Quantificação de cancro da mama invasiva das células usando um modelo (3D) tridimensional

Resumo

Este artigo proporciona metodologias detalhadas para a utilização de ensaios tridimensionais (3D), para quantificar a invasão das células do cancro da mama. Especificamente, vamos discutir os procedimentos necessários para a criação de tais ensaios, quantificação e análise de dados, bem como métodos para analisar a perda da integridade da membrana que ocorre quando as células invadem.

Resumo

É agora bem conhecido que o microambiente celular e do tecido são reguladores críticos que influenciam a iniciação e progressão tumoral. Além disso, a matriz extracelular (ECM) tem sido demonstrado ser um regulador crítico do comportamento das células em cultura e na homeostase in vivo. A abordagem actual de cultura de células em duas dimensões (2D), superfícies de plástico resulta na perturbação e perda de interacções complexas entre as células e o seu microambiente. Através do uso de três dimensões (3D) de ensaios de cultura, são estabelecidas as condições para a interacção célula-microambiente que se assemelha ao microambiente in vivo. Este artigo fornece uma metodologia detalhada para cultivar células de câncer de mama em uma matriz de proteínas de membrana basal 3D, exemplificando o potencial da cultura 3D na avaliação da invasão celular no ambiente circundante. Além disso, iremos discutir como estes ensaios 3D tem o potencial para analisar a perda de sinalização Molecules que regulam a morfologia epitelial por imunomarcação procedimentos. Estes estudos ajudar a identificar detalhes importantes mecanicistas nos processos que regulam a invasão, necessários para a propagação do câncer de mama.

Introdução

Migração e invasão de células individuais ou coletivas são duas características de câncer, e necessário para a propagação metastática de células de câncer ^1-4. A capacidade de células cancerígenas para iniciar metástase depende da sua capacidade para migrar e invadem o tecido vizinho usando invadopodia para degradar a membrana basal das células. Invadopodia são saliências de degradação da matriz dinâmica ricas em actina que permitem a degradação da matriz extracelular através da liberação de proteases que degradam a matriz ^5. Invasão de células do cancro envolve a degradação da matriz seguindo-se a migração das células cancerosas e isto é acompanhado de uma reorganização do ambiente da matriz tridimensional (3D) ^2. Assim, para penetrar através da matriz, uma célula deve transformar a sua forma e interagir com a matriz extracelular (ECM) ^2.

A manutenção da integridade do tecido mamário depende fortemente controlled arquitectura dos tecidos, uma vez junções célula-ECM e de adesão célula-célula influenciar a expressão genética e a interrupção da polaridade epitelial pode levar ao aparecimento de cancro ^6-10. No entanto, a maioria dos in vitro de migração e invasão ensaios como transwell ensaios de câmara ou ensaios ferida-risco são bidimensionais (2D) e, portanto, estes negligenciar as interações complexas entre as células e seu meio ambiente adjacente ^3,6,8,11-14. Diversidades morfológicas e funcionais consideráveis, incluindo variações na morfologia celular, diferenciação celular, adesões célula-matriz e os padrões de expressão gênica foram detectados através da cultura de células em culturas 3D que são comumente faltando em 2D ensaia ^2,6,8,11. Assim, a utilização de testes de 3D ​​são significativamente benéfico em recapitulando a mais fisiológica em condições in vivo, levando a uma melhor tradução das descobertas revolucionárias em pesquisa básica para a clínica ^6-10. No entanto, deve-se notar, Apesar das muitas vantagens obtidas com a utilização de culturas em 3D, este modelo não pode capturar todas as complexidades do microambiente do tumor in vivo, que inclui vários tipos de células. No entanto, é possível incorporar células estromais em modelos 3D (por exemplo, os fibroblastos, leucócitos e macrófagos) para estudar o efeito da interação tumor-estroma na adesão célula cancerosa e invasão ^15-17.

Células epiteliais de mama em cultura crescer de forma mais eficaz quando as proteínas da MEC, como laminina e colágeno estão presentes. Com esta conhecida, uma mistura de matriz comercialmente disponível foi derivado de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) de tumor murino e é conhecido como matriz da membrana basal ^2,8 Matrigel. Um número de técnicas têm sido estabelecido para cultivar células epiteliais como colónias em 3D da matriz da membrana basal ^2,8. O modelo da matriz da membrana basal 3D é eficaz para o estabelecimento de células da mama, tanto malignas e não malignascrescimento, assemelhando-se o que está ocorrendo no ambiente in vivo ^18,19. MCF10A células são células epiteliais mamarias não malignas. Quando crescido na matriz da membrana basal, estas células apresentam características de in vivo de células da mama normais e submetidos a proliferação celular, a polarização celular, apoptose e para estabelecer o espaço lúmen ^8,12,20 controlada. Além disso, a aparência de núcleos de células de células que formam MCF10A ácinos em culturas 3D mais se assemelham aos de células epiteliais mamárias de tecido do que os cultivados em monocamada de ^21. Estudos por Bissell e colegas foram os primeiros a mostrar que as células malignas da mama podem ser diferenciadas a partir de células não-malignas da mama, quando cultivada em um ambiente rico em laminina, uma vez que as células apresentam um fenótipo maligno altamente desorganizada, a proliferação aumentada, diminuída da célula-a- a adesão celular, o aumento da expressão de marcadores mesenquimais e um aumento no número de estrutura invasiva formado ^3,6,22.

Anormalidades do ambiente celular pode influenciar a formação do tumor ^20. O método de cultura em 3D podem ser utilizados para estudar a eficácia de comunicação que ocorre entre as células tumorais e o seu ambiente envolvente e determinar a expressão de proteínas tais influências ^14,20,21,23 comunicação. Este artigo estabelece uma metodologia detalhada para crescer MDA-MB-231 de cancro da mama em culturas em 3D para analisar invasão e para estudar a perda de morfologia epitelial utilizando um marcador epitelial laminina, um componente da membrana basal de células ^{18,19,24, 25.} Os procedimentos detalhados fornecem a capacidade de quantificar com precisão e de forma reprodutível estreladas (invasiva) de formação da estrutura por qualquer célula de cancro invasivo e não se limitando a linhas celulares de cancro da mama (comum, tais como MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, ou T47D ). Assim, este ensaio pode servir como uma plataforma para avaliação da forma como a expressão da proteína em células ou tratamento com pro-ou anti-compostos invasivos regulam a degradação da matriz extracelular, pelas células únicas ou múltiplas.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocolo

1. Cultura tridimensional de células de câncer de mama em Membrana Basal Matrix (A Técnica Embedment)

1. Manuseio matriz membrana basal Matrigel: Descongele no gelo durante a noite a 4 ° C. Matriz da membrana basal é líquido a baixa temperatura mas solidifica à temperatura ambiente. Mantenha a matriz da membrana basal em gelo (Figuras 1A-B).
2. Cobrir a No.1 prato confocal com fundo de vidro com 50 ul de matriz da membrana basal por meio de difusão da matriz, utilizando a ponta de uma P-200 Pipetman num padrão em espiral (Figura 1C). Tenha cuidado ao espalhar a matriz da membrana basal para evitar a formação de bolhas de ar. Da mesma forma, evitar a propagação da matriz para fechar as fronteiras do prato fundo de vidro para evitar a formação de menisco. Se a matriz de membrana basal manuseamento inexperiente, em seguida, pré-arrefecido a louça, P-200 Pipetman e pipetas pode ser em gelo (em alternativa, deixado durante a noite num frigorífico a 4 ° C). Este passo ofertastempo adicional para espalhar a matriz da membrana basal antes de solidificação. Colocar a cápsula (s) numa incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO ₂₎ durante pelo menos 30 minutos para permitir que a matriz da membrana basal para solidificar (Figura 1D).
3. Enquanto a matriz é submetido a solidificação, trypsinize confluente de 100 mm de placa de células de 70-80%. Uma vez que as células tenham começado a levantar para fora da placa, ressuspender-los em 10 ml de meio RPMI 1640 contendo 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS), para inactivar a tripsina (Figura 1E). Em seguida, transferir as células ressuspensas para um tubo cónico de 15 ml (Figura 1F).
4. Rodar as células (presente no tubo cónico) a 100 xg durante 3 minutos em uma centrífuga de cultura celular dedicado (Figuras 1G-H).
5. Enquanto as células estão a ser girado para baixo, alíquota de 50 ul de matriz para um tubo de microcentrífuga de 1 ml (nota: cada prato de vidro de fundo é atribuído um tubo de microcentrífuga, portanto, sea experiência requer três pratos, então segue-se que três tubos de microcentrífuga também são necessários), e, em seguida, colocar o tubo em gelo (Figura 1B).
6. Aspirar o meio do tubo cónico da etapa 1.4, mas deixando a pelota não perturbadas (Figura 1I). Suspenda as células (que foram giradas para baixo) em 1 ml de meio RPMI suplementado com FBS (Figura 1J).
7. Uma vez que as células são contadas utilizando um hemocitómetro (Figura 1K), ou um contador de partículas alíquota de células de 2,5 x 10 ⁴ células para dentro do tubo de microcentrífuga e ainda por cima utilizando os meios adequados, de modo a obter um volume total de 50 ul (Figura 1D).
8. Misturar as células do passo 1.7 (25.000 células em 50 mL) com o tubo de microcentrífuga contendo matriz a partir do passo 1.5, em uma proporção de 1:1; o volume final será de 100 ul (Figura 1M).
9. Suavemente prato 100 ul da matriz: mistura de células a partir do passo 1.8 para a solidified membrana basal revestida de matriz prato a partir do passo 1.2 (Figura 1 N). Isto permite a células a ser incorporado na matriz de membrana basal.
10. Colocar a cápsula (s) para a incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO ₂₎ e permitir que a matriz de: mistura de células para solidificar, pelo menos, 30 min.
11. Uma vez que a matriz: mistura de células é solidificado, adicionar 2 ml de meio RPMI suplementado com FBS para o prato (Figura 1O) e levar o prato de volta na incubadora onde vai ser armazenado para o resto da experiência (Figura 1P).
12. Mudar mídia todos os dias durante um período de 5 dias (ou conforme exigido para um ensaio, da duração do ensaio para MDA-MB-231 é de 5 dias de duração).
13. Usando um microscópio de luz, tomar contraste de interferência diferencial (DIC) imagens dos MDA-MB-231 colónias em suspensão na matriz da membrana basal (Figura 3A). Imagem 20 áreas representativas a 10X objetivo uma vez por diadurante cinco dias, para determinar a colónia morfogénese (Figura 3C).
14. Analisar imagens cegamente para determinar a formação de colónias de células estreladas (Figura 3B). Uma colónia é considerada estreladas se uma ou mais projecções de esferóide das células são percebidos. Para determinar o percentual de colônias estreladas invasivos, divida o número de colônias estreladas pelo número total de colônias de células por imagem adquirida, e, em seguida, a média das colônias estreladas percentagens dos 20 imagens para cada dia.

Figura 1. Cultura tridimensional de MDA-MB-231 de cancro da mama na matriz da membrana basal (a técnica de acamamento). AB) Um esquema da montagem experimental (realizada na coifa). C) O bem do prato fundo de vidro revestidocom 50 ul de matriz de membrana basal D) do prato. (es) colocado numa incubadora de cultura de células (a 37 ° C com 5% de CO ₂₎ para permitir que a matriz para solidificar, pelo menos, 30 min.) E As células foram tratadas com tripsina. F ) As células foram ressuspensas em um tubo de 15 ml. GH) (presente em células tubo cónico) foram centrifugadas a 100 xg durante 3 minutos em uma centrífuga de cultura de tecidos. I) da pelota celular. J) As células (que foram fiados para baixo) foram ressuspensas em 1 ml de meio RPMI suplementado com FBS. K) As células foram contadas utilizando um hemocitómetro. G) 2.5 x 10 ⁴ alíquotas de células no tubo de microcentrífuga e com tampo utilizando os meios adequados, de modo a obter um volume total de 50 ul. M ) Misturar as células do passo 1.7 (25.000 células em 50 mL) com o tubo de microcentrífuga contendo matriz a partir do passo 1.5, em uma proporção de 1:1; o volume final será de 100 μ.; L N) Gently placa de 100 mL da matriz: mistura de células a partir do passo 8 para o prato revestido de matriz solidificada a partir do passo 1.2 O) Uma vez que a matriz: mistura de células é solidificado, adicionar 2 ml de meio RPMI suplementado com FBS a. o prato. P) Coloque o recipiente na incubadora, onde serão armazenados para o resto da experiência.

2. Exame de Características morfogênicas de culturas 3D com Imunofluorescência

1. Configurar uma bandeja de gelo, fosfato frio solução tamponada (PBS), 20% de acetona: 80% de metanol (a solução fixadora) e 3% de albumina de soro bovino (BSA; solução de bloqueio) (Figura 2A) para retirar a cápsula (es) da incubadora.
2. Colocar a cápsula (s) no suporte de tabuleiro de gelo e aspirado, em seguida, lavar 3x com 2 ml de PBS frio (Figura 2B).
3. Depois da última lavagem de PBS é aspirado, adicionar 2 ml de 20% de acetona: solução de metanol a 80% para o prato (s) (Figura 2C ) para fixar as células durante 20 min a 4 ° C (ou em gelo ou num refrigerador) (Figura 2D).
4. Uma vez que a 20 min de fixação é terminada, os pratos trazer de volta à temperatura ambiente, aspirar o fixador, e, subsequentemente, lavar 3x com PBS. Uma vez que a última lavagem de PBS é aspirado, adicionar 2 ml de BSA a 3% para o prato (s) para bloquear durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente (Figura 2E).
5. Durante o período de bloqueio preparar diluições de primário (laminina V 1:100) e anticorpos secundários (a uma diluição adequada) dissolvidos em 3% de albumina sérica bovina (BSA), um tampão de bloqueio. Por favor, note que a 400-500 mL da solução "BSA + anticorpo primário 'deve ser adicionado diretamente na matriz: mistura de células.
6. Uma vez a 30 minutos de bloqueio ter expirado, adicionar os anticorpos primários e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente (Figura 2F). Por favor, note que não lavagens PBS deve ser realizada após a 30 min blockinperíodo g.
7. Após a conclusão do passo 2.6, remover a solução de BSA + anticorpo primário ", e lavar 3x com PBS.
8. Adicionar o anticorpo secundário dissolvido em BSA a 3% (a uma diluição adequada) directamente sobre a matriz de: mistura de células, cobrir os pratos e incubar durante 1 hora à temperatura ambiente (Figura 2G).
9. Remover a solução de BSA + anticorpo secundário ", e lavar 3x com PBS.
10. Adicionar 2 ml de Hoechst 33258 (1:10.000) dissolvidos em PBS para a coloração de núcleos, e incubar durante 5 minutos, sob uma folha de alumínio (ou cobrir com um recipiente opaco para limitar a fotodegradação) (Figura 2H).
11. Uma vez que a 5 min de incubação com Hoechst 33258t ter expirado, lave o prato (s) de 5x com PBS.
12. Adicionar meio de montagem diretamente na matriz: mistura de células no prato confocal e cobrir com lamela de vidro com cuidado para evitar induzir quaisquer interrupções para a integridade das colônias no matri membrana basalx: mistura de células (Figura 2I).
13. Colocar a placa (s) para secar durante a noite (ou 24 horas) à temperatura ambiente (Figura 2I). Depois de seco, o prato (s) pode ser armazenada a -20 ° C, mas é altamente recomendado que eles devem ser trabalhada, tão rapidamente quanto possível.
14. Adquirir imagens utilizando um microscópio de fluorescência com comprimentos de onda de laser adequados de anticorpos utilizados (Figuras 3D-E).

Figura 2. Exame de culturas em 3D, por imunofluorescência. . A) Um esquema do arranjo experimental B) Dish (es) colocado na bandeja de gelo e mídia aspirado; subsequentemente, as células foram lavadas três vezes com 2 ml de PBS frio C) 2 mL de acetona a 20%:. solução de metanol a 80% adicionado no prato (s) D) para corrigir as células.20 min a 4 ° C (ou em gelo ou num refrigerador). E) 2 ml de BSA a 3% adicionado ao prato (s) para bloquear durante pelo menos 30 min à temperatura ambiente. F) Uma vez que a 30 min de bloqueio ter expirado, adicionar os anticorpos primários e incubar durante pelo menos uma hora à temperatura ambiente G) os anticorpos secundários dissolvidas em BSA a 3% (a uma diluição adequada) foram adicionadas directamente sobre a matriz de membrana basal:. mistura de células; . subsequentemente pratos coberta e incubada durante 1 hr à temperatura ambiente H) 2 ml de Hoechst (1:10.000; dissolvida em PBS) adicionado ao dishe (es) e as células incubadas durante 5 minutos sob uma folha de alumínio I) meio de montagem adicionado directamente. sobre a matriz: mistura de células no prato confocal e o prato é coberta com lamela de vidro. Prato (s) deixa-se secar durante a noite (ou 24 horas) à temperatura ambiente.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Resultados

Um exemplo de MDA-MB-231 em células invasoras matriz 3D é ilustrada na Figura 3C. As células são incorporados na matriz (Dia 1) e começam a formar-(estreladas) estruturas invasoras no Dia 3, e invadir completamente para dentro da matriz por Dia 5 (Figura 3C). O número de colónias formadas estreladas são contadas, e expressas como uma percentagem do número total de colónias por placa (invasivos e não invasivos). Além disso, uma vez que as medições são feitas diariamente du...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussão

O desenvolvimento das técnicas de cultura de células em 3D tem permitido aos investigadores estudar a transformação de células epiteliais da mama, o que nos permite visualizar as alterações morfológicas drásticas. Além de analisar a invasão da célula, os esferóides epiteliais mamárias simples ou multicelulares pode ser utilizado para avaliar alterações na adesão celular, a proliferação, tamanho, polaridade e basal-apical. Em contraste com os métodos previamente descritos, onde as células são cobert...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A11029	1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A11011	1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin	BD Transduction Laboratories	610153	Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water	Life Technologies	H3569	Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite	Media Cybernetics		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	Used at 100 nM
Anti-Laminin	Cedarlane	AB19012(CH)	Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope	Zeiss		Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237)	VWR	CACB356237	Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette	VWR	CA53300-523	Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells