Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe

Zusammenfassung

Laser-Emissionsspektroskopie an dünnen Organ-und Tumorgewebe durchgeführt erfolgreich erkannt natürlichen Elemente und künstlich injiziert Gadolinium (Gd), von Gd-Nanopartikel auf der Basis ausgestellt. Bilder von chemischen Elementen erreicht eine Auflösung von 100 um und quantitative Unter mM Empfindlichkeit. Die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder von einer gleichen biologischen Gewebes bereitzustellen.

Zusammenfassung

Emissionsspektroskopie des laserinduzierten Plasmas wurde einer Elementaranalyse biologischer Proben. Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS) auf Dünnschnitten von Gewebe durch Nagetier: Nieren-und Tumor, ermöglicht die Erkennung von anorganischen Elementen wie (i) Na, Ca, Cu, Mg, P und Fe, die natürlich im Körper vorhanden ist und (ii) Si und Gd, erfasst nach der Injektion von Gadolinium-basierte Nanopartikel. Wurden die Tiere eingeschläfert 1 bis 24 h nach intravenöser Injektion von Partikeln. Eine zweidimensionale Abtastung der Probe unter Verwendung eines motorisierten Mikrometer 3D-Stufe erlaubt die Infrarot-Laserstrahl Erkundung der Oberfläche mit einer lateralen Auflösung von weniger als 100 μ m. Quantitative chemische Bilder von Gd-Element innerhalb der Orgel wurden mit sub-mm-Empfindlichkeit. LIBS bietet eine einfache und robuste Methode, um die Verteilung der anorganischen Materialien ohne spezielle LABÉLI studierenng. Darüber hinaus ist die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder des gleichen biologischen Gewebes mit verschiedenen Arten von Antwort zu geben: Elementar, molekularen oder zellulären.

Einleitung

Die breite Entwicklung der Nanopartikel für biologische Anwendungen parallel forderte die Verbesserung der analytischen Techniken für ihre Quantifizierung und Bildgebung in biologischen Proben. Üblicherweise die Detektion und die Abbildung der Nanopartikel in Organe durch Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler. Leider erfordern diese Verfahren die Markierung der Nanopartikel von einer Nahinfrarot-Farbstoff, der die biologische Verteilung der Nanopartikel besonders für sehr kleine Nanopartikel aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften modifizieren können. Der Nachweis von Nanopartikeln markiert und vor allem die sehr kleinen Nanopartikel (Größe <10 nm), könnte daher mit ihren biologischen Verteilung stören am ganzen Körper Skala, sondern auch an den Gewebe-und Zell Ebenen. Die Entwicklung der neuen Geräte in der Lage, Nanopartikel ohne Kennzeichnung zu erkennen bietet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von deren Verhalten und Kinetik. Außerdem ist die Rolle von Spurenelementen wie Eisen und Kupfer in eine Gehirnerkrankungend neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer ^1, Menkes ^2,3 oder ⁴ Wilson vorschlagen, das Interesse zu studieren und zu lokalisieren, die diese Elemente in Geweben.

Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um Elementverteilungs oder Mikroanalyse von verschiedenen Materialien. In ihrer 2006 veröffentlichten Übersichtsarbeit, R. lobinski et al. Einen Überblick der verfügbaren Standardtechniken für die Mikroelementaranalyse in biologischen Umgebung, einer der anspruchsvollsten Umgebungen für analytische Wissenschaften ^5. Die Elektronenmikrosonde, die von energiedispersiven Röntgenmikroanalyse in einem Transmissions-Elektronenmikroskop besteht, kann zu zahlreichen Studien angewendet werden, wenn der Elementkonzentration ausreichend ist (> 100-1.000 &mgr; g / g). Um niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen, haben die folgenden Techniken verwendet:

• Ionenstrahl-Mikropartikel mit induzierte Röntgenemission μ-PIXE (1-10 &mgr; g / g) ⁶
• synchrotronstrahlung Mikroanalyse μ-SXRF (0,1-1 g / g) ⁷
• Sekundärionen-Massenspektrometrie SIMS (0,1 ug / g) ⁸
• Laserablation induktiv gekoppelte Massenspektrometrie LA-ICP-MS (bis zu 0,01 g / g) ^9,10

Die oben erwähnten Techniken bieten mikrometrischer Auflösung wie in der Tabelle 1 von lobinski et al extrahiert gezeigt.

3D-Rekonstruktion von seriellen 2D-Untersuchungen könnte auch für den Wiederaufbau der tieferen Gewebe ¹¹ vorgeschlagen werden. Alle Geräte und Systeme erfordern jedoch sowohl qualifizierte Fachkräfte, mäßig bis stark teure Ausrüstung und lang anhaltende Experimente (in der Regel mehr als 4 Stunden für eine 100 um · 100 um für μ-SXRF und 10 mm x 10 mm für die LA-ICP-MS ) ^12. Insgesamt machen diese Anforderungen elementare Mikroanalyse sehr einschränkenden und mit herkömmlichen optischen Abbildungssystemen nicht kompatibel,Fluoreszenzmikroskopie oder nichtlineare Mikroskopie. Ein weiterer Punkt, den wir hier zu erwähnen ist, dass der quantitative Messfähigkeit ist noch recht begrenzt und hängt von der Verfügbarkeit der Matrix abgestimmt Laborstandards. Die weitere Verallgemeinerung der Verwendung von elementarem Mikroanalyse in Industrieprozessen, Geologie, Biologie und anderen Bereichen der Anwendungen erhebliche konzeptionelle und technologische Durchbrüche zu erzeugen.

Der Zweck der vorliegenden Manuskript ist es, Lösungen für die quantitative Elementar Mapping (oder Mikroelementaranalyse) in biologischen Geweben mit einer Tisch Instrumentierung voll kompatibel mit herkömmlichen optischen Mikroskopie vorgeschlagen. Unser Ansatz basiert auf dem Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS-Technologie) basiert. In LIBS wird ein Laserimpuls auf der interessierenden Probe fokussiert, um den Abbau und die Funken des Materials zu erstellen. Die atomare Strahlung im Plasma emittierte wird anschließend von einem Spektrometer analysiert und der elementarental-Konzentrationen können mit Kalibrierungsmessungen durchgeführt, vorher ^13,14 abgerufen werden. Die Vorteile umfassen LIBS Empfindlichkeit (g / g für fast alle Elemente), Kompaktheit, sehr einfache Probenvorbereitung, ohne Kontakt mit der Probe, sofortige Reaktion und präzise lokalisiert (Mikro)-Oberflächenanalyse. Die Anwendung von Gewebe chemische Bildgebung bleibt jedoch eine Herausforderung, da die Laser-Ablation von Gewebe muss fein gesteuert, um Karten mit hoher räumlicher Auflösung zusammen mit Empfindlichkeit in der ug / g-Bereich ^15,16 durchzuführen.

Mit einer solchen Lösung ist die Hinzunahme von Tracern oder Markierungsmittel nicht benötigt, das Erkennen ermöglicht anorganische Elemente direkt in ihrer natürlichen Umgebung in biologischen Geweben. Die LIBS Instrument in unserem Labor entwickelt bietet eine aktuelle Auflösung geringer als 100 &mgr; m mit einem geschätzten Empfindlichkeit Gd unter 35 ug / g, entsprechend 0,1 mM ^16, die ermöglichtdie Abbildung von großen Proben (> 1 cm ²⁾ innerhalb von 30 min. Darüber hinaus erleichtert die hausgemachte Software die Übernahme und Nutzung der Daten. Dieses Instrument wird verwendet, um zu erfassen, anzeigen, und die Quantifizierung der Gewebeverteilung von Gadolinium (Gd)-Nanopartikel, ^{17. - 18.} in Nieren und Tumorproben von Kleintieren, 1 bis 24 h nach der intravenösen Injektion der Partikel (Größe <5 nm) . Anorganischen Elementen, die an sich in einem biologischen Gewebe enthalten sind, wie Fe, Ca, Na und P, wurden ebenfalls festgestellt und abgebildet.

Protokoll

1. Biologische Probenvorbereitung

Alle in dieser Studie beschriebenen Experimente wurden von der Animal Care und Verwenden Ausschuss des CECCAPP (Lyon, Frankreich) (Genehmigung # LYONSUD_2012_004) zugelassen, und die Versuche wurden unter der Aufsicht von autorisierten Personen (L. Sancey, DDPP Genehmigung durchgeführt # 38 05 32).

1. 1 ml H ₂ O auf 100 umol Gadolinium (Gd)-basierte Nanopartikel, warten Sie 15 min, und fügen Sie 20 ul HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M CaCl ₂ 20 mm bis 100 ul H ₂ O und 80 ul der primären Lösung von Gd-basierte Nanopartikel, um eine Lösung bei 200 ul 40 mM bereit für die Injektion (: Villeurbanne, im Labor-Stadt) zu erhalten.
2. Spritzen Sie die 200 ul Gd-basierte Nanopartikel-Lösung intravenös in anästhesiert tumortragenden Nagetiere (Stadt: Lyon Sud (Oullins), 15 km von der Labor).
3. 1-24 Stunden nach der Injektion, opfern die Mäuse eind die biologischen Proben in Isopentan mit flüssigem Stickstoff gekühlt setzen. Lagern Sie die Proben bei - 80 ° C (Stadt: Lyon Sud (Oullins), 15 km von der Labor).
4. Schneiden Sie die Probe (Ort: in der Regel Grenoble, 100 km aus dem Labor, werde ich versuchen, einen Zugang in Lyon Sud haben) in 100 um dicke Folien und legte die biologische gleitet auf bestimmte Kunststoffschalen (Petrischale). Bei -80 ° C
   Hinweis: Kunststoffgeschirr sind im Grunde eine sehr reine Polymerprobe. Sie werden verwendet, um Interferenzen mit den Elementen in dem Gewebe enthaltenen vermeiden.

2. Probenvorbereitung für die Kalibrierung

1. Vorbereitung Fläschchen mit steigenden Dosen von Gd-basierte Nanopartikel in Wasser (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM und 5 mM).
2. Setzen Sie ein 5 ul-Tropfen jeder Lösung von 3 mm auf der Petrischale regelmäßig angeordnet sind.
3. Trocken bei Raumtemperatur für 20 min.

3. LIBS Experiment

1. Initialisieren der LIBS-Setup
   1. Laser-Einstellungen. Nach dem Einschalten der Geräte, warten 10-20 min für eine Laserpulsenergie Stabilisierung und Abkühlung der ICCD-Kamera auf -20 ° C Stellen Sie die Pulsenergie mit dem Dämpfungsglied.
      Hinweis: Die optimalen Laserparameter zum Abbilden Gewebe 5 ns Pulsdauer, 1.064 nm Wellenlänge und Impulsenergie von etwa 4 mJ. Der Laser verwendet einen typischen Nd: YAG-Laser Nanosekunden.
   2. LIBS-Einstellungen. Set der Laserfokussierungsposition (bezüglich der Probenoberfläche), um die kleineren Kraterdurchmesser zu erhalten (etwa 50 um oder weniger).
      Anmerkung: Dies entspricht einer Laserpuls Fokalisierung 100 &mgr; m unter der Oberfläche der Probe.
   3. Spektrometer-Einstellungen. Verwenden Sie die Czerny-Turner-Spektrometer in Kombination mit einem 1200 Linien / mm Gitter und einer hohen zeitlichen Auflösung ICCD Kamera. Steuern Sie alle diese Geräte über einen Computer. Stellen Sie den Eingangsspalt Wert bis 40 um. Stellen Sie die Wieder SpektralbereichGarding das Element analysiert werden. Verwenden Sie den Spektralbereich abdecken 325-355 nm zu G-tt mit hoher Empfindlichkeit zu erfassen, sowie Na, Cu und Ca. Festlegen der ICCD Parameter mit einer Verzögerung von 300 ns, einer Gate von 2 &mgr; s und einer Verstärkung von 200.
2. Mapping Mess
   1. Legen Sie die biologische Probe auf der LIBS motorisierte Probenhalter.
   2. Einstellen der Höhe der Probe gemäß der Laserfokusposition.
   3. Nehmen Sie ein hochauflösendes Foto von der Probenscheibe.
   4. Stellen Sie die Mapping-Modul der LIBS-Erfassungssoftware, um eine Karte mit in der Regel 100 x 100 Messpunkten durch eine Auflösung von etwa 100 um Abstand durchzuführen.
   5. Starten Sie die Aufnahme. Von diesem Punkt alles zu automatisieren; das Bewegungsfolge als auch das Spektrum aufgenommen und gespeichert werden. 40 min nach einer Zuordnung von 10.000 Punkten (äquivalent zu 1 cm ² für 100 &mgr; m Auflösung) erforderlich. Umgruppieren alle aufgenommenen Spektren in der gleichen Datei.
   6. Wenn fertig, nehmen Sie ein Foto von der zweiten Probe Scheibe
3. Kalibrierung Mess

Mit den gleichen experimentellen Parameter, messen die Eichproben (Herstellung Details siehe Abschnitt 2). Führen Sie eine Karte oder Rekord 25 Spektren (von Messstellen im Mittelteil des Tropfens erhalten) in jedem der Kalibrierung Tropfen.

4 LIBS Spectrum Analysis:. Konstruieren von Chemical Images

1. Notieren Sie alle LIBS Spektren aus dem Gewebe-Mapping und laden Sie sie in der LIBS Software-Analyse. Subtrahieren Sie die Grundlinie für jedes Spektrum und bauen die chemischen Bilder mit relativen Intensitätsskala unter einer falschen Farbe.
   Hinweis: Ein Algorithmus ruft bestimmte Linienintensitäten, wie Gd, Cu, Na oder Ca.
2. Führen Sie den gleichen Vorgang auf die Spektren aus der kalibrierten Probe gemessen, um die Kalibrierungskurven-Berechnung (Beziehung zwischen Intensität und Konzentration) zu ermöglichen und zu bauen aqengen Karte oder Bild für Gd (oder ein anderes Element von Interesse).
3. Übernehmen Sie die angemessene Behandlung der chemischen Bilder, wie Interpolation oder Glättung. Speichern Sie die Intensität oder Konzentration Karten im Bildformat (Bitmap).

Ergebnisse

Wie in Fig. 1, der Strahl eines Nd dargestellt: YAG-Laser in der Grundwellenlänge von 1.064 nm wurde vertikal nach unten auf das Gewebeschnitt durch eine Quarzlinse mit 50 mm Brennweite fokussiert. Die Pulsenergie betrug 4 mJ und die Wiederholungsrate von 10 Hz. Um die Erzeugung von Plasma in Luft zu vermeiden, wurde der Laserstrahl etwa 100 &mgr; m unter der Oberfläche der Probe fokussiert. Keine Klima Plasma wurde in diesem Zustand beobachtet. Während der Versuche wurde die Probe durch einen Sc...

Diskussion

Um biologische Probe aufgebracht wird, ermöglicht diese Technik die chemische Bildgebung, dh die Zuordnung und Quantifizierung von Gd und Si aus injiziert Gd-basierte Nanopartikel in verschiedenen Organen. Von den wichtigsten kritischen Einstellungen, ist die Steuerung der Lasereigenschaften (Wellenlänge, Pulsenergie, wobei der Schwerpunkt und Stabilität) entscheidend für eine präzise und feine Gewebeabtragung (dh Zuordnung Auflösung) als auch für Sensibilität. Arbeiten bei hoher Energie liefer...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample