ספקטרוסקופיה התפלגות מושרה לייזר: גישה חדשה למיפוי של Nanoparticle וכימות ברקמות איברים

Summary

ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר מבוצעת על איבר דק ורקמת גידול זוהתה בהצלחה אלמנטים טבעיים וגדוליניום המוזרק באופן מלאכותי (ה '), שהונפקו מחלקיקים המבוססים על ה'. תמונות של יסודות כימיים הגיעו לרזולוציה של 100 מיקרומטר ורגישות תת מ"מ כמותית. התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק מספר רב של תמונות מאותה רקמה ביולוגית.

Abstract

ספקטרוסקופית פליטה של ​​פלזמה מושרה לייזר הייתה מוחלת על ניתוח יסודי של דגימות ביולוגיות. ספקטרוסקופיה התמוטטות מושרה לייזר (LIBS) שבוצע בסעיפים דקים של רקמות מכרסמים: כליות וגידול, מאפשר זיהוי של אלמנטים אורגניים כגון (i) Na, Ca, Cu, Mg, P, ופה, באופן טבעי בגוף ו (Ii) Si וה ', שאותרו לאחר ההזרקה של חלקיקים המבוסס על גדוליניום. החיות מורדמים 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של חלקיקים. סריקה דו ממדית של המדגם, שבוצעה באמצעות 3D בשלב micrometric ממונע, אפשר לקרן לייזר אינפרא אדום לחקור את פני השטח ברזולוציה רוחב של פחות מ -100 μ מ '. תמונות כימיות הכמותי של אלמנט הקב"ה בתוך האיבר התקבלו עם רגישות תת מ"מ. LIBS מציע שיטה פשוטה וחזקה כדי ללמוד את ההפצה של חומרים אורגניים ללא כל labeli ספציפיng. יתר על כן, את התאימות של ההתקנה עם מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית, מדגישה את הפוטנציאל שלה כדי לספק תמונות מרובות של אותו הרקמה ביולוגית עם סוגים שונים של תגובה: יסודות, מולקולריים, או סלולריים.

Introduction

הפיתוח הרחב של חלקיקים עבור יישומים ביולוגיים דחק בשיפור המקביל של שיטות אנליטיות לכימותם והדמיה בדגימות ביולוגיות. בדרך כלל זיהוי והמיפוי של חלקיקים באיברים מבוצעים על ידי הקרינה או confocal. למרבה הצער שיטות אלה דורשים התיוג של חלקיקים על ידי צבע אינפרא אדום קרוב שיכול לשנות את biodistribution של חלקיקים, במיוחד לחלקיקים קטנים מאוד בשל המאפיינים הידרופובי שלה. הגילוי של חלקיקים שכותרתו, ובעיקר חלקיקים קטנים מאוד (גודל <10 ננומטר), ובכך עלול להפריע לbiodistribution שלהם בכל קנה המידה הגוף, אלא גם ברמת הרקמות ותאים. הפיתוח של מכשירים חדשים מסוגלים לזהות חלקיקים ללא כל תיוג מציע אפשרויות חדשות לחקר ההתנהגות וקינטיקה שלהם. יתר על כן, תפקידיו של יסודות קורט כגון ברזל ונחושת במוח מחלותמחלות ניווניות כגון ד ¹ אלצהיימר, מנקס ^2,3, או ⁴ וילסון מציעות ריבית ללמוד ולמקם רכיבים אלה ברקמות.

טכניקות שונות שימשו כדי לספק מיפוי או microanalysis יסודות של חומרים שונים. במאמר הביקורת שפורסם ב2006, ר 'Lobinski et al. סיפק סקירה של טכניקות סטנדרטיות זמינות עבור microanalysis יסודות בסביבה ביולוגית, אחת מהסביבות המאתגרות ביותר עבור מדעים אנליטיים ^5. Microprobe האלקטרון, אשר מורכב מmicroanalysis רנטגן נפיצה אנרגיה במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים, יכול להיות מיושם על מחקרים רבים אם ריכוז המרכיב מספיק (> 100-1,000 מיקרוגרם / g). כדי להגיע למגבלות זיהוי נמוכות יותר, בטכניקות הבאות היו בשימוש:

• μ-PIXE (1-10 מיקרוגרם / g) microprobe אלומת יונים באמצעות חלקיקים המושרה רנטגן פליטה ⁶
• synchrotron microanalysis קרינת μ-SXRF (0.1-1 מיקרוגרם / גרם) ⁷
• ספקטרומטריית מסת יונים משני Sims (0.1 מיקרוגרם / גרם) ⁸
• אבלציה לייזר אינדוקטיבי מצמידים ספקטרומטריית מסת LA-ICP-MS (עד 0.01 מיקרוגרם / g) ^9,10

הטכניקות הנ"ל מספקות רזולוציה micrometric כפי שמוצגות בטבלת 1 שחולץ מן Lobinski et al.

שחזור 3D של חקירות 2D סידוריים יכול להיות גם הציע לבנייה מחדש של רקמות עמוקות יותר ^11. עם זאת, כל המכשירים והמערכות דורשים שני אנשי מקצוע מוסמכים, בדרגה בינוני עד ציוד יקר מאוד וניסויים לטווח ארוכים (בדרך כלל יותר מ 4 שעות ל100 מיקרומטר x 100 מיקרומטר לμ-SXRF ו10 מ"מ x 10 מ"מ לLA-ICP-MS ) ^12. בסך הכל, דרישות אלה הופכים microanalysis יסודות מאוד מגבילים ועולה בקנה אחד עם מערכות הדמיה אופטית קונבנציונליות,מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופיה לא לינארית. נקודה נוספת שאנו יכולים להזכיר כאן היא שיכולת מדידת כמותית היא עדיין די מוגבלת ותלויה בזמינות של סטנדרטים מעבדה בהתאמה מטריצה. הכללה נוספת של השימוש בmicroanalysis יסודות בתהליכים בתעשייה, גיאולוגיה, ביולוגיה ותחומים אחרים של יישומים תפיק פריצות דרך רעיוניות וטכנולוגית משמעותיות.

מטרתו של כתב היד הנוכחית היא להציע פתרונות למיפוי הכמותי יסודות (או microanalysis יסודות) ברקמות ביולוגיות עם מכשור שולחן תואם באופן מלא עם מיקרוסקופיה אופטית קונבנציונלית. הגישה שלנו מבוססת על ספקטרוסקופיית לייזר המושרה ההתמוטטות (טכנולוגית LIBS). בLIBS, דופק לייזר הוא על המדגם של עניין ממוקד כדי ליצור את ההתמוטטות וניצוץ של החומר. הקרינה האטומית הנפלטת בפלזמה מנותחת לאחר מכן על ידי ספקטרומטר וelemenניתן לאחזר ריכוזי טל עם מדידות כיול מבוצעות מראש ^13,14. היתרונות של LIBS כוללים רגישות (מיקרוגרם / גרם כמעט לכל אלמנטים), קומפקטיות, הכנת מדגם בסיסית מאוד, היעדר מגע עם המדגם, תגובה מיידית ומקומי דווקא ניתוח (מיקרו) לפני השטח. עם זאת, היישום של הדמיה כימית רקמה נותר מאתגר מאז אבלציה הלייזר של רקמה חייבת להיות מבוקר היטב לבצע מפות עם רזולוציה מרחבית גבוהה יחד עם רגישות בטווח מיקרוגרם / g ^15,16.

עם פתרון כזה, ספוח של קליעים נותבים או סוכני תיוג אינו נחוץ, המאפשר איתור מרכיבים אורגניים ישירות בסביבה המקומית שלהם ברקמות ביולוגיות. מכשיר LIBS שפותח במעבדה שלנו מציע רזולוציה נוכחית נחות 100 מיקרומטר עם רגישות המשוערת לקב"ה מתחת 35 מיקרוגרם / g, שווה ערך ל 0.1 מ"מ ^16, המאפשרהמיפוי של דגימות גדולות (> 1 סנטימטר ²⁾ בתוך 30 דקות. בנוסף, תוכנת תוצרת בית מאפשרת הרכישה וניצול של הנתונים. מכשיר זה משמש לאיתור, המיפוי ולכמת את רקמות ההפצה של גדוליניום מבוסס חלקיקים (ה ') ^17-18 בכליות ודגימות גידול מבעלי חיים קטנים, 1-24 שעות לאחר הזרקה תוך ורידית של החלקיקים (גודל <5 ננומטר) . אלמנטים אורגניים, שמכילים באופן מהותי ברקמה ביולוגית, כמו Fe, Ca, Na, ו-P, יש גם זוהו וצלמו.

Protocol

1. הכנת דוגמאות ביולוגית

כל הניסויים שתוארו במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים ושימוש בCECCAPP (ליון, צרפת) (# אישור LYONSUD_2012_004), והניסויים בוצעו תחת הפיקוח של אנשים מורשים (L. Sancey, # אישור DDPP 38 05 32).

1. הוסף 1 מיליליטר של H ₂ O לשל חלקיקים המבוססים על גדוליניום (ה ') 100 μmol, חכה 15 דקות, ולהוסיף 20 μl של 50 HEPES מ"מ, NaCl 1.325 M, CaCl ₂ 20 מ"מ לשל H ₂ O 100 μl ו80 μl הפתרון העיקרי של חלקיקים המבוססים על ה 'כדי להשיג פתרון 200 μl ב40 מ"מ מוכן ללהזריק (עיר: וילרבאן, במעבדה).
2. להזריק את הפתרון מבוסס חלקיקי הקב"ה 200 μl לווריד למכרסמי נושאות גידולים בהרדמה (עיר: Lyon Sud (Oullins), 15 קילומטר מהמעבדה).
3. 1-24 שעות לאחר ההזרקה, להקריב את העכבריםd לשים את הדגימות הביולוגיות לisopentane מקורר על ידי חנקן נוזלי. לאחסן דגימות ב-- 80 ° C (סיטי: ליון Sud (Oullins), 15 קילומטר מהמעבדה).
4. פורסים את המדגם (עיר: בדרך כלל גרנובל, מהמעבדה 100 קילומטר; אני אנסה יש גישה בליון Sud) ב100 שקופיות מיקרומטר עבות ולשים את השקופיות הביולוגיות על מנות ספציפיות פלסטיק (צלחת פטרי). חנות ב -80 ° C.
   הערה: מנות פלסטיק הן בעצם מדגם פולימר טהור מאוד. הם נמצאים בשימוש כדי למנוע הפרעה עם אלמנטים כלולים ברקמות.

2. הכנת דוגמאות לכיול

1. הכן בקבוקונים עם הגדלת מינון של nanoparticle מבוסס הקב"ה למים (0 ננומטר, 100 ננומטר, 500 ננומטר, 1 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 10 מיקרומטר, 50 מיקרומטר, 100 מיקרומטר, 500 מיקרומטר, 1 מ"מ, ו5 מ"מ).
2. שים 5 μl שחרר של כל פתרון במרווח קבוע של 3 מ"מ בצלחת פטרי.
3. יבש בטמפרטורת חדר למשך 20 דקות.

3. ניסוי LIBS

1. אתחול התקנת LIBS
   1. הגדרות לייזר. לאחר המעבר במכשירים, חכה 10-20 דקות לייצוב אנרגיה דופק לייזר והרגעות של המצלמה ICCD ל-20 ° C. התאם את האנרגיה הדופק עם המחליש.
      הערה: הפרמטרים הלייזר האופטימליים לרקמות מיפוי הם 5 NSEC משך דופק, 1,064 אורך גל, ואנרגיה דופק של כ -4 MJ. הלייזר משתמש הוא Nd טיפוסי: לייזר YAG שבריר שנייה.
   2. LIBS הגדרות. הגדר את עמדת לייזר התמקדות (ביחס למשטח המדגם) כדי לקבל את קוטר המכתש הקטן (כ -50 מיקרומטר או פחות).
      שים לב: זה מתאים מקוד דופק לייזר מתחת לפני השטח המדגם 100 מיקרומטר.
   3. הגדרות ספקטרומטר. השתמש בספקטרומטר צ 'רני טרנר בשילוב עם 1,200 קווים / מ"מ צורם ומצלמה ICCD הרזולוציה גבוהה זמנית. לשלוט בכל התקנים אלה על ידי מחשב. הגדר את ערך חריץ הזנה ל40 מיקרומטר. הגדר את טווח הספקטרום מחדשGarding האלמנט להיות מנותחים. השתמש בטווח הספקטרום מכסה 325-355 ננומטר כדי לזהות את האלוקים ברגישות גבוהה, כמו גם Na, Cu ו Ca. הגדר את הפרמטרים ICCD באיחור של 300 NSEC, שער 2 μsec, ורווח של 200.
2. מדידת מיפוי
   1. מניחים את המדגם הביולוגי על בעל מדגם LIBS ממונע.
   2. התאם את הגובה של המדגם בהתאם למיקום מוקד הלייזר.
   3. קח את תמונה ברזולוציה גבוהה של פרוסת המדגם.
   4. הגדר את מודול המיפוי של תוכנת רכישת LIBS לבצע מפה עם בדרך כלל 100 x 100 נקודות מדידה במרווחים על ידי רזולוציה של כ -100 מיקרומטר.
   5. הפעל את הרכישה. מנקודה זו להפוך כל דבר; נע ברצף, כמו גם הקלטת הספקטרום וחיסכון. 40 דקות נדרשות למיפוי של 10,000 נקודות (שווה ערך ל 1 סנטימטר ² ל100 רזולוציה מיקרומטר). קיבוץ מחדש של כל הספקטרום שנרשם לאותו קובץ.
   6. כאשר finished, לצלם שני של פרוסת המדגם
3. כיול מכשיר מדידה

עם אותם הפרמטרים ניסיוניים, למדוד את דגימות הכיול (לפרטים הכנה, ראה סעיף 2). לבצע מפה או ספקטרום שיא 25 (המתקבל מאתרי מדידה בחלק המרכזי של הירידה) בכל אחת מטיפי הכיול.

4 LIBS ספקטרום ניתוח:. בנייה של תמונות כימיות

1. שיא של כל ספקטרום LIBS ממיפוי הרקמות ולטעון אותם בניתוח תוכנת LIBS. הפחת את הבסיס עבור כל ספקטרום ולבנות את התמונות כימיות עם קנה מידה עוצמה יחסי באמצעות צבע שווא.
   הערה: אלגוריתם מאחזר עוצמות שורה מסוימות, כגון אלוקים, Cu, Na, או Ca.
2. לבצע את אותה פעולה על הספקטרום שנמדד מהמדגם המכויל כדי לאפשר חישוב עקומות כיול (יחס בין האינטנסיביות וריכוז) ולבנות aqמפת uantitative או תמונה לקב"ה (או רכיב אחר של ריבית).
3. החל את הטיפולים מתאימים לתמונות כימיות, כגון אינטרפולציה או החלקה. שמור את המפות בעוצמה או ריכוז בפורמט תמונה (מפת סיביות).

תוצאות

כפי שניתן לראות בתרשים 1, הקרן של Nd: YAG לייזר באורך הגל הבסיסי של 1,064 ננומטר היה ממוקד אנכי כלפי מטה על פרוסת הרקמה על ידי עדשה של קוורץ 50 מ"מ מרחק מוקד. האנרגיה הדופק הייתה 4 MJ ושיעור החזרה 10 הרץ. על מנת להימנע מהדור של פלזמה באוויר, קרן הלייזר הייתה ממוקדת סביב...

Discussion

יחול על דגימה ביולוגית, טכניקה זו מאפשרת הדמיה הכימית, כלומר המיפוי והכימות, ה 'וסי מחלקיקים המבוססים על ה' שהוחדרו באיברים שונים. מההגדרות קריטיות העיקריות, השליטה בתכונות לייזר (אורך גל, אנרגיה דופק, התמקדות, ויציבות) היא קריטית לאבלציה מדויקת ועדינה רקמה

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample