Глубокая стимуляция мозга с одновременным МРТ в Грызуны

Резюме

Этот протокол описывает стандартный метод для одновременного функциональной магнитно-резонансной томографии и глубокой стимуляции мозга в грызуна. Комбинированное использование этих экспериментальных средств позволяет для исследования глобального нисходящего активности в ответ на электрическую стимуляцию практически в любой цели мозга.

Аннотация

Для того чтобы визуализировать глобальные и вниз по течению нейронные ответов на глубокой стимуляции мозга (DBS) при различных целей, мы разработали протокол для использования уровень в крови кислорода зависит (жирный) функциональная магнитно-резонансная томография (МРТ) для изображения грызунов с одновременным DBS. DBS МРТ представляет ряд технических проблем, в том числе точности электрода имплантации, MR артефакты, созданные электрода, выбор анестезии и расслабленному, чтобы минимизировать любые нейронные эффекты, одновременно устраняя движение животных, и обслуживание физиологических параметров, отклонение от которых может поставить в тупик BOLD сигнал. Наша лаборатория разработала набор процедур, которые способны преодолеть большинство этих возможных проблем. Для электрической стимуляции, самодельный вольфрама биполярное микроэлектрод используется, вставляется стереотаксически на месте стимуляции в анестезированной теме. При подготовке к изображений, грызуны закреплены на пластиковой головной убор ипереданы в отверстие магнита. Для седации и паралича во время сканирования, коктейль дексмедетомидина и панкурония постоянно переплетаются, наряду с минимальной дозы изофлюрана; этот препарат минимизирует Смелый потолочный эффект летучих анестетиков. В этом примере эксперимента, стимулирование субталамического ядра (STN) дает жирный шрифт ответов, которые наблюдаются в основном в ипсилатеральных областях коры, с центром в моторной коре. Одновременное DBS и МРТ позволяет однозначным модуляция нейронных цепей в зависимости от местоположения стимуляции и параметров стимуляции, и позволяет наблюдать нейронных модуляций свободных регионального предвзятости. Этот метод может быть использован для изучения вниз по течению модулирования нейронной схемы на практически любой области мозга, с последствиями для обоих экспериментальной и клинической DBS.

Введение

Определение глобальных вниз по течению нейронной активности замыкания представляет собой серьезную проблему и цель для многих областях систем нейронауки. Недостаток в средствах в настоящее время доступны, что удовлетворить эту потребность, и таким образом есть спрос для увеличения доступности соответствующих экспериментальных установок. Один из таких методов для оценки глобального следствие активации нервной цепи зависит от одновременного применения глубокой мозговой электрической стимуляции (DBS) и функциональной МРТ (фМРТ). DBS-МРТ позволяет для обнаружения последующих реакций на активацию схемы на большой пространственный масштаб, и может быть применен практически в любой цели стимуляции. Это набор инструментов очень хорошо подходит для трансляционных доклинических исследований, в том числе характеристики ответов на терапевтической стимуляции высоких частот.

В дополнение к доступу к подходящим МРТ сканера, успешные эксперименты DBS-МРТ требует рассмотрения ряда variablэс, в том числе типа электрода, метод седации и техническое обслуживание физиологических параметров. Например, выбор электрод должен быть основан на факторах, относящихся к стимуляции эффективности (например. Свинец размера и проводимости, моно-против биполярный), а также совместимость МР и электрода размером артефактов. Электродные артефакты варьироваться в зависимости от материала электрода и размера, а также последовательности, используемой сканирования; тщательного предварительного экспериментальной проверки должны быть использованы, чтобы определить соответствующий тип электрода для каждого исследования. В общем, вольфрам MICROWIRE электроды рекомендуются для этого протокола. Выбор расслабленному и седативное следует эффективно обездвижить животное и уменьшить подавляющий эффект некоторых седативных средств на крови кислородом в зависимости от уровня (жирный шрифт) сигнала. Наконец, крайне важно для поддержания животное в оптимальных физиологических параметров, включая температуру тела и насыщения кислородом.

Протокол, который мы разработали для DBS-МРТ преодолевает многие из этих потенциальных препятствий, и в наших руках, предоставляет надежные и стабильные результаты. Кроме того, эти экспериментальные методики могут быть легко приняты для комбинации с МРТ альтернативных методов интенсификации притока, в том числе optogenetic стимуляции.

протокол

Заявление по этике: Эта процедура в соответствии с Национальными Институтами Руководства здравоохранения для исследований животных (Руководство по уходу и использованию лабораторных животных) и утверждается Университета Северной Каролины комитета уходу и использованию животных институциональной.

1. Электрод Имплантация

Первым шагом является электрод имплантации. На этом этапе, электрод в одностороннем порядке имплантировали в субталамического ядра (STN), небольшой ядра с трансляционной значение для лечения болезни Паркинсона с помощью следующих методов:

1. Стерилизовать все хирургического оборудования с использованием автоклава или антисептическим раствором, где в автоклаве не представляется возможным (например, для электрода стерильности). Примечание: это краткосрочная операция выживание, и, таким образом асептики имеет важное значение. После операции, животные могут быть отображены после краткого периода восстановления (48 ч) или до нескольких недель спустя.
2. Обезболить крысу (Взрослый Sprague-Dawley крыс 250-400 г), используя 2,5% изофлуран в ведении через интубации трахеи и небольшой животных вентилятора. Fix крысу к стереотаксической хирургического рамку и хирургическое место с использованием асептических методов.
3. Подготовить и обеспечить, что электрод является стерильной. Домашний 2-канальный вольфрама микропровод электрод используется для этой процедуры, хотя многие МРТ-совместимый типы электродов будет работать. Тип используемого электрода может повлиять на площадь механическое повреждение ткани в соответствии с процедурой, площадь ткани стимулируется, и точность имплантации, тем самым влияя на общий экспериментальный результат. Если тип электрод не может быть в автоклаве, используют повидон-йод антисептик для стерилизации электрод, насколько это возможно.
4. Использование ножницы удалить кожу головы над местом имплантации с диаметром приблизительно 1,5 см, чтобы раскрыть брегмы и лямбда на черепе. Снимите мышцы и фасции, покрывающий черепи остановить все кровотечения с помощью электрокоагуляции.
5. Поцарапать поверхность черепа в нескольких направлениях с помощью скальпеля, чтобы улучшить стоматологическую адгезию цемента (шаг 1.8). Уровень брегмы и лямбда в горизонтальном направлении.
6. . Чтобы настроить таргетинг STN, на 3,6 мм кзади от брегмы и 2,5 мм сбоку от средней линии, использовать небольшие чаевые электродрель создать заусенцев отверстие размером примерно 1,5 мм в диаметре Примечание: Точное местоположение STN со ссылкой на стереотаксической координаты могут варьироваться в зависимости от штамма крыс, веса и пола. Взрослых крыс одного пола должен быть использован, чтобы минимизировать любое изменение местоположения. Если это возможно, предэксплуатационных анатомические сканы или Интраоперационных электрические записи следует использовать для определения местоположения STN на индивидуальной предметной основе. Кроме того, электродные прекращения сайты должны быть гистологическое проверять для обеспечения точности целевой.
   1. Осторожно сделать разрез в твердой мозговой оболочки, и использовать маленькие тупые щипцы для перемещения твердой мозговой оболочки к сторонам-гое отверстие. Остановить кровотечение с помощью стерильной ватой, смоченной в солевом растворе. Создание отверстия для одного или нескольких MR-совместимых винтов) и вставить их аккуратно в черепе, пока они не являются стабильными. Винты могут быть размещены в любом месте, где они не будут нарушать размещение внешнему разъему для электрода (например, DBS. Не непосредственно позади STN ипсилатерального к электроду). Мы рекомендуем размещения на боковых краев черепа, в идеале непосредственно кзади от лямбда шва. В этот момент череп относительно толстые, уменьшая вероятность, что винты приведет к повреждению коры ". Примечание: Латунные винты сократить до 4-5 мм в длину используются в данном протоколе, хотя пластиковые винты также пригодны.
7. Поместите электрод на стереотаксической руку, гарантируя, что это прямые и вертикальные. Сенсорный электрод к брегмы, затем переместите электрод точно 3,6 мм кзади от брегмы и 2,5 мм сбоку от средней линии и прикоснуться к поверхности корыс электродом. От поверхности коры, вставить электрод 7,8 мм вентрально. Эти координаты определяются ссылкой на нейроанатомической атласа ^1.
8. Место слой зубным цементом по черепу в том числе черепа винтов и точки вставки электрода. Подождите, пока цемент не будет полностью закалены до удаления электрод из стереотаксической рамы. Bend электрод назад и использовать дополнительное цемента, чтобы покрыть остальную часть электрода тракта и разъемом для долговечности.

2. МРТ Подготовка

Вторым шагом является установка для МРТ, включая позиционирование катушки и настройки физиологического мониторинга оборудования.

1. Закрепите голову животного, чтобы предотвратить движение во время сканирования. Примечание: пользовательские пластиковые intraauricular система бар используется здесь для головы фиксации. Поместите баров в ушных каналов и закрепите на головной убор так, чтобы голова вращается плавно в гоэ вертикальное направление, без горизонтального вращения. Зафиксировать положение головы, фиксируя верхние зубы с аппаратом.
2. Обезболить крысу полностью и контролировать конечный приливную CO ₂ для обеспечения стабильности во всех сканов. Для поддержания анестезии, вентиляции и контроль Приливные конечному уровней СО ₂ в процессе проверки, система вентиляции небольшой животное MR-совместимый сочетании с изофлуран испаритель используется здесь, хотя различные анестезирующие средства и седативные средства агентов могут быть использованы аналогичным образом. Установите вентилятор в 45 вдохов / мин с умеренным объем, примерно 500 мл / мин воздуха в качестве исходного объема. Установите изофлурана до 2% и передать крысу в комнату сканирования. Прикрепите выход вентилятора к эндотрахеальной трубки крысы и нажмите, чтобы закрепить. Capnometry должны быть получены с использованием трубку, соединенную настолько близко к разъему эндотрахеальной трубки, как это возможно. Регулировка громкости вентиляции для получения конечного выдоха CO ₂ на 2,6% до 3,3%.
3. Используйте MR-совместимый небольшой держатель животных вставить крысу в сканер с циркулирующим ванну с горячей водой для контроля температуры. Лента площадку ванны на держатель и покрыть ее чистой фильтровальной бумаги. Поместите крысу на кровать горячей воды.
4. Мониторинг температуры и уровня углекислого газа имеют важное значение для СМЕЛЕЙШИЕ МРТ, а насыщенность кислорода в артериальной крови и частоты сердечных сокращений также полезные физиологические параметры. Вставьте MR-совместимый ректального датчика температуры и прикрепить ее к основанию хвоста, а затем регулировать температуру водяной бани для поддержания нормальной температуры тела при 37 ° С Монитор артериального насыщения кислородом и частоту сердечных сокращений с помощью небольшого животного импульса системы оксиметрии, поддержание их на 95-98% и 250-350 ударов в минуту, соответственно, которые могут изменяться в зависимости от типа используемых анестетиков. Насыщение кислородом и частоту сердечных сокращений и влиянием глубины анестезии, объема вентиляции и кратности воздухообмена. Объем Вентиляция и скорость, возможно, потребуетсябыть тщательно сбалансированы для поддержания адекватного конце выдоха со ₂ уровня и адекватного насыщения кислородом.
5. Поверхностную катушку необходимо для смелых приобретения МРТ. Поместите поверхностной катушки как можно ближе к поверхности головки, насколько это возможно. После защиты разместить пасту на поверхности головки на цементном крышкой, чтобы уменьшить восприимчивость артефакты вблизи поверхности головного мозга. Примечание: Мы используем самодельный приемопередатчика поверхностной катушки с внутренним диаметром приблизительно 1,6 см, хотя большие поверхностные катушки может быть используется для оптимизации смелый ответ в глубоких подкорковых областях.
6. Подключите стимулирующий электрод к программируемой системы Электростимуляторы Примечание:. Мы используем на заказ программируемый TTL срабатывания системы, подключенный к биполярной стимулятора поставить электрические импульсы, синхронизированные с РФ возбуждений от MR сканирования.
7. Для седации и паралича во время сбора данных МРТ, использовать коктейль из дексмедетомидина (0,1мг / кг / ч, IP) и панкурония (1 мг / кг / ч, ф), в сочетании с низкой изофлураном дозы на 0,5%, чтобы предотвратить эпилептической активности ^2. Для введения препарата, MR-совместимый шприцевой насос должен быть использован, если насос должен быть размещен в магнитной среде. С другой стороны, noncompatible насос может быть размещен за пределами магнитного среды при условии, что расширенная трубки катетера используется.

3. МРТ данных Acquistion

Третьим шагом является приобретение МРТ, включая позиционирование, шиммирования, анатомических сканирования и функциональных проверок. 9,4 Тесла система с домашним поверхности катушки используется здесь, хотя этот способ может быть приспособлен к другим системам сильного поля и коммерчески сделаны катушек МРТ.

1. Вставка крысу в сканер и положением в центре магнита. Используйте три-самолет разведчик изображение точно по центру крысу внутри магнита по отношению к областях мозга, представляющих интерес, и FastMap прокладок для однородныхNize магнитное поле в регионах, представляющих интерес.
2. Используйте сагиттальной T2-взвешенных RARE последовательность (FOV, 2,56 х 2,56 см ^2; Размер матрицы, 256 х 256; толщина среза, 1,5 мм; TR / TE, 1500/11 мс; РЕДКИЙ фактор, 8; Флип угол, 180 °) чтобы найти местоположение передней спайки, и совместите последующие изображения в этом месте. Совместите восемь-ломтик однозарядное сканирование GE-EPI (FOV, 2,56 х 2,56 см ^2, размер матрицы, 96 х 96, реконструирован в 128 128; толщина среза, 1 мм; TR / TE, 1000/14 мс) и эту точку с корональной ориентации.
3. Для функциональных сканирования, использовать 70 последовательных сканирований РПИ с 1 второй временным разрешением синхронизированной с выходом стимуляции, установленным в 20 сек отдыха, 10 сек стимуляции, а затем на 40 сек отдыха. Разрешить минимум 90 сек между сканирования для обеспечения сосудисто-нервного восстановления. Приобретать несколько повторных сканирований на каждого параметра стимуляции, чтобы улучшить отношение сигнал-шум путем усреднения. Используйте серию фиктивных сканирований (как правило, 4-8) Непосредственно перед сканированием для снижения уровня шума. Подтвердите мощной поддержки в момент получения изображений, чтобы обеспечить успех эксперимента по методу, описанному в разделе 4, хотя усреднение, Корегистрация и череп-зачистки могут быть пропущены в этой обстановке.
4. После функционального завершения сканирования, используйте редкий спин-эхо последовательность T2-взвешенных (FOV, 2,56 х 2,56 см ^2; Размер матрицы, 256 х 256; толщина среза, 1 мм; TR / TE, 2500/33 мс; средних, 8 ) для измерения анатомическом положении электрода в естественных условиях. Приобретать несколько фронтальной и сагиттальной разделы для измерения кончик электрода артефакта вдоль передней / задней, медиальной / боковых и спинных / вентральной осей и подтвердите размещение электродов. Высокое разрешение магнитно-резонансной микроскопии (FOV, 1,8 х 1,28 см; размер матрицы, 360 х 256; толщина среза, 0,5 мм; TR / TE, 2500/12.6 мс; РЕДКИЙ фактор, 8; средние, 280) может быть использован для изучения Точное местоположение электродов тракта после удаления по отношениюв близлежащие нейроанатомических структур и подтвердить достоверность размещения электродов ^3.

4. МРТ обработки и анализа данных

Четвертым шагом является обработка и анализ данных МРТ, в том числе получения карт реагирования и расчета процентов СМЕЛЕЙШИЕ изменения сигнала. Могут быть использованы Пользовательские программы, работающие в вычислительной среде (например, MATLAB) или коммерческие программные средства МРТ (например. SPM, FSL или Afni).

1. Начните с Корегистрация изображений и усреднения данных сначала в рамках объекта съемки по частоте, а затем через-субъектных Примечание:. Мы осуществляем это с помощью СЗМ коды.
2. Выполните череп зачистки для удаления nonbrain ткани с помощью указывается вручную область интереса (ROI) с сигналом порога. Могут быть использованы автоматические алгоритмы череп зачистки.
3. Составление карт реагирования путем расчета коэффициента корреляции отношений между BOLD разрешенииПонсе в течение долгого времени и стимуляции парадигмы для каждого воксела. Отсрочка парадигма несколько секунд к ответственности за задержку в ответ гемодинамики может быть необходимым. Установите значительный уровень при Р <0,05 после коррекции Бонферрони. Могут быть использованы другие статистические методы. Коррекция для множественных сравнений с использованием теории случайных поля или коррекцию кластер уровня на основе гауссовского случайного поля может быть выполнена вместо коррекции Бонферрони для более чувствительного анализа ^4. Примечание: Задержка гемодинамики могут варьироваться в зависимости от областей мозга целевых, фармакологические средства, используемые, и физиологические параметры. Крайне важно, чтобы управлять этими параметрами, чтобы предотвратить изменчивость в пределах объекта съемки и между-субъектов.
4. Количественная мощной поддержки путем определения ROI для извлечения данных по времени курса. Нормальное изменение сигнала процентов во всех вокселов в пределах одной анатомической структуры. Voxel мудрый анализ с использованием общей линейной модели могут быть также использованы ⁵.

Результаты

Типичные функциональные данные были получены в соответствии с приведенной выше протокола в одной крысы с стимулирующего электрода, имплантированного в субталамического ядра на правой стороне. Иллюстрация эфирного установки для DBS МРТ получения изображений представлена ​​на ри...

Обсуждение

Одновременное DBS и МРТ представляет собой многообещающую экспериментальный набор инструментальных средств для идентификации и характеризации глобальных последующих ответов на нервное возбуждение цепи, в естественных условиях. Основным преимуществом этого метода по сравнению ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane (Forane)	Baxter	1001936060
Dexmedetomidine (Dexdomitor)	Pfizer	145108-58-3
Pancuronium Bromide	Selleckchem	S2497
9.4 T Small Animal MRI	Bruker		BioSpec System with BGA-9S gradient
Sterotactic Frame	Kopf		Model 962
Small Animal Ventilator	CWE, Inc.	12-02100	Model SAR-830
Dental Cement	A-M Systems	525000	Teets Cold Curing
MouseOx Plus System	STARR Life Science Corp.
Capnometer	Surgivet, Smith Medical		V9004 Series
Stimulus Isolator	World Precision Instruments		Model A365
MR-compatible Brass Screws	McMaster Carr	94070A031	0-80 thread size, 1/4 in. Can be cut to desired length.
Tungsten Wire	California Fine Wire Company	100211	Used to construct MR-compatible stimulating microelectrode
Syringe Pump	Harvard Appartus		Model PHD 2000 (not MRI-compatible)