 수 있도록 스캔 사이 90 초 최소 허용합니다. 평균화함으로써 신호 대 잡음비를 향상시키기 위해 각 자극 파라미터에서 다수 반복 검사를 획득. 더미 일련의 스캔 (일반적으로 4-8을 사용하여) 소음 감소를 위해 주사 직전에. 평균, coregistration와 두개골 - 스트립이 설정에서 생략 될 수 있지만, 4 장에서 설명 된 방법을 사용하여 실험의 성공을 보장하기 위해 영상 획득시 BOLD 반응을 확인합니다.
4. 기능 검사가 완료되면, T2 강조 RARE 스핀 에코 시퀀스 (FOV, 2.56 X 2.56 cm ^2를 사용하여, 매트릭스의 크기 256 X 256, 슬라이스 두께 1 ㎜, TR / TE, 33분의 2,500 MS, 평균, 8 ) 생체 내에서 전극의 해부학 적 위치를 측정한다. 전방 / 후방 / 중간 측면과 지느러미 / 복부 축을 따라 전극 이슈의 끝을 측정 전극의 위치를​​ 확인하기 위해 여러 관상 및 시상 부분을 취득. 고해상도 자기 공명 현미경 (FOV, 1.8 × 1.28 cm, 매트릭스 크기 360 × 256, 슬라이스 두께 0.5 mm; TR / TE, 2500/12.6 MS; RARE 계수, 8; 평균, 280)을 조사하는데 사용될 수있다 관련하여 제거한 후, 전극 요로의 정확한 위치근처의 신경 해부학 적 구조와 전극 배치 ^3의 정확성을 확인합니다.

4. 의 fMRI 데이터 처리 및 분석

네번째 단계는 처리 및 응답지도 및 퍼센트 BOLD 신호 변화의 연산의 발생 등의 fMRI 데이터의 분석이다. 컴퓨팅 환경 내에서 (예를 들어, MATLAB) 또는 상업적 fMRI를 소프트웨어 도구 (예. SPM, FSL, 또는 AFNI)를 실행하는 사용자 지정 프로그램이 사용될 수있다.

1. 에서 피사체 뒤에 피험자 내 주파수에 의해 첫 번째 이미지의 coregistration 및 데이터의 평균으로 시작 참고 :. 우리는이 사용 SPM 코드를 달성.
2. 신호 임계 값과 관심을 수동으로 정의 된 영역 (ROI)를 사용하여 nonbrain 조직을 제거하기 위해 스트립 두개골을 수행합니다. 자동 두개골 스트리핑 알고리즘이 사용될 수있다.
3. BOLD 입술 사이의 관계의 상관 계수를 산출함으로써 응답 맵을 컴파일시간과 각 복셀에 대한 자극의 패러다임에 ponse. 혈역학 적 응답 지연을 고려하여 패러다임 몇 초를 지연하는 것은 필요할 수 있습니다. P에서 설정 상당한 수준의 4 Bonferroni 보정 대신 수행 할 수 있습니다 :. 혈역학 지연이 대상 뇌 영역에 따라 달라질 수 있습니다, 약물 에이전트 사용 생리 학적 매개 변수입니다. 이 주제 내 및 간 주제 변동을 방지하기 위해 이들 파라미터를 제어하기 위해 중요하다.
4. 시간 코스 데이터를 추출 할 수있는 투자 수익 (ROI)을 정의하여 BOLD 반응을 정량화. 같은 해부학 적 구조 내에서 모든 복셀에 걸쳐 %의 신호 변화를 평균. 일반 선형 모델을 이용하여 복셀 - 방향 분석도 ^5를 사용할 수있다.

결과

주제 기능적 데이터는 우측의 시상 하부 핵 이식 자극 전극과 하나의 쥐에서 상기 프로토콜에 따라 취득 하였다. DBS의 fMRI 영상 획득을위한 필수 설정의 그림은 그림 1에 제공된다. 자극은 0.3 mA, 130 Hz에서 0.09 밀리의 펄스 폭의 주파수의 진폭과, 상기 프로토콜과 일치 도포 하였다. 동측 운동 피질의 강력한 활성화를 지속적으로 자극을 대상으로 시상 하부 핵으로이 프로토콜을 사용하...

토론

동시 DBS와의 fMRI는 생체 내에서 신경 회로의 자극에 글로벌 다운 스트림 응답의 식별 및 특성화를위한 유망한 실험 키트를 나타냅니다. 이러한 전기 생리학 녹음 등 다른 사용 가능한 도구를 통해이 기술의 가장 큰 장점은 뇌 조직의 크고 다양한 지역은 대상에서 DBS에 대한 응답을 검사 할 수있다 fMRI를, 상대적으로 공정한 성격에있다. 설명 프로토콜이 쥐에서 DBS-fMRI를 위해 특정이지만, DBS...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)