Quantifizierung der Brustkrebs-Zelle Invasivität Mit einem Drei-dimensionale (3D) Modell

Zusammenfassung

Dieser Artikel enthält detaillierte Methoden für die Verwendung von dreidimensionalen (3D-) Assays auf Brustkrebszellinvasion zu quantifizieren. Insbesondere diskutieren wir die Verfahren erforderlich, um solche Tests einrichten, Quantifizierung und Datenanalyse, sowie Methoden, um den Verlust der Membranintegrität, die bei Zellen eindringen tritt zu untersuchen.

Zusammenfassung

Es ist nun gut bekannt, daß die Zell-und Gewebemikroumgebung kritische Regulatoren beeinflussen Tumor Initiierung und Progression. Darüber hinaus ist die extrazelluläre Matrix (ECM) wurde gezeigt, dass ein kritischer Regulator des Zellverhaltens in Kultur und in vivo-Homöostase. Der aktuelle Ansatz der Kultivierung von Zellen auf zweidimensionalen (2D), Kunststoffoberflächen führt zu der Störung und Verlust der komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihrer Mikroumgebung. Durch die Verwendung von dreidimensionalen (3D) Kultur-Assays werden die Bedingungen für die zellMikro Wechselwirkung fest ähnlich der in vivo-Mikroumgebung. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methode zur Brustkrebs-Zellen in einem 3D-Basalmembran Proteinmatrix wachsen Ausführungs das Potential der 3D-Kultur in der Beurteilung der Zellinvasion in die Umgebung. Darüber hinaus diskutieren wir, wie diese 3D-Tests haben das Potenzial, um den Verlust von Signal Mole prüfenModule, die epithelialen Morphologie regulieren durch Immunfärbung Verfahren. Diese Studien unterstützen wichtige mechanistische Details in die Prozesse regulieren Invasion, die Ausbreitung von Brustkrebs erforderlich identifizieren.

Einleitung

Migration und Invasion von Einzel-oder Sammelzellen sind zwei Markenzeichen von Krebs und für die Metastasierung von Krebszellen ^4.1 erforderlich. Die Fähigkeit von Krebszellen zur Metastasierung initiieren hängt von ihrer Fähigkeit zur Migration und dringen in mit invadopodia die Basalmembran der Zellen beeinträchtigen dem benachbarten Gewebe. Invadopodia sind dynamische Aktin-reichen Matrixabbau Vorsprünge, Abbau der extrazellulären Matrix durch die Freisetzung von Matrix-abbauenden Proteasen ⁵ zu ermöglichen. Invasion von Krebszellen beinhaltet den Abbau der Matrix, gefolgt von der Wanderung der Krebszellen, und dies wird durch eine Umgestaltung der dreidimensionalen (3D-) Matrix-Umgebung ² verbunden. So, um durch die Matrix zu durchdringen, eine Zelle muss seine Form zu transformieren und die Interaktion mit der extrazellulären Matrix (ECM) ^2.

Die Pflege von Brustgewebe Integrität hängt eng Controlled Gewebearchitektur, da Zell-ECM-und Zell-Zell-Adhäsion Gänge beeinflussen die Genexpression und die Störung der epithelialen Polarität an der Entstehung von Tumoren führen ^6-10. Die meisten in vitro die Migration und Invasion von Assays wie Transwell Kammer-Assays oder wundKratzTests sind zweidimensionale (2D) und damit diese die komplizierten Wechselwirkungen zwischen Zellen und der benachbarten Umgebung ^3,6,8,11-14 vernachlässigen. Erhebliche morphologische und funktionelle Vielfalt einschließlich Schwankungen in der Zellmorphologie, Zelldifferenzierung, Zell-Matrix-Adhäsionen und Genexpressionsmuster wurden durch Kultivierung von Zellen in 3D-Kulturen, die häufig fehlen in 2D-Assays ^2,6,8,11 erkannt. Daher verwendet der 3D-Tests sind deutlich vorteilhaft rekapituliert einen physiologischen Zustand in vivo, was zu einer besseren Übersetzung von bahnbrechenden Erkenntnisse in der Grundlagenforschung in die Klinik ^10.06. Es sollte jedoch angemerkt werden,Trotz der vielen Vorteile der Verwendung von 3D-Kulturen gewonnen, kann dieses Modell nicht erfassen alle die Komplexität der in vivo-Tumor-Mikroumgebung, die verschiedene Zelltypen umfasst. Es ist jedoch möglich, Stromazellen in die 3D-Modelle enthalten (z. B. Fibroblasten, Leukozyten und Makrophagen), um den Effekt von Tumor-Stroma-Interaktionen auf Krebszell Adhäsion und Invasion ^15-17 studieren.

Brust-Epithelzellen in Kultur effektiv wachsen, wenn ECM-Proteine ​​wie Laminin und Kollagen vorhanden sind. Bei dieser bekannten, wurde eine im Handel erhältliche Mischung aus Matrix Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) murinen Tumor abgeleitet und wird als Matrigel Basalmembranmatrix ^2,8 bekannt. Eine Anzahl von Techniken wurden eingerichtet, um Epithelzellen als 3D Kolonien in Basalmembranmatrix ^2,8 wachsen. Die 3D Basalmembranmatrix Modell ist für die Festlegung sowohl malignen und nicht-malignen BrustzellenWachstum, ähnlich wie in der in vivo Umgebung ^18,19 auftritt. MCF10A-Zellen sind nicht-malignen Brustepithelzellen. Wenn in Basalmembranmatrix gewachsen, diese Zellen in vivo Merkmale der normalen Brustzellen zu unterziehen und kontrollierten Zellproliferation, Zellpolarisation und Apoptose, um das Lumen Raum ^8,12,20 herzustellen. Ferner das Auftreten von Zellkernen MCF10A-Zellen bilden Acini in 3D-Kulturen mehr ähneln denen von Brustepithelzellen im Gewebe als in Monoschicht ²¹ gezüchtet. Studien von Bissell und seine Kollegen waren die ersten, zu zeigen, dass bösartige Brustzellen aus nicht-malignen Brustzellen differenziert, wenn in einem Laminin-reichen Umgebung aufgewachsen, da die bösartigen Zellen zeigen eine sehr unorganisiert Phänotyp, erhöhte Proliferation, verringert werden Zell-zu- Zelladhäsion, erhöhte Expression des mesenchymalen Marker und ein Anstieg in der Zahl der invasiven Struktur gebildet ^3,6,22.

Fehlbildungen der Zellumgebung kann die Tumorbildung ²⁰ beeinflussen. Die 3D-Kulturverfahren verwendet werden, um wirksam zu untersuchen, die die Kommunikation zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung auftritt, und bestimmen, wie die Proteinexpression Einflüsse wie Kommunikations ^14,20,21,23 werden. Dieser Artikel enthält eine detaillierte Methodik zur MDA-MB-231 Brustkrebszellen in 3D-Kulturen wachsen, um Invasivität zu analysieren und den Verlust der epithelialen Morphologie mit einem epithelialen Marker Laminin, ein Bestandteil der Zell Basalmembran ^{18,19,24 studieren, 25.} Die Verfahren bieten die Möglichkeit, sternförmige (invasiv) Strukturbildung genau und reproduzierbar zu quantifizieren von invasiven Krebszelle und ist nicht auf die gemeinsame Brustkrebszelllinien (z. B. MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, T47D oder Begrenzungs ). Somit kann dieser Test als Plattform zur Bewertung, wie Protein-Expression in Zellen oder Behandlung dienen mit pro-oder anti-invasive Verbindungen regulieren Abbau der extrazellulären Matrix, durch einzelne oder mehrere Zellen.

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Protokoll

1. Dreidimensionale Kultur von Brustkrebszellen in Basalmembranmatrix (Die Einbettung Technique)

1. Handhabung Matrigel Basalmembranmatrix: Tauwetter auf Eis über Nacht bei 4 ° C Basalmembran-Matrix bei niedriger Temperatur flüssig, sondern verfestigt sich bei Raumtemperatur. Halten Basalmembranmatrix auf Eis (Fig. 1A-B).
2. Decken Sie die konfokale No.1 Glasbodenschale mit 50 ul Basalmembranmatrix durch die Verbreitung der Matrix mit der Spitze eines P-200 Pipetman in einem Spiralmuster (Abbildung 1C). Vorsicht, wenn die Verbreitung der Basalmembran Matrix, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden. Ebenso vermeiden Verbreitung der Matrix, um bis zu den Grenzen der Glasbodenschale schließen, um Meniskusbildung zu verhindern. Wenn unerfahrene Handhabung Basalmembranmatrix, vorgekühlt, dann die Schale, P-200 Pipetman und Pipetten auf Eis (alternativ über Nacht im Kühlschrank bei 4 ° C links). Dieser Schritt Angebotezusätzliche Zeit, um die Basalmembran Matrix vor der Verfestigung zu verbreiten. Die Schale (n) in einem Zellkulturbrutschrank (bei ​​37 ° C mit 5% CO ₂₎ für mindestens 30 Minuten, bis die Basalmembran-Matrix zu ermöglichen sich zu verfestigen (Fig. 1D).
3. Während die Matrix erlebt Erstarrung trypsinize eine 70-80% konfluente 100-mm-Platte von Zellen. Sobald die Zellen begonnen haben, ein Abheben der Platte zu resuspendieren sie in 10 ml RPMI 1640-Medium mit 10% (v / v) fötalem Rinderserum (FBS), um das Trypsin (1E) zu inaktivieren. Dann übertragen Sie die resuspendierten Zellen in ein 15 ml konischen Röhrchen (1F).
4. Drehen Sie die Zellen (in konischen Rohr vorhanden) bei 100 g für 3 min in einem speziellen Zellkulturzentrifuge (Figuren 1G-H).
5. Während die Zellen werden abzentrifugiert Aliquot 50 ul Matrix in eine 1 ml-Mikrozentrifugenröhrchen (Anmerkung: wird jede Glasbodenschale zuge ein Mikrozentrifugenröhrchen, daher, wennDas Experiment erfordert drei Gerichte, dann folgt daraus, dass 3-Mikrozentrifugenröhrchen notwendig sind als auch), und dann die Röhrchen auf Eis (Abbildung 1B).
6. Saugen Sie das Medium aus dem konischen Rohr von Schritt 1.4, während gleichzeitig das Pellet ungestört (1I). Die Zellen in 1 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium (Fig. 1J) (, die abzentrifugiert haben).
7. Sobald die Zellen mit einer Zählkammer (Abbildung 1 K) oder eine Zelle Partikelzähler aliquoten 2,5 x 10 ⁴ Zellen in den Mikrozentrifugenröhrchen gezählt und das Ganze abzurunden mit geeigneten Medien, so Gesamtvolumen von 50 ul (Abb. 1 l) zu erhalten.
8. Mischen der Zellen aus Schritt 1.7 (25.000 Zellen in 50 &mgr; l) mit der Matrix enthaltenden Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 1.5 in einem Verhältnis von 1:1; Abschlussvolumen 100 ul (Abbildung 1 M) sein.
9. Sanft Platte 100 ul der Matrix: Zellgemisch aus Schritt 1.8 in die Solidified Basalmembranmatrix-beschichtete Schale aus Schritt 1.2 (Abbildung 1 N). Dies ermöglicht die Zellen in Basalmembran-Matrix eingebettet werden.
10. Übertragen die Schale (n) in den Zellkulturbrutschrank (bei ​​37 ° C mit 5% CO ₂₎ und damit die Matrix: Zellgemisch für mindestens 30 Minuten zu verfestigen.
11. Sobald die Matrix: Zellgemisch verfestigt, 2 ml FBS-RPMI-Medium, ergänzt um die Schale (Abbildung 1O) und nehmen Sie die Schale wieder den Brutkasten, wo es für den Rest des Experiments (Abbildung 1P) gelagert werden.
12. Ändern Medien jeden Tag für einen Zeitraum von 5 Tagen (oder nach für einen Assay erforderlich, die Dauer des Assays für MDA-MB-231-Zellen 5 Tage lang).
13. Mit einem Lichtmikroskop, nehmen Differentialinterferenzkontrast (DIC) Bilder der MDA-MB-231 Kolonien in Basalmembranmatrix (3A) suspendiert. Bild 20 repräsentativen Bereichen bei 10X-Objektiv einmal am Tagfür fünf Tage Kolonie Morphogenese (3C) zu bestimmen.
14. Analysieren Bilder blind Zellkolonie Sternformation (Fig. 3B) zu bestimmen. Eine Kolonie wird als stern sein, wenn ein oder mehrere Vorsprünge aus dem Sphäroid von Zellen wahrgenommen werden. Zur Bestimmung des Prozentsatzes von invasiven stern Kolonien, teilen die Anzahl von Stern Kolonien durch die Gesamtzahl der Zellkolonien pro erfassten Bild, und dann der Mittelwert der prozentualen stern Kolonien der 20 Bilder pro Tag.

1. Dreidimensionale Kultur von MDA-MB-231-Brustkrebszellen in Basalmembran-Matrix (die Einbettungstechnik). AB) Eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus (im Abzug durchgeführt). C) Die auch von der Glasbodenschale beschichtetenmit 50 ul Basalmembranmatrix D). Geschirr (n) in einem Zellkulturbrutschrank mit 5% CO ₂₎ gegeben (37 ° C, um die Matrix zu ermöglichen, für mindestens 30 Minuten zu verfestigen. E) Die Zellen wurden mit Trypsin behandelt. F ) Die Zellen wurden in einer 15 ml konischen Röhrchen. GH) Zellen (im konischen Rohr vorhanden) wurden bei 100 × g für 3 min in einem Gewebekultur-Zentrifuge resuspendiert. I) Zellpellet. J) Zellen (oder der fest gesponnen) wurden in 1 ml FBS-ergänzt RPMI Medium resuspendiert. K) wurden die Zellen mit einer Zählkammer. gezählt L) 2,5 x 10 ⁴ Zellen in den Mikrozentrifugenröhrchen aliquotiert und gekrönt mit geeigneten Medien, so Gesamtvolumen von 50 ul zu erhalten. M ) Mischen Zellen aus Schritt 1.7 (25.000 Zellen in 50 &mgr; l) mit der Matrix enthaltenden Mikrozentrifugenröhrchen aus Schritt 1.5 in einem Verhältnis von 1:1; Abschlussvolumen 100 μ sein. L N) vorsichtig Platte 100 &mgr; l der Matrix: Zellgemisch von Schritt 8 auf die verfestigte Matrix-beschichtete Schale aus Schritt 1.2 O) Sobald die Matrix: Zellgemisch verfestigt, 2 ml FBS-ergänztem RPMI-Medium zu. das Gericht. P) wird die Schale in den Brutschrank, wo sie für den Rest des Experiments gespeichert werden.

2. Prüfung der Morphogenic Eigenschaften von 3D-Kulturen mit Immunfluoreszenz

1. (2A), bevor Sie die Schale (n), 80% Methanol (Fixierungslösung) und 3% Rinderserumalbumin (BSA Blocking-Lösung): bis Eiswürfelschale, Kälte-Phosphat-Pufferlösung (PBS), 20% Aceton Set aus dem Inkubator.
2. Die Schale (n) auf dem Eis Tablett und saugen Medien, dann waschen 3x mit 2 ml kaltem PBS (2B).
3. Sobald die letzte PBS-Wasch wird abgesaugt, 2 ml 20% Aceton: 80% Methanol-Lösung in die Schale (n) (2C ), um die Zellen für 20 min bei 4 ° C (entweder auf Eis oder im Kühlschrank) (Fig. 2D) zu fixieren.
4. Sobald die 20 Minuten der Fixierung beendet wird, bringen die Gerichte wieder auf Raumtemperatur absaugen Fixiermittel und anschließend 3x mit PBS waschen. Sobald die endgültige PBS waschen wird abgesaugt, 2 ml 3% BSA in die Schale (n), für mindestens 30 min bei Raumtemperatur (Fig. 2E) zu blockieren.
5. Während der Sperrzeit vorzubereiten Verdünnungen der primären (Laminin V 1:100) und Sekundärantikörper (bei entsprechender Verdünnung) in 3% Rinderserumalbumin (BSA) Blocking-Puffer gelöst. Bitte beachten Sie, dass 400 bis 500 ul der "BSA + primärer Antikörper-Lösung sollte direkt auf die Matrix hinzugefügt: Zellgemisch.
6. Sobald die 30 Minuten der Blockierung abgelaufen sind, fügen Sie die primären Antikörper und Inkubation für mindestens 1 h bei Raumtemperatur (2F). Bitte beachten Sie, dass keine PBS-Waschungen sollte nach 30 Minuten durchgeführt werden blocking Zeitraum.
7. Nach Abschluss von Schritt 2.6, entfernen Sie die '+ BSA primären Antikörper-Lösung und wäscht 3x mit PBS.
8. Fügen Sie den sekundären Antikörper in 3% BSA gelöst (bei ​​entsprechender Verdünnung), die direkt auf die Matrix: Zellgemisch, decken Sie die Speisen und Inkubation für 1 h bei Raumtemperatur (2G).
9. Entfernen Sie die '+ BSA sekundären Antikörper-Lösung und wäscht 3x mit PBS.
10. 2 ml Hoechst 33258 (1:10.000), gelöst in PBS für Kerne Färbung und Inkubation für 5 Minuten unter Alufolie (oder Deckel mit einem undurchsichtigen Behälter zu begrenzen Photobleaching) (2H).
11. Sobald die 5 min Inkubation mit Hoechst 33258t abgelaufen sind, waschen Sie die Schale (n) 5x mit PBS.
12. In Montage Medium direkt auf die Matrix: Zellgemisch in der konfokalen Schüssel geben und mit Deckglas sorgfältig Induktion keine Störungen der Integrität der Kolonien in der Basalmembran Matri zu verhindernx: Zellgemisch (2I).
13. Anschließend wird die Schale (n) über Nacht (oder 24 h) bei Raumtemperatur (2I) trocknen. Nach dem Trocknen kann die Schale (n) bei -20 ° C gelagert werden, aber es wird empfohlen, dass sie so schnell wie möglich dargestellt werden.
14. Erwerben von Bildern unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops mit geeigneten Laserwellenlängen von Antikörpern verwendet (Figuren 3D-E).

2. Prüfung der 3D-Kulturen durch Immunofluoreszenz. . A) Eine schematische Darstellung des experimentellen Aufbaus B) Dish (n) auf dem Eis Schale gelegt und Medium abgesaugt; . Anschließend wurden die Zellen dreimal mit 2 ml kaltem PBS C), 2 ml 20% Aceton: 80% Methanollösung in die Schale (n) D) Fixieren der Zellen.20 min bei 4 ° C (entweder auf Eis oder im Kühlschrank). E) 2 ml 3% BSA in die Schale (n) hinzugefügt, um für mindestens 30 min bei Raumtemperatur Block F). Sobald die 30 min von Blockierung abgelaufen sind, fügen Sie die primären Antikörper und Inkubation für mindestens 1 h bei Raumtemperatur G) Sekundäre Antikörper in 3% BSA gelöst (bei ​​entsprechender Verdünnung) wurden direkt auf der Basalmembran Matrix hinzugefügt:. Zellgemisch; . anschließend Speisen abgedeckt und für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert H) 2 ml Hoechst (1:10.000, gelöst in PBS) zugegeben, um die dishe (n) und die Zellen für 5 min unter Aluminiumfolie inkubiert I) Montage Medium direkt zugegeben. auf die Matrix: Zellgemisch in der konfokalen Gericht und dem Gericht wird mit Deckglas abgedeckt. Schale (n) über Nacht (oder 24 h) bei Raumtemperatur trocknen.

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Ergebnisse

Ein Beispiel für die MDA-MB-231-Zellen eindringende in 3D-Matrix ist in Fig. 3C dargestellt. Die Zellen werden in Matrix (Tag 1) eingebettet und bilden beginnen invasive (sternförmige) Strukturen von Tag 3, und vollständig in die Matrix eindringen von Tag 5 (3C). Die Anzahl der gebildeten Kolonien stern gezählt und als Prozentsatz der Gesamtzahl der Kolonien pro Schale (invasive und nicht-invasive) ausgedrückt. Zusätzlich wird, da Messungen täglich für die fünf Tagen durchgefü...

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Diskussion

Die Entwicklung der 3D-Zellkultur-Techniken konnten die Forscher die Umwandlung von Brust-Epithelzellen, um zu studieren, so dass wir die dramatischen morphologischen Veränderungen zu visualisieren. Neben der Analyse der Zellinvasion, können die Einzel-oder mehrzellige Sphäroide Brustepithelzellen verwendet, um Änderungen in der zellulären Adhäsion, Proliferation, Größe und basal-apikalen Polarität zu beurteilen. Im Gegensatz zu früher berichteten Verfahren, falls die Zellen mit ECM ⁸ überlagert, b...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml tubes	VWR	CA10011-700	Sterile, disposable
100-mm culture dish BD353003	VWR	CABD353003	Sterile, disposable
15 ml Falcon tube	VWR	CA21008-918	Sterile, disposable
1 ml filtered tips	VWR	10011-350	Sterile, disposable
200 μl filtered tips	VWR	22234-016	Sterile, disposable
20 μl filtered tips	VWR	22234-008	Sterile, disposable
35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes	MatTek Corporation	P35G-1.0-14-C	Precooled before use
Bovine serum albumin (BSA)	BioShop	ALB003.100	Used at 3% for IF
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Life Technologies	A11029	1:250 for IF
Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life Technologies	A11011	1:1,200 for IF
Anti-Beta-Catenin	BD Transduction Laboratories	610153	Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF
Fetal bovine serum (FBS)	Sigma	F1051	Used at 10% (v/v)
Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) - 10 mg⁄ml Solution in Water	Life Technologies	H3569	Used at 0.1% (1:10,000 dilution)
InVivo Analyzer Suite	Media Cybernetics		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Kisspeptin-10 (KP-10)	EZ Biolabs	PT0512100601	Used at 100 nM
Anti-Laminin	Cedarlane	AB19012(CH)	Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF
LSM-510 META laser scanning microscope	Zeiss		Used at 63X objective; oil immersion lens
Matrigel phenol red free (BD356237)	VWR	CACB356237	Lot No.2180819; 10.4 mg/ml
Olympus IX-81 microscope	Olympus		Used for 3D culture imaging (DIC images at 10X and 40X)
Penicillin-streptomycin (10,000 U/ml)	Life Technologies	15140-122	Antibiotic (added to media; used at 0.01%)
10 ml pipette	VWR	CA53300-523	Sterile, disposeable
RPMI 1640 Medium with Glutamine	Life Technologies	11875-119	Used for culturing of MDA-MB-231 cells
0.25% Trypsin-EDTA (1x), Phenol Red	Life Technologies	25200-072	Used to trypsinize MDA-MB-231 cells
MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136)	Lonza	CC-3150	Used for culturing of MCF10A cells