Kemirgenler Eşzamanlı fMRI ile derin beyin stimülasyonu

Özet

Bu protokol kemirgen eşzamanlı fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme ve derin beyin stimülasyonu için standart bir yöntem açıklanır. Bu deneysel araçların kombine kullanımı hemen hemen herhangi bir beyin hedefe elektriksel uyarıya tepki olarak küresel alt aktivitesinin araştırılması için izin verir.

Özet

Çeşitli hedeflere derin beyin stimülasyonu (DBS) ile küresel ve mansap nöronal yanıtları görselleştirmek için, biz kan oksijen seviyesi bağımlı (BOLD) fonksiyonel manyetik rezonans görüntüleme (fMRI) eşzamanlı DBS ile görüntü kemirgenler için kullanmak için bir protokol geliştirdik. DBS fMRI elektrot implantasyonu doğruluğu da dahil olmak üzere teknik sorunlar bir dizi sunuyor, MR aynı anda hayvan hareket, ve fizyolojik parametrelerin bakım ortadan kaldırırken herhangi bir nöronal etkileri en aza indirmek için anestezi ve felçli bir elektrot, seçim tarafından oluşturulan eserler, hangi sapma bulandırabilir BOLD sinyal. Laboratuvarımız bu olası sorunların çoğu üstesinden yeteneğine sahip olan prosedürleri bir dizi geliştirdi. Elektrik stimülasyonu için, ev yapımı tungsten bipolar mikroelektrot anestezi bireyde uyarım yerinde stereotaktik eklenir kullanılır. Görüntüleme için hazırlık, kemirgenler bir plastik baş kısmının sabit ve vardırmıknatıs deliğin aktarılır. Tarama sırasında sedasyon ve felç için, deksmedetomidin ve pankuronyum bir kokteyl sürekli izofluran minimal doz ile birlikte, doluyor, bu hazırlık volatil anestezik BOLD tavan etkisini en aza indirir. Bu deneyde, örneğin, subtalamik çekirdek (STN) uyarılmasının motor korteks merkezli, ipsilateral kortikal bölgelerinde esas olarak gözlenir KALIN tepkiler üretir. Eşzamanlı DBS ve fMRI stimülasyon konumu ve stimülasyon parametreleri üzerine nöral devrelerin kesin modülasyon bağımlı sağlar ve bölgesel önyargı ücretsiz nöronal modülasyonların gözlem izin verir. Bu teknik, deneysel hem de klinik DBS için etkileri olan, hemen hemen herhangi bir beyin bölgesinde sinir devresi modüle aşağı etkilerini araştırmak için kullanılabilir.

Giriş

Nöral devre aktivitenin küresel mansap etkileri belirlenmesi sistemleri nörobilim birçok alanlar için önemli bir meydan okuma ve hedefi temsil eder. Araçlar azlığı bu ihtiyacı karşılamak anda mevcut, ve bu nedenle uygun deney düzeneklerinin artan erişilebilirlik için bir talep var. Nöron devresi aktivasyon küresel sonucu değerlendirmek için böyle bir yöntem, derin beyin elektrik stimülasyonu (DBS) ve fonksiyonel MR (fMRI) aynı anda uygulanması dayanır. DBS-fMRI büyük bir mekansal ölçekte devre aktivasyonuna alt yanıtların tespiti için izin verir ve hemen hemen herhangi bir stimülasyon bir hedefe uygulanabilmektedir. Bu araç takımı, terapötik yüksek frekanslı yanıtların uyarılmasına karakterizasyonu dahil olmak üzere, ön-klinik çalışmalar, translasyon için oldukça uygundur.

Uygun bir MRI tarayıcısı erişim yanı sıra, başarılı DBS-fMRI deneyler variabl bir dizi dikkate gerektirirelektrot tipi, sedasyon yöntemi, ve fizyolojik parametrelerin bakım dahil olmak üzere es. Örneğin, elektrot seçim uyarma etkinliği (örneğin,. Talebi boyut ve iletkenlik, mono-bipolar vs), hem de MR uyumluluk ve elektrot artefakt büyüklüğüne ilişkin faktörlere dayalı olmalıdır. Elektrot eserler elektrot malzeme ve boyutu, hem de kullanılan tarama dizisine göre değişir, çalışma öncesi deneysel testleri, her bir çalışma için uygun bir elektrot türünü belirlemek için kullanılması gerekmektedir. Genel olarak, tungsten mikrotel elektrotlar bu protokol için tavsiye edilir. Felçli ve sedatif seçimi etkili hayvan hareketsiz ve kan oksijen seviyesi bağımlı (BOLD) sinyal bazı sakinleştirici baskılayıcı etkilerini azaltmak için yapılmalıdır. Son olarak, vücut sıcaklığı ve oksijen doygunluğu de dahil olmak üzere uygun fizyolojik parametrelerin, en hayvanı korumak için önemlidir.

Biz DBS için geliştirdik protokolü-FMRI bu potansiyel engellerin birçoğunun üstesinden, ve bizim ellerde, sağlam ve tutarlı sonuçlar sağlar. Ayrıca, bu deney prosedürleri kolayca optogenetic uyarılması da dahil olmak üzere, alternatif uyarma yöntemleriyle FMRI kombinasyonu için kabul edilebilir.

Protokol

Etik Beyanı: Bu prosedür, Hayvan Araştırmaları (Laboratuar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu) Sağlık Rehberi National Institutes uygun ve Kuzey Carolina Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.

1.. Elektrot İmplantasyon

İlk adım, elektrot implantasyonu. Bu aşamada, bir elektrot tek taraflı olarak subtalamik çekirdek (STN), aşağıdaki yöntemler kullanılarak Parkinson hastalığı tedavisi için translasyon öneme sahip küçük bir çekirdek içine implante edilir:

1. ., Bu kısa süreli sağkalım cerrahi, ve böylece aseptik teknik gereklidir: otoklav Not (elektrot sterilite örneğin) mümkün olmayan bir otoklav veya antiseptik solüsyon kullanarak tüm cerrahi aletler sterilize edin. Ameliyat sonrası hayvanlar, kısa bir iyileşme dönemi (48 saat) sonra ya da birkaç hafta kadar sonra görüntülenebilir.
2. Endotrakeal entübasyon ve küçük bir hayvan ventilatör aracılığıyla uygulanan% 2.5 izofluran kullanarak sıçan (Yetişkin Sprague-Dawley sıçanları 250-400 g) anestezisi. Stereotaktik cerrahi çerçeveye sıçan düzeltmek ve aseptik teknikler kullanılarak cerrahi sitesi hazırlamak.
3. Hazırlayın ve elektrot steril olduğundan emin olun. Birçok MR-uyumlu elektrot türleri çalışacak olsa bir ev yapımı 2-kanallı tungsten mikrotel elektrot, bu işlem için kullanılır. Kullanılan elektrot özellikleri dolayısı ile de genel deney sonucu etkileyen mekanik prosedür, uyarılmış doku alanı ve implantasyon doğruluğu zarar doku alanı etkileyebilir. Elektrot tipi otoklavlanmalıdır mümkün değilse, mümkün olduğu elektrodu sterilize etmek için povidon-iyot antiseptik kullanın.
4. Kullanma makas kafatası bregma ve lambda ortaya çıkarmak için, yaklaşık 1.5 sm bir çapı olan implantasyon sitesi üzerinden kafa derisi çıkarın. Kafatasını örten kas ve fasya kaldırve tüm elektrokoter kullanılarak kanama durur.
5. Diş çimento yapışma (adım 1.8) geliştirmek için bir neşter ile birden fazla yönde kafatası yuzeysel. Yatay yönde Seviye Bregma ve Lambda.
6. . Bregma'ya 3.6 mm posterior, STN hedef ve orta hat yanal 2.5 mm, çapı yaklaşık 1.5 mm kalınlığında bir çapak delik oluşturmak için küçük uçlu elektrikli matkap kullanmak için Not: koordinatları stereotaksik referans STN tam yeri olabilir sıçan soyu, ağırlığı ve cinsiyete göre değişir. Aynı cinsiyet erişkin sıçanlar yerde herhangi bir varyasyonu en aza indirmek için kullanılmalıdır. Mümkünse, operasyon öncesi anatomik taramaları ya da ameliyat sırasında elektrik kayıtları tek bir konu olarak STN konumunu belirlemek için kullanılmalıdır. Ayrıca, elektrot sonlandırma siteleri histolojik hedef doğruluğunu sağlamak için kontrol edilmelidir.
   1. Dikkatle dura bir kesi yapmak ve inci yanlarına dura taşımak için küçük künt forseps kullanıne delik. Fizyolojik ile ıslatılmış steril pamuk kullanarak herhangi bir kanamayı durdurmak. Bir veya daha fazla MR-uyumlu vidalar için delikler) oluşturmak ve stabil olana kadar kafatası onları hafifçe yerleştirin. Vidalar onlar DBS elektrot için harici bir konnektör yerleşimini bozmayacak herhangi bir yere yerleştirilmiş olabilir (örn.. Değil, doğrudan elektrot STN ipsilateral arkasında). Biz ideal doğrudan lambda dikişine posterior, kafatası yan kenarlarında yerleşimleri önerilir. Bu noktada, kafatası vida korteks zarar olasılığını azaltır, nispeten kalın bir "Not:. Plastik vidası, aynı zamanda uygun olmasına rağmen, 4-5 mm uzunluğunda kesilmiş Pirinç vidalar, bu protokol kullanılır.
7. Düz ve dik olmasını sağlamak, stereotaktik kolunda elektrot yerleştirin. Bregma'ya elektrot dokunun, sonra kortikal yüzeye orta hat ve dokunmak için tam 3.6 mm Bregma'ya arka ve 2.5 mm yanal elektrot hareketelektrotla. Kortikal yüzeyinden, ventral olarak elektrot 7.8 mm yerleştirin. Bu koordinatlar nöroanatomik atlas ¹ referans alınarak belirlenir.
8. Kafatası vida ve elektrot ekleme noktası da dahil olmak üzere diş kafatası üzerinde çimento tabakası yerleştirin. Çimento önce tamamen stereotaktik çerçeve elektrot çıkarmadan sertleştirilmiş kadar bekleyin. Bend elektrot geri ve dayanıklılık için elektrot sistemi ve bağlacının kalanı karşılamak için ek çimento kullanın.

2. fMRI Hazırlık

İkinci adım, fizyolojik izleme ekipmanları bobin ve kurulum konumlandırma dahil fMRI için kurulum vardır.

1. Tarama sırasında hareket etmesini önlemek için hayvanın kafasını Güvenli Not:. Bir özel plastik intraauricular bar sistemi baş tespit için burada kullanılmıştır. Kulak kanallarına çubuklarını yerleştirin ve kafa inci sorunsuz döner böylece baş kısmı için güvence altınahiçbir yatay rotasyon ile e dikey yönde. Aparata üst dişleri sabitleyerek baş pozisyonu elde edin.
2. Tamamen sıçan anestezisi ve tüm taramaları boyunca istikrarı sağlamak için endtidal CO ₂ monitör. Anestetik ve sedasyon ajanlar çeşitli benzer bir şekilde kullanılabilmektedir da anestezi, havalandırma ve kontrol uç tidal CO tarama sırasında ₂ seviyesini korumak için, bir izofluran buharlaştırıcı ile birlikte bir MR uyumlu bir küçük hayvan havalandırma sistemi, burada kullanılmıştır. Bir başlangıç ​​hacmi olarak bir hava orta hacmi, yaklaşık 500 ml / dk ile 45 solunum / dk vantilatör ayarlayın. % 2 izofluran ayarlayın ve tarama odasına sıçan aktarın. Sıçan endotrakeal tüp ventilatörün çıkışını takın ve güvenli sıkıca bastırın. Kapnometri mümkün endotrakeal tüp konektörüne yakından bağlı bir tüp kullanılarak elde edilmelidir. 3.3% 2.6% bir Endtidal CO ₂ üretmek için havalandırma ses seviyesini ayarlayın.
3. Sıcaklık kontrolü için bir dolaşan sıcak su banyosu ile tarayıcı içine sıçan eklemek için bir MR-uyumlu küçük hayvan tutucu kullanın. Tutucuya banyosunun Pad Teyp ve temiz emici kağıt ile örtün. Sıcak su yatağına sıçan yerleştirin.
4. Arteriyel oksijen doygunluğu ve kalp hızı da yararlı fizyolojik parametreleri ise sıcaklık ve karbondioksit seviyelerinin izlenmesi, BOLD fMRI için gereklidir. Bir MR-uyumlu bir rektal sıcaklık probu ve kuyruk tabanına bandı için takın ve daha sonra 37 ° C'de normal vücut sıcaklığının muhafaza edilmesi için su banyosu sıcaklığını ayarlamak Kullanılan anestezik türüne bağlı olarak değişebilir, sırasıyla,% 95-98 onları korumak ve 250-350 bpm, küçük bir hayvan oksimetre sistemi kullanılarak arteriyel oksijen doygunluğu ve kalp atışlarının izlenmesi. Oksijen doygunluğu ve kalp hızı hem anestezi, ventilasyon hacmi ve havalandırma oranı derinliği etkilenmektedir. Ventilasyon hacmi ve hızı gerekebilirdikkatle yeterli endtidal CO ₂ düzeyleri ve yeterli oksijen doygunluğu korumak için dengeli olması.
5. Bir yüzey bobin BOLD fMRI edinimi için gereklidir. Mümkün olduğu kadar kafa yüzeyine yakın yüzey bobin yerleştirin. Bir kez güvenli, beyin yüzeyine yakın duyarlılık eserler azaltmak amacıyla çimento kap kafasının yüzeyine diş macunu yer Not:. Daha büyük bir yüzey bobinler olabilir ama biz, yaklaşık 1.6 sm bir iç çapa sahip bir ev yapımı alıcı-verici bobin yüzey kullanımı subkortikal derin bölgelerde BOLD yanıt optimize etmek için kullanılır.
6. Programlanabilir elektrik stimülatörü sistemine uyarıcı elektrot bağlayın Not:. Biz MR taramaları RF zorlamalara senkronize elektriksel darbeleri sunmak için bir bipolar uyancısına bağlı sistemini tetikleyen bir ısmarlama programlanabilir TTL kullanın.
7. FMRI veri toplama sırasında sedasyon ve felç için, (deksmedetomidin bir kokteyl kullanın 0.1epileptik aktivitesi ² önlemek için% 0.5 'lik düşük dozlu izofluran ile kombine mg / kg / saat ip) ve pankuronyum (1 mg / kg / saat, ip). Pompa manyetik bir ortama yerleştirilebilir için ise ilaç infüzyonu için, bir MR uyumlu şırınga pompası kullanılmalıdır. Alternatif olarak, uzun bir kateter noncompatible pompa boru donanımı kullanılması koşuluyla, manyetik ortamı dışında yerleştirilebilir.

3. fMRI Veri Toplama

Üçüncü adım konumlandırma, layneri, anatomik taramaları ve fonksiyonel taramaları da dahil olmak üzere, fMRI kazanım. Bu tekniğin diğer yüksek-alan sistemlerinin adapte ve ticari MR bobinleri yapılmış olabilir ama ev yapımı bir yüzey bobini ile 9.4 Tesla sistemi, burada kullanılmıştır.

1. Mıknatısın merkezinde tarayıcı ve yerine sıçan yerleştirin. Tam ilgi beyin bölgelerine göre mıknatıs içindeki sıçan ortalamak için üç uçak izci görüntü kullanın ve hızlı eşlemi homojen için shimmingilgilenilen bölgelerinde manyetik alan Nize.
2. Sagittal T2 ağırlıklı NADİR dizisi (, matris boyutu, 256 x 256, kesit kalınlığı 1.5 mm; TR / TE 1500/11 ms; NADİR Factor, 8; Açı çevirin, 180 ° FOV, 2.56 x 2.56 cm ²⁾ kullanın anterior commissura yerini bulmak ve bu konuma sonraki görüntüleri hizalamak. Bu noktaya sekiz dilim tek-shot GE-EPI taramalar (TR / TE 1000/14 msn; 128 x 128 için yeniden matris boyutu, 96 x 96;, kesit kalınlığı, 1mm FOV, 2.56 x 2.56 cm ²⁾ hizalayın koronal yönlendirme ile.
3. Fonksiyonel taramalarda, 40 sn dinlenme ardından 20 sn dinlenme ayarlanmış stimülasyon çıkışı senkronize 1 ikinci temporal çözünürlük, 10 sn stimülasyon, 70 ardışık EPI taramaları kullanın. Nörovasküler kurtarma sağlamak için taramalar arasında 90 saniyelik bir az izin. Ortalayarak sinyal-gürültü oranını artırmak için her uyarım parametre birden fazla tekrarlanan taramalar elde. Kukla bir dizi tarama (genellikle 4-8 kullanın) Gürültü azaltma için taramaya hemen önce. Ortalama, coregistration ve kafatası-sıyırma Bu ortamda atlanabilir rağmen, 4. bölümde anlatılan yöntemi kullanarak deney başarılı olmasını sağlamak için görüntü elde anda BOLD yanıtı onaylayın.
4. Fonksiyonel tarama tamamlandıktan sonra, T2-ağırlıklı NADİR spin-eko sekansı (FOV, 2.56 x 2.56 cm ² kullanın; matris boyutu, 256 x 256, kesit kalınlığı, 1 mm; TR / TE, 2500/33 ms; ortalamalar, 8 ) in vivo elektrodun anatomik pozisyonunu ölçmek için uygulanır. Anterior / posterior, medial / lateral ve dorsal / ventral eksen boyunca elektrot dışlayıcı ucu ölçmek ve elektrot yerleştirme onaylamak için birden fazla koronal ve sagital bölümleri edinin. Yüksek çözünürlüklü manyetik rezonans mikroskopi (FOV, 1.8 x 1.28 cm, matris boyutu, 360 x 256, kesit kalınlığı, 0.5 mm; TR / TE, 2500/12.6 ms; NADİR faktörü, 8; ortalamalar, 280) incelemek için kullanılabilir ilgili çıkarılmasından sonra, elektrot sisteminin kesin yeriYakın Nöroanatomik yapılara ve elektrot yerleştirme ³ doğruluğunu onaylayın.

4. fMRI Veri İşleme ve Analizi

Dördüncü adım işleme ve tepki haritalar ve yüzde BOLD sinyal değişikliği hesaplama nesil de dahil olmak fMRI verilerin analizi. Bir bilgi işlem ortamında (örneğin MATLAB) veya ticari fMRI yazılım araçları (örneğin. SPM, FSL veya AFNI) çalışan özel programlar kullanılabilir.

1. Across-konu takiben, denek içi sıklığına göre ilk görüntü coregistration ve veri ortalama ile başlayın Not:. Bu kullanarak SPM kodları başarmak.
2. Sinyal eşikleme ile ilgi elle tanımlanmış bir bölge (ROI) kullanılarak nonbrain doku kaldırmak için sıyırma kafatası gerçekleştirin. Otomatik kafatası sıyırma algoritmalar kullanılabilir.
3. BOLD res arasındaki ilişkinin korelasyon katsayısı hesaplanarak tepki haritalar derlemekzaman ve her vokselin için uyarma paradigması üzerinde Ponse. Hemodinamik yanıt gecikme için hesaba paradigma birkaç saniye geciktirmek gerekebilir. P Set anlamlı seviyesi 4 için Bonferroni düzeltmesi yerine yapılabilir Not:. Hemodinamik gecikme hedeflenen beyin bölgelere göre değişebilir, farmakolojik ajanlar kullanılabilir ve fizyolojik parametreleri. Bu konu içinde ve arasındaki konular değişkenliği önlemek amacıyla bu parametreleri kontrol etmek çok önemlidir.
4. Zaman ders veri ayıklamak için bir yatırım getirisi tanımlayarak BOLD yanıtı ölçmek. Aynı anatomik yapısı içinde tüm voksellerden genelinde yüzde sinyal değişikliği ortalama. Genel Doğrusal Model kullanılarak voksel-bilge analizi de ⁵ kullanılabilir.

Sonuçlar

Örnek işlevsel veri yandaki subtalamik çekirdeğe takılan bir uyarıcı elektrot ile tek bir sıçan yukarıdaki protokole uygun olarak elde edildi. DBS FMRI görüntü elde etmek için gerekli kurulum bir örnek, Şekil 1 'de verilmiştir. Uyarım 0.3 mA, 130 Hz ve 0.09 msn darbe genişliğinin frekans bir genlik ile, yukarıdaki protokole uygun uygulanmıştır. Ipsilateral motor korteks sağlam aktivasyonu sürekli uyarım hedef olarak subtalamik çekirdek Bu protokol kullanılarak görselle?...

Tartışmalar

Aynı anda DBS ve fMRI in vivo olarak, sinir stimülasyonu devre küresel alt tepkilerinin tanımlanması ve karakterizasyonu için gelecek vaat eden bir deneysel araç kiti temsil eder. Gibi elektrofizyolojik kayıtları gibi mevcut diğer araçlar üzerinde bu tekniğin en büyük avantajı, beyin dokusunun büyük ve çeşitli bir alan herhangi bir hedefe DBS yanıt incelendi sayede fMRI, görece tarafsız doğada yatıyor. Açıklanan protokol, sıçanda DBS-FMRI özel olmakla birlikte, DBS tepkilerin gör?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)