Quantification du cancer du sein cellulaire envahissement aide d'un (3D) du modèle en trois dimensions

Résumé

Cet article fournit des méthodologies détaillées pour l'utilisation de trois dimensions (3D) des essais pour quantifier l'invasion des cellules du cancer du sein. Plus précisément, nous discutons les procédures nécessaires pour mettre en place de tels essais, la quantification et l'analyse des données, ainsi que des méthodes pour examiner la perte de l'intégrité de la membrane qui se produit lorsque les cellules envahissent.

Résumé

Il est maintenant bien connu que le microenvironnement cellulaire et tissulaire sont des régulateurs critiques qui influencent l'initiation et la progression tumorale. En outre, la matrice extracellulaire (ECM) a été démontrée comme étant un régulateur critique du comportement des cellules en culture et in vivo de l'homéostasie. L'approche actuelle de la culture de cellules sur deux dimensions (2D), plastiques résultats surfaces de la perturbation et la perte d'interactions complexes entre les cellules et leur microenvironnement. Grâce à l'utilisation de trois dimensions (3D) des analyses de culture, les conditions d'interaction cellule-microenvironnement sont établies ressemblant le micro-environnement in vivo. Cet article propose une méthodologie détaillée pour cultiver des cellules du cancer du sein dans une matrice 3D sous-sol de la protéine de membrane, ce qui illustre le potentiel de la culture en 3D dans l'évaluation de l'invasion de cellules dans le milieu environnant. En outre, nous discuter de la façon dont ces essais 3D ont le potentiel pour examiner la perte de molec signalisationdules qui régulent la morphologie épithéliale par immunomarquage procédures. Ces études aident à identifier les détails mécanistiques importantes dans les processus de régulation invasion, nécessaires à la propagation du cancer du sein.

Introduction

La migration et l'invasion des cellules individuelles ou collectives sont deux caractéristiques du cancer, et requis pour la propagation métastatique des cellules cancéreuses ^4.1. La capacité des cellules cancéreuses à initier une métastase dépend de leur capacité à migrer et à envahir les tissus voisins utilisant invadopodia de dégrader la membrane basale des cellules. Invadopodia sont des saillies de dégradation de la matrice riche en actine dynamiques qui permettent la dégradation de la matrice extracellulaire par l'intermédiaire de la libération de proteases dégradant la matrice ^5. l'invasion des cellules du cancer implique la dégradation de la matrice, suivi par la migration des cellules cancéreuses, ce qui s'accompagne d'une réorganisation de la tridimensionnel (3D) de l'environnement de la matrice ^2. Ainsi, pour pénétrer à travers la matrice, une cellule doit transformer sa forme et à interagir avec la matrice extracellulaire (ECM) ^2.

Le maintien de l'intégrité du tissu mammaire dépend étroitement controlled architecture tissulaire depuis les jonctions cellule-ECM et l'adhérence cellule-cellule influencent l'expression génique et la perturbation de la polarité épithéliale peut conduire à l'apparition du cancer ^10.6. Cependant, la plupart des essais in vitro de migration et d'invasion dans tels que transwell tests de chambre ou des essais plaie-rayures sont à deux dimensions (2D) et donc les négligent les interactions complexes entre les cellules et leur environnement adjacent ^3,6,8,11-14. Diversités morphologiques et fonctionnelles importantes, y compris les variations de la morphologie cellulaire, la différenciation cellulaire, des adhérences cellule-matrice et des profils d'expression génique ont été détectés par mise en culture des cellules dans des cultures 3D qui sont couramment défaut dans 2D dosages ^2,6,8,11. Ainsi, l'utilisation de tests 3D sont nettement bénéfique en récapitulant un plus physiologique en état ​​vivo, conduisant à une meilleure application des conclusions révolutionnaires de la recherche fondamentale à la clinique ^6-10. Toutefois, il convient de noter, En dépit des nombreux avantages obtenus avec l'utilisation de cultures 3D, ce modèle ne peut pas capturer toutes les complexités du microenvironnement tumoral in vivo en incluant différents types cellulaires. Cependant, il est possible d'incorporer des cellules stromales dans les modèles 3D (par exemple, les fibroblastes, les leucocytes et les macrophages) pour étudier l'effet des interactions tumeur-stroma sur l'adhérence des cellules cancéreuses et l'invasion ^{de 15 à 17.}

Cellules épithéliales mammaires en culture se développent le plus efficacement lorsque les protéines de la MEC comme la laminine et le collagène sont présents. Avec cette connue, un mélange de matrice disponible dans le commerce a été dérivé de Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumeur murine et est connu comme matrice de la membrane Matrigel sous-sol ^2,8. Un certain nombre de techniques ont été mis en place pour cultiver des cellules épithéliales que colonies 3D dans la matrice de membrane basale ^2,8. La membrane basale modèle de matrice 3D est efficace pour établir cellule à la fois malin et non malignes du seincroissance ressemblant à ce qui se produit dans l'environnement in vivo ^18,19. MCF10A cellules sont des cellules épithéliales mammaires non malignes. Lorsqu'il est cultivé en sous-sol matrice de la membrane, ces cellules présentent en traits in vivo de cellules mammaires normales et subir une prolifération cellulaire contrôlée, de la polarisation cellulaire, l'apoptose et pour établir l'espace de lumière ^8,12,20. Par ailleurs, l'apparition de noyaux cellulaires de cellules formant des acini MCF10A dans des cultures 3D ressemblent plus étroitement à celles des cellules épithéliales mammaires en tissu que ceux cultivés dans monocouche ^21. Des études menées par Bissell et ses collègues ont été les premiers à révéler que les cellules malignes du sein peuvent être différenciées à partir de cellules non malignes du sein lorsqu'il est cultivé dans un laminine riche environnement, puisque les cellules malignes présentent un phénotype très désorganisé, une prolifération accrue, une diminution de cellule-à- l'adhésion cellulaire, l'augmentation de l'expression de marqueurs mésenchymateuses et une augmentation du nombre de structures formées ^3,6,2 invasive2.

Des anomalies de l'environnement cellulaire peuvent influencer la formation de tumeur ^20. Le procédé de culture en 3D peut être utilisée pour étudier efficacement la communication qui se produit entre les cellules tumorales et leur environnement et à déterminer comment les influences d'expression de protéines telles ^14,20,21,23 de communication. Cet article fournit une méthodologie détaillée de croître MDA-MB-231 cellules de cancer du sein dans les cultures 3D pour analyser envahissant, et d'étudier la perte de la morphologie épithéliale en utilisant un laminine marqueur épithélial, un composant de la membrane basale de la cellule ^{18,19,24, 25.} Les procédures détaillées offrent la possibilité de quantifier avec précision et de façon reproductible stellaire (invasive) formation de la structure par une cellule de cancer invasif et n'est pas limitatif pour les lignées cellulaires de cancer du sein commun (telles que des cellules MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, ou T47D ). Ainsi, ce test peut servir de plate-forme pour évaluer la façon dont l'expression protéique dans les cellules ou le traitement avec pro-ou anti-composés invasives régulent dégradation de la matrice extracellulaire, par des cellules uniques ou multiples.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocole

1. Culture tridimensionnelle de cellules de cancer du sein dans la membrane basale Matrix (La Technique Embedment)

1. Manipulation Matrigel matrice de la membrane basale: Décongeler sur la glace pendant une nuit à 4 ° C. Basement membrane-matrice est liquide à basse température mais se solidifie à la température ambiante. Gardez sous-sol matrice de la membrane sur la glace (figures 1A-B).
2. Couvrir le plat à fond de verre n ° 1 confocale avec 50 pl de la matrice de la membrane basale par des moyens de diffusion de la matrice en utilisant la pointe d'un P-200 Pipetman dans un motif en spirale (figure 1C). Faites preuve de prudence lors de l'épandage de la matrice de la membrane basale pour éviter la formation de bulles d'air. De même, éviter la propagation de la matrice de fermer les frontières du plat à fond de verre pour empêcher la formation de ménisque. Si la manipulation inexpérimentée sous-sol matrice de la membrane, puis refroidi au préalable le plat, P-200 Pipetman et pipettes peut être sur la glace (alternativement à gauche la nuit dans un réfrigérateur à 4 ° C). Cette étape offresun délai supplémentaire pour se propager de la matrice de membrane basale avant solidification. Placer la capsule (s) dans un incubateur de culture de cellules (à 37 ° C avec 5% _de CO2) pendant au moins 30 min pour permettre à la matrice de membrane basale à se solidifier (figure 1D).
3. Bien que la matrice est en cours de solidification, trypsiniser une confluence de 100 mm plaque de cellules de 70-80%. Une fois que les cellules ont commencé à soulever hors de la plaque, les remettre en suspension dans 10 ml de milieu RPMI 1640 contenant 10% (v / v) de sérum bovin fœtal (FBS), afin d'inactiver la trypsine (figure 1E). Puis transférer les cellules remises en suspension dans un tube conique de 15 ml (figure 1F).
4. Faire tourner les cellules présentes dans le tube (conique) à 100 g pendant 3 min dans une centrifugeuse de culture cellulaire spécifique (figures 1G-H).
5. Alors que les cellules sont centrifugées, aliquote de 50 ul de matrice dans un tube à centrifuger de 1 ml (note: chaque plat à fond de verre est attribué un tube à centrifuger; donc, sil'expérience nécessite 3 plats, il s'ensuit que 3 microtubes sont nécessaires aussi bien), puis placer le tube sur de la glace (figure 1B).
6. Aspirer le milieu du tube conique de l'étape 1.4, tout en laissant le culot non perturbées (figure 1I). Resuspendre les cellules (qui ont été centrifugées) dans 1 ml de milieu RPMI supplémenté de FBS (figure 1J).
7. Une fois que les cellules sont comptées en utilisant un hémocytomètre (figure 1K), ou un compteur aliquote de particules de cellule 2,5 x 10 ⁴ cellules dans le tube à centrifuger et couronner le tout en utilisant les médias appropriés de façon à obtenir le volume total de 50 pi (figure 1L).
8. Mélanger les cellules provenant de l'étape 1.7 (25 000 cellules dans 50 ul) avec le tube à centrifuger contenant une matrice à partir de l'étape 1.5 dans un rapport de 1:1; volume final sera de 100 pi (figure 1M).
9. La plaque doucement 100 pl de la matrice: mélange de cellules provenant de l'étape 1.8 sur la smembrane basale plat de matrice revêtu olidified de l'étape 1.2 (Figure 1 N). Ceci permet pour les cellules devant être enrobées dans une matrice de membrane basale.
10. Transférer la capsule (s) dans l'incubateur de culture de cellules (à 37 ° C avec 5% de CO ₂₎ et de permettre la matrice: mélange de la cellule de se solidifier pendant au moins 30 min.
11. Une fois la matrice: mélange de cellules est solidifiée, ajouter 2 ml de milieu RPMI FBS complétés à l'antenne (figure 1O) et prendre le plat arrière de l'incubateur où il sera stocké pour le reste de l'expérience (figure 1P).
12. Changer médias tous les jours pendant une période de 5 jours (ou selon requis pour une analyse; la durée de l'essai pour les cellules MDA-MB-231 cellules est de 5 jours de longueur).
13. L'utilisation d'un microscope optique, prendre interférence différentiel (DIC) des images des cellules MDA-MB-231 colonies en suspension dans la matrice de la membrane basale (figure 3A) contraste. Image 20 zones représentatives à 10X objectif une fois par jourpendant cinq jours afin de déterminer la morphogenèse colonie (Figure 3C).
14. Analyser les images aveuglément à déterminer colonie de cellules formation stellaire (figure 3B). Une colonie est réputée être stellaire si une ou plusieurs saillies à partir de la sphéroïde de cellules sont perçus. Pour déterminer le pourcentage de colonies étoilées envahissantes, diviser le nombre de colonies étoilées par le nombre total de colonies de cellules par image acquise, puis la moyenne des colonies étoilées pourcentages de 20 images pour chaque jour.

Figure 1. Culture tridimensionnelle de cellules MDA-MB-231 cellules de cancer du sein de la matrice de membrane basale (la technique d'implantation). AB) Un schéma du dispositif expérimental (effectué dans la hotte). C) Le bien de la boîte à fond de verre enduitavec 50 ul de sous-sol matrice de la membrane. D) vaisselle (s) placé dans un incubateur de culture de cellules (à 37 ° C avec 5% de CO ₂₎ pour permettre à la matrice de se solidifier pendant au moins 30 min. E) Les cellules ont été traitées à la trypsine. F ) Les cellules ont été remises en suspension dans un tube de 15 ml conique. GH) Cells (présents dans le tube conique) ont été centrifugés à 100 g pendant 3 min dans une culture centrifugeuse de tissu. I) culot cellulaire. J) cellules (qui ont été filés bas) ont été remises en suspension dans 1 ml de milieu RPMI FBS supplémenté. K) Les cellules ont été comptées en utilisant un hématimètre. L) 2,5 x 10 ⁴ cellules aliquotées dans le tube à centrifuger et complété en utilisant les médias appropriés de façon à obtenir le volume total de 50 pi. M ) mélanger les cellules provenant de l'étape 1.7 (25 000 cellules dans 50 ul) avec le tube à centrifuger contenant une matrice à partir de l'étape 1.5 dans un rapport de 1:1; volume final sera de 100 μ.; L N) plaque délicatement 100 pi de la matrice: mélange de cellules de l'étape 8 sur le plat de matrice revêtu solidifié de l'étape 1.2 O) Une fois la matrice: mélange de cellules est solidifiée, ajouter 2 ml de milieu RPMI FBS complétées à. le plat. P) Placez le plat dans l'incubateur où il sera stocké pour le reste de l'expérience.

2. L'examen des caractéristiques des cultures Morphogenic 3D avec immunofluorescence

1. Mettre en place un bac à glaçons, le phosphate froid solution tamponnée (PBS), 20% d'acétone: méthanol à 80% (de la solution de fixation), et 3% d'albumine de sérum bovin (BSA; la solution de blocage) (figure 2A) avant de retirer la coupelle (s) à partir de l'incubateur.
2. Placer le plat (s) sur le plateau de glace et aspirer les médias, puis laver 3 fois avec 2 ml de PBS froid (figure 2B).
3. Une fois le dernier lavage PBS est aspiré, ajouter 2 ml d'acétone à 20%: solution de méthanol à 80% dans le plat (s) (figure 2C ) pour fixer les cellules pendant 20 min à 4 ° C (soit sur ​​la glace ou dans un réfrigérateur) (figure 2D).
4. Une fois les 20 min de fixation est terminée, apporter les plats de retour à la température ambiante, aspirer le fixateur, puis laver 3 fois avec PBS. Une fois que le dernier lavage PBS est aspiré, ajouter 2 ml de BSA à 3% à l'antenne (s) pour bloquer pendant au moins 30 min à température ambiante (figure 2E).
5. Au cours de la période de blocage préparer des dilutions de primaire (laminine V 1:100) et des anticorps secondaires (à une dilution appropriée) dissous dans 3% d'albumine de sérum bovin (BSA), le tampon de blocage. S'il vous plaît noter que 400-500 ul de la solution «BSA + anticorps primaire» devrait être ajouté directement sur la matrice: mélange de cellules.
6. Une fois que le blocage de 30 minutes sont écoulées, ajouter les anticorps primaires et incuber pendant au moins 1 heure à la température ambiante (Figure 2F). S'il vous plaît noter que aucun lavage PBS doivent être réalisés après 30 min blockinpériode de g.
7. À la fin de l'étape 2.6, éliminer la solution 'BSA + anticorps primaire », et laver 3 fois avec PBS.
8. Ajouter l'anticorps secondaire dissous dans 3% de BSA (à une dilution appropriée) directement sur ​​la matrice: mélange de cellules, couvrir les plats et incuber pendant 1 heure à température ambiante (figure 2G).
9. Retirez le «BSA + anticorps secondaire» solution, et laver 3 fois avec PBS.
10. Ajouter 2 ml de Hoechst 33258 (1:10000) dissous dans du PBS pour la coloration des noyaux, et incuber pendant 5 min dans une feuille d'aluminium (ou recouvrir d'un récipient opaque pour limiter photoblanchiment) (figure 2H).
11. Une fois la 5 min d'incubation avec Hoechst 33258t ont expiré, laver la vaisselle (es) 5x avec du PBS.
12. Ajouter milieu de montage directement sur la matrice: mélange de cellules dans le plat confocale et couvrir avec lamelle de verre avec précaution pour éviter toute perturbation induisant à l'intégrité des colonies dans la matri de la membrane basalex: mélange de cellules (figure 2I).
13. Laisser le plat (s) à sécher pendant la nuit (ou 24 h) à température ambiante (figure 2I). Une fois sec, le plat (s) peut être conservé à -20 ° C, mais il est fortement recommandé qu'ils soient imagés aussi rapidement que possible.
14. Acquérir des images en utilisant un microscope à fluorescence avec des longueurs d'onde de laser appropriés d'anticorps utilisés (figures 3D-E).

Figure 2. Examen des cultures 3D par immunofluorescence. . A) Un schéma du dispositif expérimental B) Plat (s) placé sur le plateau de glace et médias aspiré; ensuite les cellules ont été lavées trois fois avec 2 ml de PBS froid C) 2 ml d'acétone à 20%:. solution méthanolique à 80% ajouté dans le récipient métallique (s) D) pour réparer les cellules.20 min à 4 ° C (soit sur ​​la glace ou dans un réfrigérateur). E) 2 ml de BSA à 3% ajouté à la boîte (s) pour bloquer pendant au moins 30 min à température ambiante. F) Une fois que la 30 min d' blocage ont expiré, ajouter les anticorps primaires et incuber pendant au moins 1 heure à température ambiante G) Les anticorps secondaires dissous dans 3% de BSA (à une dilution appropriée) ont été ajoutés directement sur ​​la matrice de membrane basale. mélange de cellules; . ensuite plats recouverts et incubés pendant 1 heure à température ambiante H) 2 ml de Hoechst (1:10.000; dissous dans du PBS) a été ajouté à la dishe (s) et les cellules incubées pendant 5 min dans du papier d'aluminium I) Milieu de montage ajouté directement. sur la matrice: mélange de cellules dans le plat confocal et le plat est recouvert de lamelle de verre. Antenne (s) mis à sécher pendant une nuit (ou 24 h) à température ambiante.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Résultats

Un exemple des cellules MDA-MB-231 dans des cellules qui envahissent la matrice 3D est illustré sur la figure 3C. Les cellules sont enrobées dans une matrice (Jour 1), et commencent à se former (étoilées) structures envahissantes par jour 3, et envahissent complètement dans la matrice par Jour 5 (figure 3C). Le nombre de colonies formées étoilées sont comptés, et exprimée en pourcentage du nombre total de colonies par boîte (invasives et non invasives). En outre, puisque les...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Le développement de la 3D des techniques de culture cellulaire a permis aux chercheurs d'étudier la transformation des cellules épithéliales mammaires, ce qui nous permet de visualiser les changements morphologiques spectaculaires. Outre l'analyse de l'invasion des cellules, les sphéroïdes épithéliales mammaires ou multicellulaires simples peuvent être utilisés pour évaluer les changements dans l'adhésion cellulaire, la prolifération, la taille et basal-apical polarité. Contrairement aux m?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A11029	1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A11011	1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin	BD Transduction Laboratories	610153	Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water	Life Technologies	H3569	Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite	Media Cybernetics		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	Used at 100 nM
Anti-Laminin	Cedarlane	AB19012(CH)	Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope	Zeiss		Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237)	VWR	CACB356237	Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette	VWR	CA53300-523	Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells