レーザー誘起ブレークダウン分光法：臓器組織内のナノ粒子のマッピングと定量化のための新たなアプローチ

要約

薄い臓器や腫瘍組織で実行レーザー誘起ブレークダウン分光法は、成功したGd系ナノ粒子から発行された自然の要素と人工的に注入されたガドリニウム（Gd）を検出しました。化学元素の画像が100μmであり、定量的なサブミリ感度の解像度に達した。標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの相溶性が同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。

要約

レーザ誘起プラズマの発光分光法は、生体試料の元素分析に適用した。レーザ誘起ブレークダウン分光法（LIBS）げっ歯類組織の薄切片上で行わ：、腎臓および腫瘍例えば、（i）のNa、Ca、CuやMgの、P、及びFe等の無機元素の検出を可能にする、体内に自然に存在し（II）SiとGdが、ガドリニウム系ナノ粒子の注入後に検出。動物は、粒子の静脈内注射後1〜24時間後に安楽死させた。試料の二次元走査が、赤外レーザ光 ​​が横解像度が100未満μmは表面を探索させ、電動マイクロメートル3Dステージを用いて行わ。臓器内部のGd元素の定量化学画像は、サブmMの感度が得られた。 LIBSは、特定のlabeliなしに無機材料の分布を研究するためのシンプルかつ堅牢な方法を提供していますNG。 、元素、分子、または細胞：さらに、標準的な光学顕微鏡法を使用してセットアップの適合性は、応答の異なる種類の同じ生物学的組織の複数の画像を提供するためのその可能性を強調している。

概要

生物学的用途のためのナノ粒子の広い開発は、生物学的サンプルでの定量化や画像化のための分析技術の並列改善を促した。通常、臓器中のナノ粒子の検出およびマッピングは、蛍光または共焦点顕微鏡法によって作製される。残念ながら、これらの方法は、特にその疎水性のために、非常に小さいナノ粒子、ナノ粒子の生体内分布を変更することができ、近赤外色素によるナノ粒子のラベル付けを必要とする。ラベルされたナノ粒子の検出、および特に非常に小さいナノ粒子（サイズ<10 nm）は、このように全身の規模ではなく、組織および細胞レベルでその生体内分布を妨害する可能性があります。任意のラベルなしでナノ粒子を検出することができ、新しいデバイスの開発は、彼らの行動や反応速度の研究のための新たな可能性を提供しています。さらに、脳内の鉄や銅などの微量元素の役割は、傷病アルツハイマー^1、メンケス^2,3、またはウィルソン⁴などのDの神経変性疾患は、組織におけるこれらの要素を研究し、ローカライズするために興味をお勧めします。

様々な技術が、異なる材料の元素マッピング又は微量分析を提供するために使用されてきた。 2006年に公開された彼らのレビュー論文では、R. Lobinski らは、生物学的環境、分析科学⁵のための最も挑戦的な環境の一つでの微量元素分析のために利用可能な標準的な技術の概要を説明しました。元素濃度が十分であれば、透過型電子顕微鏡におけるエネルギー分散型X線マイクロアナリシスから成り電子マイクロプローブが、多数の研究に適用することができる（> 100〜1,000μgの/ g）であった。検出下限に到達するために、以下の技術が使用されている。

• 用いたイオンビームマイクロ粒子励起X線発光μ-PIXE（1月10日μgの/ g）を⁶
• SYNchrotron放射微量分析μ-SXRF（0.1〜1μgの/ g）を⁷
• 二次イオン質量分析法（SIMS 0.1μgの/ g）を⁸
• （/ gの0.01μgのまで）レーザーアブレーション誘導結合質量分析、LA-ICP-MS ^9,10

Lobinski らから抽出された表1に示すように、上記の技術は、マイクロメートル分解能を提供する。

シリアル2D調査の3次元再構成も深部組織¹¹の再構築のために提案することができた。しかし、すべてのデバイスとシステムが両方の高い高価な機器への適度な有資格の専門家、および長期的な実験（μ-SXRF用×100〜100μmでとLA-ICP-MS用のX 10ミリメートル10ミリメートルのため、通常以上の4時間を必要とする^）12。要するに、これらの要件は、微量元素分析が非常に制限し、従来の光学イメージングシステムとの互換性が確認蛍光顕微鏡や非線形顕微鏡。ここで言及することができますもう一つのポイントは、定量的な測定能力はまだかなり限られており、マトリックスマッチング実験室の規格の利用可能性に依存することである。さらに、業界プロセスにおける微量元素分析の利用の一般化、地質学、生物学、アプリケーションの他のドメインは、重要な概念や技術革新を生成します。

現在の原稿の目的は、従来の光学顕微鏡と完全な互換性を卓上計測機器との生物学的組織における定量元素マッピング（または微量元素分析）のためのソリューションを提案することである。我々のアプローチは、レーザー誘起ブレークダウン分光法（LIBS技術）に基づいています。 LIBSに、レーザーパルスは、材料の破壊や火花を作成するために、対象サンプルに焦点を当てています。血漿中に放出された原子放射線は、その後、分光計とエレメンによって解析されているTAL濃度は^13,14予め行わ較正測定で取得できます。 LIBSの利点は、感度（μgの/ gで、ほぼすべての要素）、コンパクト、非常に基本的なサンプル調製、試料との接触がない場合、瞬時の応答と正確にローカライズされた（マイクロ）表面分析が含まれています。組織のレーザアブレーションは、微細に一緒μgの/ gの範囲^15,16内の感度で高空間分解能でマッピングを行うように制御しなければならないので、組織化学的画像化の適用は困難なままである。

このようなソリューションでは、トレーサーまたは標識剤の付加は、生物学的組織におけるそれらのネイティブ環境で直接無機元素を検出することを可能にする、必要とされていません。我々の研究室で開発されたLIBS機器が可能に0.1 mMの¹⁶に相当35μgの/ g未満のGdの推定感度が100μmよりも劣っ現在の解像度を提供しています大規模なサンプルのマッピング（> 1 cm ^2）を 30分以内。また、自家製のソフトウェアは、データの取得や活用を促進します。この器具は、（Gdの）マップを検出し、およびガドリニウムの組織分布を定量化するために使用される系ナノ粒子^{17 -}小動物から腎臓および腫瘍サンプル¹⁸ 1〜24時間の粒子の静脈内注射（サイズ<5 nm）の後に。例えば、鉄、カルシウム、ナトリウム、及びPのような本質的に、生体組織に含まれる無機元素は、、、も検出し、画像化されている。

プロトコル

1。生物試料の調製

この研究で説明されているすべての実験はCECCAPP（リヨン、フランス）（承認番号のLYONSUD_2012_004）の動物実験委員会によって承認された、そして実験が許可された個人（L. Sancey、DDPP承認番号の監督の下で実施した38 05 32）。

1. 、ガドリニウム（Gd）系ナノ粒子の100マイクロモルに、H ₂ Oを1ミリリットルを追加し、15分待ってから、H ₂ Oを100μLと80μlに、HEPES 5020μlのmMの、塩化ナトリウム1.325 M、 _塩化カルシウム20ミリ追加のGd系ナノ粒子の一次溶液をすぐに注入を40mM（：ヴィルール、実験室での市）で200μlの溶液を得た。
2. 静脈麻酔し、腫瘍を有するげっ歯類（：リヨンシュッド（ウラン）、研究室から15キロ市）に200μLのGd系ナノ粒子液を注入する。
3. 1月24日時間注射後、マウスを犠牲に液体窒素で冷却したイソペンタンへの生物学的サンプルを入れてDをサンプルで保存 - 80℃（市：リヨンシュッド（ウラン）、研究室から15キロ）。
4. サンプルスライス（市：通常グルノーブル、研究室から100キロを、私はリヨンシュッドでのアクセスを持つようにしようとします）厚さ100μmのスライドで、特定のプラスチック皿（シャーレ）に生物学的なスライドを置く。 -80℃で保存
   注意：プラスチック皿、基本的には非常に純粋なポリマーサンプルです。これらは、組織に含まれる要素との干渉を回避するために使用される。

キャリブレーションのための2。サンプル調製

1. （0 nMで、100nmであり、500nmであり、1μM、5μM、10μM、50、100μM、500μMの、1 mmであり、5 mM）を水の中にGdをベースナノ粒子の投与量の増加に伴って、バイアルを準備します。
2. 定期的にペトリ皿に3ミリメートルだけ離れた各溶液5μLドロップを置く。
3. 20分間室温で乾燥した。

3。LIBS実験

1. LIBSの設定​​を初期化する
   1. レーザー設定。楽器を切り替えた後、レーザパルスエネルギーの安定化のために10〜20分待ってから-20℃にICCDカメラの上下冷却アッテネータとパルスエネルギーを調整します。
      注：マッピング組織に対する最適なレーザパラメータは、5ナノ秒のパルス持続時間、波長1064nm、及び約4ミリジュールのパルスエネルギーである。レーザー使用する典型的なのNdです：YAGレーザーナノ秒レーザー。
   2. LIBS設定。小さいクレーター径（約50μm以下）を得るために（試料表面に対する）レーザー焦点位置を設定します。
      注意：これは100μmの試料表面下のレーザパルスカリゼーションに対応しています。
   3. 分光器の設定。 1200本/ mm回折格子と高時間分解能ICCDカメラと組み合わせたツェルニーターナー分光計を使用してください。コンピュータですべてのこれらのデバイスを制御します。 40μmの入射スリット値を設定します。スペクトル範囲の再設定解析対象となる要素をゴルディング。スペクトルを高感度でのGdを検出するために、325から355 nmの範囲をカバーするだけでなく、ナトリウム、CuおよびCAを使用。 300ナノ秒の遅延、2秒のゲート、および200のゲインとICCDのパラメータを設定します。
2. マッピング測定
   1. LIBS電動試料ホルダーに生物学的サンプルを置きます。
   2. レーザーの焦点位置に応じて、試料の高さを調整します。
   3. サンプルスライスの高解像度の写真を撮る。
   4. 約100μmの解像度を隔て、通常100×100の測定点でマップを実行するために、LIBS取得ソフトウェアのマッピングモジュールを設定します。
   5. 取得を開始します。この時点からすべてを自動化する。配列ならびにスペクトル記録を移動して保存する。 40分間、10,000点（100μmの解決のために1cm ^2の等価）のマッピングのために必要とされる。同じファイルに記録されたすべてのスペクトルを再編成する。
   6. 場合には、Finished、サンプルスライスの2枚目の写真を撮る
3. キャリブレーション測定

同じ実験パラメータを用いて、（、調製の詳細はセクション2を参照）キャリブレーションサンプルを測定する。マップを実行するか、または較正液滴の各々に（ドロップの中央部の測定部位から得られた）25のスペクトルを記録する。

4 LIBSスペクトル解析：化学·イメージの構築

1. レコードのすべてのLIBS組織マッピングからのスペクトルとLIBSのソフトウェア解析でそれらをロードします。各スペクトルのベースラインを引き、偽色を使用して、相対強度スケールとの化学的画像を構築する。
   注意：このアルゴリズムは、Gdの、銅、ナトリウム、またはCaなどの特定のライン強度を取得します。
2. 検量線の計算（強度と濃度との関係）を許可し、水溶液を構築するために校正されたサンプルから測定されたスペクトルに同じ操作を実行uantitativeマップや画像のGd（または関心のある他の要素）。
3. このような補間やスムージングなどの化学画像に適切な治療法を適用します。画像フォーマット（ビットマップ）での強度や濃度マップを保存します。

結果

図1に示すように、Ndをビームが：1064nmの基本波長でのYAGレーザは50ミリメートルの焦点距離の石英レンズにより組織切片上に垂直に集中していた。パルスエネルギーは4ミリジュール及び繰返し率10Hzであった。空気中でプラズマの発生を回避するために、レーザビームが試料の表面下100μmの周りに集中していた。空気プラズマは、この状態で観察されなかった。実験の間、サンプ...

ディスカッション

生物学的サンプルに適用され、この技術は、異なる器官内に注射のGd系ナノ粒子からのGdとSiのマッピングと定量化、 すなわち 、化学イメージングを可能にする。主な重要な設定から、レーザ特性（波長、パルスエネルギー、フォーカス、および安定性）の制御が正確かつ細かい組織切除（ すなわちマッピング分解能）のためだけでなく、感度のために重要である。高エネルギ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample