JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מספק מתודולוגיות מפורטות לשימוש במבחנים תלת ממדי (3D) לכמת פלישת תאי סרטן השד. באופן ספציפי, אנו דנים בהליכים הנדרשים להקמת מבחני כאלה, כימות, וניתוח נתונים, וכן שיטות לבדיקת ההפסד של שלמות קרום המתרחש כאשר תאים לפלוש.

Abstract

עכשיו זה ידוע היטב כי microenvironment הסלולרי ורקמות הם רגולטורים קריטיים המשפיעים על התחלה של גידול והתקדמות. יתר על כן, המטריצה ​​תאית (ECM) הוכח להיות רגולטור קריטי של התנהגות תא בתרבות ובהומאוסטזיס בגוף חי. הגישה הנוכחית של תאי culturing על דו ממדים (2D), תוצאות משטחי פלסטיק בהפרעה והאובדן של אינטראקציות מורכבות בין תאים וmicroenvironment שלהם. באמצעות השימוש במבחני תרבות תלת ממדי (3D), את התנאים לאינטראקציה התא microenvironment מבוססים דומה microenvironment in vivo. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדל תאי סרטן השד במטריצת חלבון קרום במרתף 3D, הממחיש את הפוטנציאל של תרבות 3D בהערכת פלישת תא לסביבה. בנוסף, אנו דנים כיצד יש מבחני 3D אלה הפוטנציאל לבדיקת ההפסד של איתות Molecules המווסתים את מורפולוגיה אפיתל ידי immunostaining הליכים. מחקרים אלה יסייעו לזהות פרטים מכניסטית חשובים לתהליכי ויסות פלישה, הנדרשים להתפשטות סרטן השד.

Introduction

הגירה ופלישה של תאים בודדים או קולקטיביים הן שני סימני ההיכר של סרטן, ונדרשת להתפשטות הגרורה של תאי סרטן 1-4. היכולת של תאי סרטן ליזום גרורות תלויה ביכולתם להגר ולפלוש לרקמות השכנות באמצעות invadopodia כדי לבזות את הקרום במרתף של התאים. Invadopodia הם בליטות אקטין עשיר דינמיות השפלה מטריקס המאפשרות פירוק של המטריצה ​​תאית באמצעות השחרור של פרוטאזות משפילות מטריצת 5. פלישת תאי הסרטן כרוכה בהשפלה של המטריצה ​​ואחרי הנדידה של התאים הסרטניים וזה מלווה בארגון מחדש של סביבת המטריצה ​​תלת ממדי (3D) 2. לכן, כדי לחדור דרך המטריצה, תא חייב לשנות את צורתו ואינטראקציה עם מטריקס תאי (ECM) 2.

השמירה על שלמות רקמת שד תלויה בחוזקה controlleארכיטקטורת רקמת ד מאז צמתים הידבקות התא-ECM ותאי תאים משפיעים על ביטוי גנים ושיבוש של קוטביות אפיתל יכולה להוביל להופעת הסרטן 6-10. עם זאת, רוב המבחנה הגירה ופלישת מבחני בכגון transwell מבחני לשכה או מבחני פצע שריטה הם דו ממדי (2D) ולכן אלה להזניח את האינטראקציות המורכבות בין תאים וסביבתם הסמוכות 3,6,8,11-14. הבדלים מורפולוגיים ותפקודיים ניכרים, כולל שינויים במורפולוגיה תאית, התמיינות תאים, הידבקויות של תאי המטריצה ​​ודפוסי ביטוי גנים כבר זוהו על ידי תאי culturing בתרבויות 3D שחסרי בדרך כלל במבחני 2D 2,6,8,11. לכן, משתמש במבחני 3D הם מועילים באופן משמעותי במשחזר יותר פיסיולוגי במצב vivo, שמוביל לתרגום טוב יותר של ממצאי פורצי דרך במחקר בסיסי למרפאת 6-10. עם זאת, יש לצייןלמרות היתרונות רבים שנצברו בשימוש בתרבויות 3D, מודל זה לא יכול לתפוס את כל המורכבות של in vivo microenvironment הגידול הכולל סוגים שונים של תאים. עם זאת, ניתן לשלב את תאי סטרומה לתוך המודלים 3D (לדוגמא, fibroblasts, כדוריות דם לבנות, ומקרופאגים) כדי לחקור את ההשפעה של אינטראקציות גידולים סטרומה בהידבקות תאים סרטניים ופלישה 15-17.

תאי אפיתל שד בתרבות לגדול בצורה היעילה ביותר כאשר חלבוני ECM כגון laminin וקולגן הם הווה. עם זה ידוע, תערובת מטריצה ​​זמינה מסחרי כבר נגזרה Engelbreth-Holm-הנחיל (EHS) גידול עכברי והוא ידוע בתור מטריצת קרום במרתף Matrigel 2,8. מספר טכניקות הוקמו כדי לגדל תאי האפיתל כמושבות 3D במטריצת קרום במרתף 2,8. מודל מטריצת 3D מרתף הקרום הוא יעיל להקמת תא שד הן ממאיר ושאינו ממאירצמיחה, שמזכיר את מה שמתרחש בסביבה vivo 18,19. תאי MCF10A הם תאי אפיתל החלב שאינו ממאירים. כאשר גדלו במטריצת קרום במרתף, תערוכת תאים אלה בתכונות vivo של תאי שד נורמלים ועוברים בשליטת התפשטות תאים, קיטוב תא, ואפופטוזיס להקים מרחב הלום 8,12,20. יתר על כן, הופעתו של גרעין תא של תאי MCF10A להרכיב acini בתרבויות 3D דומה יותר לאלו של תאי אפיתל החלב ברקמה מאלה בתרבית monolayer 21. מחקרים על ידי יסל ועמיתיו היו הראשונים לחשוף שיכולים להיות מובחנים תאי שד ממאירים מתאי שד אינו ממאירים כאשר גדלו בסביבת laminin עשיר, שכן התאים הממאירים להציג פנוטיפ לא מאורגן מאוד, גדל בהתפשטות, ירידה בתא אל הידבקות תא, ביטוי מוגבר של סמני mesenchymal וגידול במספר של מבנה פולשנית נוצרו 3,6,22.

חריגות של סביבת התא יכולות להשפיע על היווצרות גידול 20. שיטת תרבות 3D יכול לשמש כדי לחקור ביעילות את התקשורת המתרחשת בין התאים הסרטניים וסביבתם ולקבוע כיצד 14,20,21,23 תקשורת כגון השפעות ביטוי חלבון. מאמר זה מספק מתודולוגיה מפורטת לגדול מד"א-MB-231 תאי סרטן השד בתרביות 3D לנתח הפולשנות, וללמוד את האובדן של מורפולוגיה האפיתל באמצעות laminin סמן אפיתל, מרכיב של הקרום במרתף תא 18,19,24, 25. הנהלים מפורטים לספק את היכולת במדויק וreproducibly לכמת stellate היווצרות מבנה (פולשנית) על ידי כל תא סרטן פולשני ולא מגבילה לשורות תאי סרטן שד השכיח (כגון מד"א-MB-231, Hs578T, MCF-7, או T47D ). לפיכך, assay זה יכול לשמש כפלטפורמה להערכה איך ביטוי חלבון בתאים או בטיפול בפרו או אנטיתרכובות פולשנית להסדיר השפלה מטריצה ​​תאית, על ידי תאים בודדים או מרובים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. תרבות תלת ממדית של תאי סרטן השד בממברנה מטריקס מרתף (טכניקת Embedment)

  1. מטריצת קרום במרתף טיפול Matrigel: הפשירו על קרח לילה בשעה 4 ° C. מטריצת קרום במרתף היא נוזלית בטמפרטורה נמוכה, אבל מתמצקת בטמפרטורת חדר. שמור על מטריצת קרום במרתף על קרח (1A-B איורים).
  2. מכסה את צלחת Confocal מס '1 זכוכית תחתונה עם 50 μl של מטריצת קרום מרתף באמצעות הפצת המטריצה ​​באמצעות קצה Pipetman P-200 בתבנית ספירלה (איור 1 ג). היזהר בעת הפצת מטריצת הקרום במרתף, כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר. כמו כן, להימנע מלהפיץ את המטריצה ​​כדי לסגור את גבולותיה של צלחת הזכוכית תחתונה כדי למנוע היווצרות מניסקוס. אם מטריצת קרום במרתף טיפול חסר ניסיון, אז precooled הצלחת, P-200 Pipetman וטפטפות יכולה להיות על קרח (משמאל לחלופין הלילה במקרר ב 4 מעלות צלזיוס). הצעות צעד זהזמן נוסף כדי להפיץ את מטריצת קרום במרתף לפני ההתמצקות. מניחים את הצלחת (ES) בתרבית תאי חממה (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) לפחות 30 דקות כדי לאפשר את מטריצת קרום במרתף כדי לחזק (1D איור).
  3. בעוד המטריצה ​​עוברת מיצוק, trypsinize 70-80% צלחת 100 מ"מ מחוברות של תאים. ברגע שהתאים החלו מרימים את הצלחת, resuspend אותם ב10 מיליליטר של RPMI 1640 בינוני המכיל 10% (v / v) בסרום שור העובר (FBS), כדי להשבית טריפסין (איור 1E). לאחר מכן להעביר את תאי resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר (איור 1F).
  4. ספין התאים (הנמצאים בצינור חרוטי) בשעה 3 דקות 100 XG בצנטריפוגה בתרבית תאים ייעודית (איורים 1G-H).
  5. בעוד שהתאים נמצאים הסתחררו למטה, aliquot 50 μl של מטריקס לתוך צינור מיליליטר 1 microcentrifuge (הערה: כל מנה עם רצפת זכוכית מוקצה צינור microcentrifuge אחד, ולכן, אםהניסוי דורש 3 מנות, אז המסקנה הוא ש3 צינורות microcentrifuge נחוצים גם כן), ולאחר מכן למקם את הצינור על קרח (איור 1).
  6. לשאוב את המדיום מצינור חרוטי משלב 1.4, תוך השארת גלולה ללא הפרעה (איור 1I). תאי resuspend (כי כבר הסתחררו למטה) ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS (איור 1J).
  7. ברגע שהתאים נספרים באמצעות hemocytometer (איור 1K), או aliquot חלקיקי דלפק תא 2.5 x 10 4 תאים לתוך צינור microcentrifuge והדיפו אותה באמצעות תקשורת המתאימה כדי להשיג נפח כולל של 50 μl (איור 1 ליטר).
  8. מערבבים את התאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה ​​מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μl (איור 1M).
  9. בעדינות צלחת של המטריצה ​​100 μl: תערובת תאים מצעד 1.8 על יםמנה olidified קרום במרתף מצופה מטריצה ​​מהשלב 1.2 (איור 1N). זה מאפשר לתאים להיות משובצים במטריצת קרום במרתף.
  10. מעביר את הצלחת (es) לתוך חממת תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) ולאפשר למטריקס: תערובת תא כדי לחזק לפחות 30 דקות.
  11. ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS לצלחת (איור 1o) ולקחת את הצלחת בחזרה החממה שבה יאוחסן לשארית של הניסוי (איור 1P).
  12. שינוי בתקשורת בכל יום לתקופה של 5 ימים (או כמו לכל נדרש לassay; משך assay למד"א-MB-231 תאים הוא 5 ימים באורך).
  13. באמצעות מיקרוסקופ אור, לקחת התערבות ההפרש לעומת זאת תמונות (DIC) של מושבות מד"א-MB-231 התלויות במטריצת קרום במרתף (איור 3 א). 20 אזורי נציג התמונה ב10X אובייקטיבי פעם ביוםבמשך חמישה ימים כדי לקבוע המורפוגנזה מושבה (איור 3 ג).
  14. ניתוח תמונות בצורה עיוורת כדי לקבוע היווצרות stellate מושבה תא (איור 3 ב). מושבה נחשבת להיות stellate אם תחזיות אחד או יותר מאליפטית של תאים נתפסות. כדי לקבוע את אחוז מושבות stellate פולשנית, יש לחלק את מספר מושבות stellate במספר הכולל של תא מושבות לכל תמונה שנרכשה, ולאחר מכן בממוצע אחוזי מושבות stellate של 20 תמונות עבור כל יום.

figure-protocol-4515
איור 1. תרבות תלת ממדית של מד"א-MB-231 תאי סרטן השד במטריצת קרום במרתף (טכניקת embedment). א.ב.) סכמטי של הגדרת הניסוי (שבוצעה במנדף). ג) גם של המנה עם תחתית הזכוכית המצופהעם 50 μl של מטריצת קרום במרתף נטוורק. ד) (ES) ממוקם בחממה תרבות תא (על 37 מעלות צלזיוס עם CO 2 של 5%) על מנת לאפשר את מטריקס לבסס לפחות 30 דקות תאים. ה) היו trypsinized. F ) תאים היו resuspended לתוך צינור חרוטי 15 מיליליטר תאים. GH) (כיום בצינור חרוטי) היו סובבים מטה ב100 XG במשך 3 דקות בצנטריפוגה בתרבית רקמה.) תא גלולה תאים. J) (כי כבר הסתחררו למטה) היו resuspended ב 1 מיליליטר של מדיום RPMI בתוספת-FBS. תאי K) נספרו באמצעות hemocytometer. L) 2.5 x 10 תאים 4 aliquoted לתוך צינור microcentrifuge ועקפו את השימוש במדיה מתאימים בכדי להשיג נפח כולל של 50 μl. M ) מערבבים תאים מצעד 1.7 (25,000 תאים ב50 μl) עם צינור microcentrifuge המכיל מטריצה ​​מצעד 1.5 ביחס של 1:1; נפח סופי יהיה 100 μ.; L N) בעדינות צלחת של המטריצה ​​100 μl: תערובת תאים משלב 8 על הצלחת מצופה מטריצה ​​הקרושה משלב 1.2 O) ברגע שהמטריצה: תערובת תא הקרושה, להוסיף 2 מיליליטר של תקשורת RPMI בתוספת-FBS ל. המנה. P) מניחים את הצלחת בחממה שבה תאוחסן לשארית של הניסוי.

2. בחינת תכונות morphogenic של תרבויות 3D עם Immunofluorescence

  1. הגדר את מגש קרח, פתרון שנאגרו פוספט הקר (PBS), אצטון 20%: מתנול 80% (פתרון מקבע), ו -3% אלבומין בסרום שור (BSA; חסימת פתרון) (איור 2 א) לפני שלקחת את המנה (ES) מן החממה.
  2. מניחים את הצלחת (ES) בתקשורת מגש הקרח ולשאוב, ולאחר מכן לשטוף 3x עם 2 מיליליטר של PBS הקר (איור 2).
  3. ברגע לשטוף PBS האחרון להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של אצטון 20%: 80% פתרון מתנול לתוך הצלחת (es) (איור 2C ) כדי לתקן את התאים ל20 דקות ב 4 ° C (או על קרח, או במקרר) (איור 2 ד).
  4. ברגע ש20 דקות קיבוע הוא הופסק, להביא את המנות בחזרה בטמפרטורת חדר, לשאוב מקבע, ולאחר מכן לשטוף 3x עם PBS. ברגע לשטוף PBS הסופי להישאף, להוסיף 2 מיליליטר של BSA 3% למנה (es) לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר (2E איור).
  5. במהלך תקופת החסימה להכין דילולים של (V laminin 1:100) הראשוני ונוגדנים משני (בדילול מתאים) מומסים ב3% אלבומין בסרום שור (BSA) חסימת חיץ. אנא שים לב כי 400-500 μl הפתרון 'BSA + נוגדן ראשוני' יש להוסיף על גבי המטריצה ​​ישירות: תערובת תא.
  6. לאחר דקות 30 של חסימה שפגו תוקפיו, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר (איור 2F). שים לב שאין שוטף PBS צריך להתבצע הבא blockin 30 דקותתקופה גרם.
  7. עם השלמת השלב 2.6, להסיר את הפתרון 'BSA + עיקרי נוגדנים', ולשטוף 3x עם PBS.
  8. מוסיף את הנוגדנים משני מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) ישירות על גבי המטריצה: תערובת תא, מכסה את הכלים ודגירה במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר (איור 2G).
  9. הסר את פתרון 'BSA + נוגדנים משני', ולשטוף 3x עם PBS.
  10. הוסף 2 מיליליטר של Hoechst 33258 (1:10,000) מומס PBS עבור מכתים גרעינים, ודגירה של 5 דקות בנייר אלומיניום (או מכסים במכל אטום להגביל photobleaching) (איור 2H).
  11. לאחר 5 דקות של דגירה עם 33258t Hoechst פקעו, לשטוף את הצלחת (es) 5x עם PBS.
  12. הוסף בינוני הרכבה ישירות על גבי מטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal ולכסות עם coverslip זכוכית בזהירות כדי למנוע גרימת כל שיבושים ביושרה של המושבות במתרי קרום במרתףx: תערובת תא (איור 2 ט).
  13. לאפשר את הצלחת (ES) לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר (איור 2 ט). לאחר יבש, הצלחת (es) יכולה להיות מאוחסנת ב -20 מעלות צלזיוס, אבל זה מאוד מומלץ כי הם צריכים להיות צילמו במהירות אפשרית.
  14. לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם אורכי גל לייזר מתאימים של נוגדנים המשמשים (איורים 3D-E).

figure-protocol-9265
איור 2. בחינה של תרבויות 3D על ידי immunofluorescence. .) סכמטי של הגדרת ניסוי כלים ב) (ES) שהונח על מגש הקרח ותקשורת להישאף; לאחר מכן תאים נשטפו שלוש פעמים עם 2 מיליליטר של PBS הקר C) 2 מיליליטר של אצטון 20%:. 80% פתרון מתנול הוסיף למנה () es ד ') לתקן את התאים ל.20 דקות ב 4 ° C (או על קרח, או במקרר). E) 2 מיליליטר של BSA 3% הוסיפו למנה () es לחסום לפחות 30 דקות בטמפרטורת חדר. F) לאחר דקות 30 של חסימה פקעה, מוסיף את הנוגדנים הראשוניים ודגירה במשך שעה לפחות 1 בטמפרטורת חדר G) נוגדנים משניים מומסים בBSA 3% (בדילול מתאים) נוספו על גבי מטריצת הקרום במרתף ישירות:. תערובת תא; . לאחר מכן מנות מכוסות וטופחו במשך שעה 1 בטמפרטורת חדר H) 2 מיליליטר של Hoechst (1:10,000; מומס PBS) הוסיף לdishe (ES) והתאים טופח במשך 5 דקות בנייר אלומיניום הבינוני) הרכבה הוסיף באופן ישיר. על גבי המטריצה: תערובת תאים בצלחת confocal והצלחת מכוסה בזכוכית coverslip. מנה (es) עזבה לייבוש למשך לילה (או 24hr) בטמפרטורת חדר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

דוגמא של תאי מד"א-MB-231 הפולשים במטריקס 3D מתואר באיור 3 ג. התאים משובצים במטריצה ​​(יום 1), ולהתחיל להרכיב מבנים פולשנית (stellate) על ידי יום 3, ולפלוש לחלוטין לתוך המטריצה ​​ביום 5 (איור 3 ג). מספר מושבות stellate נוצרות נספרים, והביע כאחוז ממספר הכולל של מושב...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

הפיתוח של טכניקות תרבית תאי 3D אפשר לחוקרים ללמוד את השינוי של תאי אפיתל שד, ומאפשר לנו לחזות את השינויים מורפולוגיים הדרמטיים. חוץ מניתוח פלישת תא, יכולים לשמש הספרואידים אפיתל החלב היחיד או רב תאיים כדי להעריך את השינויים בהידבקות הסלולר, התפשטות, גודל, וקוטביות הבז?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

יש לנו מה למסור.

Acknowledgements

This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 ml tubesVWRCA10011-700Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003VWRCABD353003Sterile, disposable
15 ml Falcon tubeVWRCA21008-918Sterile, disposable
1 ml filtered tipsVWR10011-350Sterile, disposable
200 μl filtered tipsVWR22234-016Sterile, disposable
20 μl filtered tipsVWR22234-008Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes MatTek CorporationP35G-1.0-14-CPrecooled before use
Bovine serum albumin (BSA)BioShopALB003.100Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbedLife Technologies A110291:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) AntibodyLife Technologies A110111:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin BD Transduction Laboratories610153Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS)SigmaF1051Used at 10% (v/v) 
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in WaterLife TechnologiesH3569Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite Media CyberneticsUsed for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)EZ BiolabsPT0512100601Used at 100 nM 
Anti-Laminin CedarlaneAB19012(CH)Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope ZeissUsed at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237)VWRCACB356237 Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope OlympusUsed for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)Life Technologies15140-122Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipetteVWRCA53300-523Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with GlutamineLife Technologies11875-119Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol RedLife Technologies25200-072Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)LonzaCC-3150Used for culturing of MCF10A cells

References

  1. Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
  2. Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
  3. Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
  4. Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
  5. Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
  6. Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
  7. Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
  8. Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
  9. Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
  10. Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
  11. Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
  12. Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
  13. Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
  14. Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
  15. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  16. Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
  17. Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
  18. Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
  19. Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
  20. Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
  21. Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
  22. Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
  23. Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
  24. Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
  25. Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88ECM3DimmunocytochemistryMatrigel

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved