La stimolazione cerebrale profonda con simultanea fMRI in Roditori

Riepilogo

Questo protocollo descrive un metodo standard per la simultanea risonanza magnetica funzionale e la stimolazione cerebrale profonda nei roditori. L'uso combinato di questi strumenti sperimentali consente l'esplorazione di attività downstream globale in risposta alla stimolazione elettrica a qualsiasi bersaglio cervello.

Abstract

Per visualizzare le risposte neuronali globali e valle a stimolazione cerebrale profonda (DBS) a vari obiettivi, abbiamo sviluppato un protocollo per l'utilizzo del livello di ossigeno nel sangue dipendente (BOLD), la risonanza magnetica funzionale (fMRI) per roditori di immagine con simultanea DBS. DBS fMRI presenta una serie di sfide tecniche, tra cui la precisione di elettrodi impianto, MR artefatti creati dalla elettrodo, scelta dell'anestesia e paralitico per ridurre al minimo gli effetti neuronali e contemporaneamente eliminando il movimento degli animali, e il mantenimento di parametri fisiologici, deviazione da cui è possibile confondere la segnale BOLD. Il nostro laboratorio ha sviluppato una serie di procedure che sono in grado di superare la maggior parte di questi possibili problemi. Per la stimolazione elettrica, viene utilizzato un tungsteno bipolare microelettrodo casalingo, stereotactically inserito nel sito di stimolazione nel soggetto anestetizzato. In preparazione per l'imaging, i roditori sono fissati su un copricapo di plastica etrasferito al foro del magnete. Per la sedazione e paralisi durante la scansione, un cocktail di dexmedetomidina e pancuronio è continuamente infuso, insieme a una dose minima di isoflurano; questa preparazione minimizza l'effetto massimale BOLD degli anestetici volatili. In questo esperimento esempio, la stimolazione del nucleo subtalamico (STN) produce risposte BOLD che si osservano soprattutto nelle regioni corticali omolaterali, centrato in corteccia motoria. Simultanea DBS e fMRI permette la modulazione univoca dei circuiti neurali dipende dalla posizione di stimolazione e parametri di stimolazione, e permette l'osservazione di modulazioni neuronali gratuitamente polarizzazione regionale. Questa tecnica può essere utilizzata per esplorare gli effetti a valle di modulazione circuiti neurali in quasi ogni regione del cervello, con implicazioni sia sperimentale e clinica DBS.

Introduzione

Determinare gli effetti a valle globali delle attività del circuito neurale rappresenta una sfida importante e obiettivo per molte aree dei sistemi neuroscienze. Una scarsità di strumenti attualmente disponibili che soddisfano questa esigenza, e quindi vi è una richiesta di maggiore accessibilità delle opportune configurazioni sperimentali. Uno di questi metodi per valutare l'effetto globale di attivazione circuito neurale si basa sull'applicazione simultanea di profonda stimolazione elettrica del cervello (DBS) e risonanza magnetica funzionale (fMRI). DBS-fMRI permette l'individuazione di risposte a valle all'attivazione circuito su larga scala spaziale, e può essere applicato a qualsiasi bersaglio stimolazione. Questo set di strumenti è molto adatto per studi preclinici traslazionali, compresa la caratterizzazione delle risposte alla stimolazione ad alta frequenza terapeutico.

Oltre a accesso ad uno scanner adatto MRI, successo esperimenti DBS-fMRI richiedono considerazione di una serie di variables, compreso il tipo di elettrodo, metodo sedazione, e la manutenzione dei parametri fisiologici. Ad esempio, la scelta dell'elettrodo dovrebbe essere basata su fattori relativi alla stimolazione efficacia (ad es. Dimensioni piombo e conduttanza, mono-vs bipolare), così come la compatibilità MR ed elettrodo formato manufatto. Artefatti elettrodi variano in funzione del materiale dell'elettrodo e dimensioni, così come la sequenza di scansione utilizzata; approfondita test pre-sperimentale dovrebbe essere impiegato per determinare il tipo di elettrodo appropriato per ciascuno studio. In generale, gli elettrodi di tungsteno Microconduttori sono raccomandati per questo protocollo. Scelta di paralitica e sedativo dovrebbe essere fatto per immobilizzare efficacemente l'animale e ridurre gli effetti soppressivi di alcuni sedativi sul segnale di livello di ossigeno nel sangue-dipendente (BOLD). Infine, è fondamentale per mantenere l'animale a parametri fisiologici ottimale, inclusa la temperatura corporea e la saturazione di ossigeno.

Il protocollo che abbiamo sviluppato per la DBS-FMRI supera molti di questi potenziali ostacoli, e nelle nostre mani, fornisce risultati robusti e coerenti. Inoltre, queste procedure sperimentali possono essere facilmente adottati per la combinazione di fMRI con metodi di stimolazione alternativi, tra cui la stimolazione optogenetic.

Protocollo

Etica Dichiarazione: Questa procedura è conforme con il National Institutes of Linee guida per la salute per la ricerca animale (Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio) ed è approvato dalla University of North Carolina Istituzionale cura degli animali e del Comitato Usa.

1. Elettrodi impianto

Il primo passo è elettrodo impianto. In questa fase, un elettrodo viene unilateralmente impiantato nel nucleo subtalamico (STN), un piccolo nucleo di significato traslazionale per il morbo di Parkinson utilizzando i seguenti metodi:

1. Sterilizzare tutti gli apparecchi chirurgici utilizzando un autoclave, o una soluzione antisettica dove autoclave non è possibile (ad esempio per elettrodo sterilità). Nota: questo è un intervento chirurgico la sopravvivenza a breve termine e, quindi, la tecnica asettica è essenziale. Dopo l'intervento chirurgico, gli animali possono essere ripreso dopo un breve periodo di recupero (48 ore) e fino a diverse settimane più tardi.
2. Anestetizzare il topo (per adulti Sprague-Dawley 250-400 g) con 2,5% isoflurano somministrato attraverso intubazione endotracheale e un piccolo ventilatore animali. Fissare il topo a un frame stereotassico chirurgico e preparare il sito chirurgico utilizzando tecniche asettiche.
3. Preparare e assicurarsi che l'elettrodo è sterile. A 2 canali elettrodi di tungsteno microconduttori fatta in casa viene utilizzato per questa procedura, anche se molti tipi di elettrodi compatibile con MRI funzionerà. Il tipo di elettrodo utilizzato può influenzare la zona di tessuto danneggiato meccanicamente dalla procedura, l'area di tessuto stimolato, e la precisione di impianto, influenzando così il risultato sperimentale complessivo. Se il tipo di elettrodo non è in grado di essere autoclavato, utilizzare povidone-iodio antisettico per sterilizzare l'elettrodo per quanto possibile.
4. Utilizzando le forbici rimuovere il cuoio capelluto sopra il sito di impianto con un diametro di circa 1,5 cm di scoprire bregma e lambda sul cranio. Rimuovere il muscolo e la fascia sovrastante il cranioe arrestare tutti emorragia con elettrocauterizzazione.
5. Graffiare la superficie del cranio in più direzioni, con un bisturi per migliorare l'adesione del cemento dentale (passo 1,8). Livello Bregma e Lambda in direzione orizzontale.
6. . Per indirizzare STN, 3,6 mm posteriormente al Bregma e 2,5 mm lateralmente alla linea mediana, usare un trapano elettrico piccolo-punta a creare un buco bava misura circa 1,5 mm di diametro Nota: La posizione esatta della STN in riferimento a stereotassica coordinate possono variare da ceppo ratto, peso e sesso. Ratti adulti dello stesso sesso dovrebbero essere utilizzati per ridurre al minimo qualsiasi variazione di posizione. Se possibile, le scansioni anatomiche pre-operativi o registrazioni elettriche intraoperatorie dovrebbero essere utilizzati per identificare la posizione STN su base individuale argomento. Inoltre, i siti di terminazione elettrodi devono essere istologicamente verificati per garantire l'accuratezza bersaglio.
   1. Fare attenzione un'incisione nella dura madre, e l'uso di piccole pinze smussato per spostare la dura ai lati the il foro. Smettere di ogni tipo di sanguinamento con cotone sterile imbevuto di soluzione fisiologica. Creare fori per una o più viti compatibili MR) e inserire delicatamente nel cranio finché non sono stabili. Le viti possono essere collocati in qualsiasi posizione in cui essi non interferiscono con il posizionamento del connettore esterno per l'elettrodo DBS (ad es. Non direttamente dietro ipsilaterale STN all'elettrodo). Si consiglia posizionamenti ai bordi laterali del cranio, idealmente posteriormente direttamente alla sutura lambda. A questo punto, il cranio è relativamente spessa, riducendo la probabilità che le viti possono danneggiare la corteccia "Nota:. Viti ottone tagliati a 4-5 mm di lunghezza sono utilizzati in questo protocollo, sebbene viti di plastica sono adatti.
7. Posizionare l'elettrodo sul braccio stereotassica, assicurandosi che sia dritto e verticale. Toccare l'elettrodo di Bregma, quindi spostare l'elettrodo esattamente 3,6 millimetri posteriormente al Bregma e 2,5 mm lateralmente alla linea mediana e toccare la superficie corticalecon l'elettrodo. Dalla superficie corticale, inserire l'elettrodo 7,8 millimetri ventrale. Queste coordinate sono determinate con riferimento ad un atlante neuroanatomica ^1.
8. Mettere uno strato di cemento dentale sopra il cranio, inclusi viti cranio e punto di inserimento dell'elettrodo. Attendere che il cemento è completamente indurito prima di rimuovere l'elettrodo dal telaio stereotassico. Piegare l'elettrodo all'indietro e utilizzare cemento per coprire il resto del tratto elettrodo e il connettore per la durevolezza.

2. fMRI Preparazione

Il secondo passo è l'installazione di fMRI, compreso il posizionamento della bobina e la configurazione delle apparecchiature di monitoraggio fisiologico.

1. Fissare la testa dell'animale per impedire il movimento durante la scansione. Nota: Un sistema di bar intraauricular plastica personalizzata viene qui utilizzato per la fissazione testa. Posizionare le barre nel canale uditivo e fissare il casco in modo che la testa ruota uniformemente in the direzione verticale senza rotazione orizzontale. Fissare la posizione della testa fissando i denti superiori all'apparato.
2. Anestetizzare il topo completamente e monitorare end tidal CO ₂ per garantire la stabilità in tutte le scansioni. Per mantenere l'anestesia, ventilazione e controllo fine di marea CO ₂ livelli durante la scansione, un sistema di ventilazione piccolo animale compatibile MR combinato con un vaporizzatore isoflurano è qui utilizzato, se una varietà di agenti anestetici e sedazione può essere utilizzato in modo simile. Impostare il ventilatore a 45 respiri / min con un volume moderato, circa 500 ml / min di aria come volume di partenza. Impostare la isoflurano al 2% e trasferire il topo nella stanza scansione. Collegare l'uscita del ventilatore al tubo endotracheale del ratto e premere con decisione per proteggere. Capnometry deve essere acquisita tramite un tubo collegato il più vicino al connettore del tubo endotracheale possibile. Regolare il volume di ventilazione per produrre un CO di fine espirazione ₂ del 2,6% al 3,3%.
3. Utilizzare un supporto piccolo animale compatibili con MR per inserire il topo nello scanner con un bagno di acqua calda che circola per il controllo della temperatura. Nastro il tappetino del bagno sul supporto e coprire con carta assorbente pulita. Posizionare il topo sul letto ad acqua calda.
4. Monitoraggio dei livelli di temperatura e di biossido di carbonio sono essenziali per BOLD fMRI, mentre la saturazione arteriosa di ossigeno e la frequenza cardiaca sono anche i parametri fisiologici utili. Inserire una sonda di temperatura rettale compatibili con MR e nastro per la base della coda, e quindi regolare la temperatura del bagno d'acqua per mantenere la temperatura corporea normale a 37 ° C. Controllo saturazione arteriosa di ossigeno e frequenza cardiaca usando un piccolo sistema pulsossimetria animale, mantenendoli al 95-98% e 250-350 bpm, rispettivamente, che possono variare a seconda del tipo di anestetici utilizzati. Saturazione di ossigeno e la frequenza cardiaca sono entrambi influenzati dalla profondità dell'anestesia, il volume di ventilazione e tasso di ventilazione. Volume di ventilazione e la velocità potrebbe essere necessarioessere attentamente bilanciata per mantenere adeguati livelli di CO ₂ di fine espirazione e un'adeguata saturazione di ossigeno.
5. Una bobina di superficie è necessaria per l'acquisizione BOLD fMRI. Posizionare la bobina di superficie il più vicino alla superficie della testa come possibile. Una volta fissato, collocare dentifricio sulla superficie della testa sul tappo cemento al fine di ridurre gli artefatti di suscettibilità vicino alla superficie del cervello Nota:. Usiamo un ricetrasmettitore bobina di superficie casalingo con un diametro interno di circa 1,6 cm se bobine di superficie più grande può essere utilizzato per ottimizzare la risposta BOLD nelle regioni subcorticali più profondi.
6. Collegare l'elettrodo stimolante ad un sistema stimolatore elettrico programmabile Nota:. Usiamo un TTL programmabile su misura sistema collegato a uno stimolatore bipolare per fornire impulsi elettrici sincronizzati eccitazioni RF dalle scansioni MR attivazione.
7. Per la sedazione e la paralisi durante l'acquisizione dei dati fMRI, utilizzare un cocktail di dexmedetomidina (0,1mg / kg / ora, ip) e pancuronium (1 mg / kg / ora, ip), in combinazione con isoflurano basso dosaggio a 0,5% per evitare che l'attività epilettica ^2. Per infusione di farmaci, una pompa a siringa compatibile MR può essere utilizzato se la pompa deve essere collocato nell'ambiente magnetico. In alternativa, una pompa Incompatibile può essere posizionato all'esterno dell'ambiente magnetico purché si usano tubi catetere estesa.

3. fMRI dati Acquistion

Il terzo passo è l'acquisizione fMRI, tra cui il posizionamento, spessoramento, scansioni anatomiche e scansioni funzionali. Un sistema 9.4 Tesla con bobina di superficie casalingo è qui utilizzato, sebbene questa tecnica può essere adattato ad altri sistemi ad alto campo e commercialmente fatto bobine MRI.

1. Inserire il ratto nello scanner e posizione nel centro del magnete. Utilizzare un'immagine esploratore tre piani per centrare con precisione il ratto all'interno del magnete rispetto alle regioni cerebrali di interesse, e FastMap spessoramento a omogescere il campo magnetico in corrispondenza delle zone di interesse.
2. Utilizzare un sagittale T2-pesate sequenza RARE (FOV, 2,56 x 2,56 centimetri ^2; dimensione della matrice, 256 x 256, spessore di strato 1,5 mm, TR / TE, 1500-1511 ms; Factor RARE, 8; Ciabatta dall'alto, 180 °) per trovare la posizione della commessura anteriore, e allineare le immagini successive a questa posizione. Allineare otto fetta scansioni GE-EPI scatto singolo (FOV, 2,56 x 2,56 centimetri ^2; dimensione della matrice, 96 x 96, ricostruita a 128 x 128, spessore fetta, 1 millimetro; TR / TE, 1000-1014 ms) a questo punto con orientamento coronale.
3. Per le scansioni funzionali, utilizzare 70 consecutivi scansioni EPI con risoluzione di 1 secondo temporale sincronizzata con l'uscita di stimolazione, impostare a 20 sec di riposo, 10 stimolazione sec, seguito da 40 secondi di riposo. Lasciare un minimo di 90 secondi tra le scansioni per consentire il recupero neurovascolare. Acquisire più scansioni ripetute per ogni parametro di stimolazione per migliorare il rapporto segnale-rumore calcolando la media. Utilizzare una serie di scansioni fittizi (in genere 4-8) Immediatamente prima scansione per la riduzione del rumore. Confermare la risposta BOLD al momento dell'acquisizione dell'immagine per garantire il successo dell'esperimento con il metodo descritto nel paragrafo 4, anche se media, coregistrazione e cranio-strippaggio possono essere saltati in questa impostazione.
4. Dopo la scansione funzionale è completo, utilizzare una rara sequenza T2-pesate spin-echo (FOV, 2,56 x 2,56 centimetri ^2; dimensione della matrice, 256 x 256, spessore di strato, 1 mm; TR / TE, 2500/33 ms; medie, 8 ) per misurare la posizione anatomica dell'elettrodo in vivo. Acquisire più sezioni coronali e sagittali per misurare la punta del manufatto elettrodo lungo anteriore / posteriore, assi ventrale mediale / laterale e dorsale / e confermare il posizionamento degli elettrodi. Microscopia ad alta risoluzione risonanza magnetica (FOV, 1,8 x 1,28 centimetri, dimensione della matrice, 360 x 256, spessore fetta, 0,5 millimetri; TR / TE, 2500/12.6 ms; fattore RARE, 8, medie, 280) possono essere utilizzati per esaminare la precisa localizzazione del tratto dell'elettrodo dopo rimozione rispettoai vicini strutture neuroanatomiche e confermare l'esattezza di posizionamento degli elettrodi ^3.

4. fMRI Data Processing and Analysis

Il quarto passo è l'elaborazione e l'analisi dei dati fMRI, compresa la produzione di mappe di risposta e calcolo della percentuale variazione del segnale BOLD. Possono essere impiegati programmi personalizzati in esecuzione all'interno di un ambiente di calcolo (ad esempio MATLAB) o commerciali strumenti software fMRI (ad es. SPM, FSL, o AFNI).

1. Inizia con coregistrazione immagine e la media dei dati prima entro i soggetti in base alla frequenza, seguito da tutta soggetto Nota:. Compiamo questo utilizzando i codici SPM.
2. Eseguire cranio nudo per rimuovere il tessuto nonbrain usando regione definita manualmente di interesse (ROI) con segnale soglia. Algoritmi cranio strippaggio automatici possono essere utilizzati.
3. Compilare mappe risposta calcolando il coefficiente di correlazione del rapporto tra res BOLDponse nel tempo e il paradigma di stimolazione per ciascun voxel. Ritardare il paradigma alcuni secondi per spiegare il ritardo nella risposta emodinamica può essere necessario. Impostare il livello significativa a p <0.05 dopo la correzione di Bonferroni. Altri metodi statistici possono essere impiegati. Correzione per confronti multipli utilizzando casuale Field Theory o correzione a livello di cluster basato su gaussiana casuale campo può essere eseguito in luogo della correzione Bonferroni per analisi più sensibile ⁴ Nota:. Il ritardo emodinamica può variare in base alle regioni cerebrali mirati, agenti farmacologici utilizzati, e parametri fisiologici. E 'fondamentale controllare questi parametri al fine di evitare la variabilità intra-soggetto e tra soggetti.
4. Quantificare la risposta BOLD definendo un ROI per estrarre i dati in tempo portate. Media la variazione del segnale per cento attraverso tutti i voxel all'interno della stessa struttura anatomica. Analisi voxel-wise utilizzando il modello lineare generale può essere utilizzato anche ⁵.

Risultati

Dati funzionali rappresentativi sono stati acquisiti secondo il protocollo sopra in un singolo ratto con un elettrodo di stimolazione impiantato nel nucleo subtalamico sul lato destro. Un esempio di configurazione essenziale per DBS fMRI acquisizione dell'immagine è fornito in Figura 1. La stimolazione è stata applicata coerente con il protocollo di cui sopra, con un'ampiezza di 0,3 mA, frequenza di 130 Hz e larghezza di impulso di 0,09 msec. L'attivazione robusta di corteccia motoria ipsi...

Discussione

Simultanea DBS e fMRI rappresenta un toolkit sperimentale promettente per l'identificazione e la caratterizzazione delle risposte globali a valle alla stimolazione circuito neurale, in vivo. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri strumenti disponibili, come le registrazioni elettrofisiologiche, risiede nella natura relativamente imparziale di fMRI, per cui una vasta e diversificata area di tessuto cerebrale può essere esaminato per tempi di risposta di DBS in qualsiasi bersaglio. Sebbe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)