Induite par laser Répartition Spectroscopy: Une nouvelle approche pour la cartographie et la quantification de nanoparticules dans les tissus d'organes

Résumé

Spectroscopie par claquage induit par laser effectués sur organe mince et le tissu tumoral a détecté avec succès des éléments naturels et gadolinium injecté artificiellement (Gd), émises à partir de nanoparticules à base de Gd. Images d'éléments chimiques ont atteint une résolution de 100 um et de la sensibilité quantitative sous-mM. La compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel pour fournir de multiples images d'un même tissu biologique.

Résumé

spectroscopie d'émission de plasma induit par laser a été appliqué à l'analyse élémentaire d'échantillons biologiques. Spectroscopie de rupture induite au laser (LIBS) effectuée sur des coupes minces de tissus de rongeurs: les reins et tumorales, permet la détection des éléments inorganiques tels que (i) Na, Ca, Cu, Mg, P et Fe, naturellement présente dans le corps et (ii) Si et D.ieu, détectés après l'injection de nanoparticules à base de gadolinium. Les animaux ont été euthanasiés 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules. Un balayage en deux dimensions de l'échantillon, effectuée en utilisant un micrométrique 3D-platine motorisée, laisse le faisceau laser infrarouge à explorer la surface avec une résolution latérale inférieure à 100 μ m. Images chimique quantitative de D.ieu élément intérieur de l'organe ont été obtenus avec la sensibilité sous-mM. LIBS est une méthode simple et robuste pour étudier la distribution de matériaux inorganiques sans labeli spécifiqueng. En outre, la compatibilité de l'installation avec la microscopie optique standard souligne son potentiel à fournir de multiples images de la même tissu biologique avec différents types de réponse: élémentaire, moléculaires ou cellulaires.

Introduction

Le large développement de nanoparticules pour des applications biologiques exhorté l'amélioration parallèle de techniques analytiques pour leur quantification et de l'imagerie dans des échantillons biologiques. Habituellement, la détection et la cartographie des nanoparticules dans les organes sont fabriqués par fluorescence ou microscopie confocale. Malheureusement, ces méthodes nécessitent l'étiquetage des nanoparticules par un colorant infrarouge proche qui peut modifier la biodistribution des nanoparticules, en particulier pour de très petites nanoparticules en raison de ses propriétés hydrophobes. La détection des nanoparticules marquées, et en particulier les très petites nanoparticules (taille <10 nm), pourrait donc interférer avec leur biodistribution à toute l'échelle du corps, mais aussi au niveau de tissus et cellules. Le développement de nouveaux dispositifs capables de détecter des nanoparticules sans étiquetage offre de nouvelles possibilités pour l'étude de leur comportement et de la cinétique. En outre, le rôle des oligo-éléments tels que le fer et le cuivre dans un cerveau maladiesd maladies neurodégénératives telles que la maladie d'Alzheimer ^1, Menkes ^2,3, ou ⁴ Wilson suggèrent l'intérêt d'étudier et de localiser ces éléments dans les tissus.

Diverses techniques ont été utilisées pour fournir la cartographie élémentaire ou microanalyse des matériaux différents. Dans leur article de synthèse publié en 2006, R. Lobinski et al. Donne un aperçu des techniques standard disponibles pour la microanalyse élémentaire en milieu biologique, l'un des environnements les plus difficiles pour les sciences analytiques ^5. La microsonde électronique, qui se compose de dispersion d'énergie micro-analyse aux rayons X dans un microscope électronique à transmission, peut être appliquée à de nombreuses études, si la concentration de l'élément est suffisante (> 100-1000 pg / g). Pour atteindre des seuils de détection inférieurs, les techniques suivantes ont été utilisées:

• microsonde faisceau d'ions en utilisant des particules induit par émission de rayons X μ-PIXE (1-10 ug / g) ⁶
• synchrotron microanalyse de rayonnement μ-SXRF (0,1-1 mg / g) ⁷
• secondaire spectrométrie de masse d'ions SIMS (0,1 pg / g) ⁸
• ablation laser couplé par induction spectrométrie de masse LA-ICP-MS (à partir de 0,01 pg / g) ^9,10

Les techniques mentionnées ci-dessus fournissent une résolution micrométrique comme indiqué dans le tableau 1 extraite de Lobinski et al.

Reconstruction 3D des enquêtes 2D série pourrait également être proposé pour la reconstruction des tissus plus profonds ^11. Cependant, tous les appareils et systèmes exigent des professionnels qualifiés, modérés à l'équipement très coûteux et des expériences durables (généralement plus de 4 h pour un 100 um x 100 um pour μ-SXRF et 10 mm x 10 mm pour LA-ICP-MS ) ^12. Au total, ces exigences font microanalyse élémentaire très contraignant et incompatible avec les systèmes d'imagerie optique classiques,la microscopie à fluorescence ou microscopie non linéaire. Un autre point que nous ne pouvons mentionner ici est que la capacité de mesure quantitative est encore assez limitée et dépend de la disponibilité des normes de laboratoire adaptation matricielle. La poursuite de la généralisation de l'utilisation de la microanalyse élémentaire dans les processus de l'industrie, de la géologie, de la biologie et autres domaines d'applications va générer des percées conceptuelles et technologiques importants.

Le but de la présente manuscrit est de proposer des solutions pour la cartographie élémentaire quantitative (ou microanalyse élémentaire) dans les tissus biologiques avec une instrumentation de table entièrement compatible avec la microscopie optique classique. Notre approche est basée sur la spectroscopie par claquage laser (technologie LIBS). Dans LIBS, une impulsion de laser est focalisé sur l'échantillon d'intérêt pour créer la ventilation et l'étincelle de la matière. Le rayonnement émis atomique dans le plasma est ensuite analysé par un spectromètre et l'élémentaireconcentrations mentales peuvent être récupérées avec des mesures d'étalonnage effectuées au préalable ^13,14. Les avantages de la LIBS comprennent sensibilité (pg / g pour presque tous les éléments), la compacité, la préparation des échantillons très basique, l'absence de contact avec l'échantillon, une réponse instantanée et précisément localisée (micro) analyse de surface. Toutefois, l'application de l'imagerie chimique des tissus reste difficile car l'ablation laser de tissu doit être finement contrôlée pour effectuer des cartes à haute résolution spatiale avec sensibilité dans la gamme pg / g ^15,16.

Avec une telle solution, l'adjonction de traceurs ou d'agents d'étiquetage n'est pas nécessaire, ce qui permet de détecter des éléments inorganiques directement dans leur environnement naturel dans les tissus biologiques. L'instrument LIBS développée dans notre laboratoire offre une résolution de courant inférieure à 100 um avec une sensibilité estimée pour Gd-dessous de 35 pg / g, ce qui équivaut à 0,1 mM ^16, qui permetla cartographie des grands échantillons (> 1 cm ²⁾ dans les 30 min. En outre, le logiciel maison facilite l'acquisition et l'exploitation des données. Cet instrument est utilisé pour détecter, carte, et de quantifier la distribution tissulaire de gadolinium nanoparticules à base de (Gd) ^{de 17 à 18} dans les reins et les échantillons de tumeur de petits animaux, de 1 à 24 h après l'injection intraveineuse de particules (taille <5 nm) . Les éléments inorganiques, qui sont incorporées à un tissu biologique, tels que Fe, Ca, Na et P, ont également été détectées et imagée.

Protocole

1. Préparation de l'échantillon biologique

Toutes les expériences décrites dans cette étude ont été approuvés par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de la CECCAPP (Lyon, France) (autorisation # LYONSUD_2012_004), et les expériences ont été réalisées sous la supervision de personnes autorisées (L. Sancey, DDPP autorisation # 38 05 32).

1. Ajouter 1 ml de H ₂ O à 100 pmol de nanoparticules à base de gadolinium-(Gd), attendre 15 minutes, et ajouter 20 ul de HEPES 50 mM, NaCl 1,325 M, _CaCl2 20 mM à 100 pi de H ₂ O et 80 pi de la solution primaire de nanoparticules à base de Gd pour obtenir une solution de 200 pi à 40 mM prêts à injecter (Ville: Villeurbanne, au laboratoire).
2. Injecter la solution de nanoparticules à base de Gd-200 de pi par voie intraveineuse à des rongeurs porteurs de tumeurs anesthésiés (Ville: Lyon Sud (Oullins), à 15 km de laboratoire).
3. 1-24 heures après l'injection, les souris sacrifier uned placer les échantillons biologiques dans l'isopentane refroidi par de l'azote liquide. Conserver les échantillons à - 80 ° C (Ville: Lyon Sud (Oullins), à 15 km du laboratoire).
4. Couper l'échantillon (Ville: généralement Grenoble, 100 km de laboratoire, je vais essayer d'avoir un accès à Lyon Sud) en 100 diapositives um d'épaisseur et de mettre les diapositives biologiques sur des plats en plastique spécifiques (boîte de Pétri). Conserver à -80 ° C.
   Remarque: plats en plastique sont essentiellement un échantillon de polymère très pur. Ils sont utilisés pour éviter les interférences avec les éléments contenus dans le tissu.

2. Préparation de l'échantillon pour l'étalonnage

1. Préparer les flacons avec des doses croissantes de nanoparticules à base de Gd dans de l'eau (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM et 5 mM).
2. Mettez un ul-goutte de chaque solution régulièrement espacées de 3 mm sur la boîte de Pétri 5.
3. À sec à la température ambiante pendant 20 min.

3. LIBS Expérience

1. Initialisation de la configuration du LIBS
   1. Paramètres laser. Après la mise sur les instruments, attendre 10-20 min pour l'impulsion laser stabilisation de l'énergie et de refroidissement de la caméra ICCD à -20 ° C. Régler l'énergie d'impulsion avec l'atténuateur.
      Remarque: Les paramètres du laser optimales pour les tissus de cartographie sont 5 ns durée d'impulsion, 1064 nm longueur d'onde, et l'énergie d'impulsion d'environ 4 mJ. Le laser utilise un laser Nd est typique: YAG laser nanoseconde.
   2. LIBS Paramètres. Régler la position de focalisation du laser (par rapport à la surface de l'échantillon) pour obtenir le diamètre du cratère plus petit (environ 50 pm ou moins).
      Remarque: Ce qui correspond à une focalisation d'impulsions laser de 100 um en dessous de la surface de l'échantillon.
   3. Paramètres du spectromètre. Utilisez le spectromètre Czerny-Turner combiné avec un 1200 traits / mm et une résolution de la caméra ICCD temporelle. Contrôler tous ces dispositifs par ordinateur. Réglez la valeur de la fente d'entrée à 40 um. Définissez la plage spectrale rements concernant l'élément à analyser. Utilisez la gamme spectrale couvrant 325 à 355 nm pour détecter Dieu avec une grande sensibilité, ainsi que Na, Cu et Ca. Définissez les paramètres de l'ICCD avec un retard de 300 ns, une porte de 2 ps, et un gain de 200.
2. Cartographie mesure
   1. Placer l'échantillon biologique sur le support d'échantillon motorisé LIBS.
   2. Ajuster la hauteur de l'échantillon en fonction de la position de focalisation du laser.
   3. Prenez une photo à haute résolution de la tranche d'échantillon.
   4. Réglez le module de cartographie du logiciel d'acquisition LIBS pour effectuer une carte avec typiquement 100 x 100 points de mesure espacés par une résolution d'environ 100 um.
   5. Lancement de l'acquisition. De ce point tout automatiser; le déplacement séquence ainsi que l'enregistrement du spectre et l'épargne. 40 min sont nécessaires pour une mise en correspondance des points de 10 000 (équivalent à 1 cm ² à une résolution de 100 um). Regrouper tous les spectres enregistrés dans un même fichier.
   6. Lorsque finished, prendre une deuxième photo de la tranche d'échantillon
3. Calibration Mesure

Avec les mêmes paramètres expérimentaux, mesurer les échantillons d'étalonnage (pour plus de détails de préparation, voir rubrique 2). Effectuer une carte ou un disque 25 spectres (obtenus à partir de sites de mesure dans la partie centrale de la goutte) dans chacune des gouttes d'étalonnage.

4 LIBS analyse de spectre. Construire des images chimiques

1. Record de tous les spectres LIBS de la cartographie du tissu et de les charger dans le logiciel d'analyse LIBS. Soustraire la ligne de base pour chaque spectre et construire les images chimiques avec échelle d'intensité relative en utilisant une fausse couleur.
   Remarque: Un algorithme récupère les intensités des raies spécifiques, tels que D.ieu, Cu, Na, Ca ou.
2. Effectuez la même opération sur les spectres mesurés à partir de l'échantillon calibré pour permettre le calcul des courbes d'étalonnage (relation entre l'intensité et la concentration) et de construire aqcarte uantitative ou l'image pour D.ieu (ou autre élément d'intérêt).
3. Appliquer les traitements adéquats pour les images chimiques, tels que l'interpolation ou de lissage. Sauvez les cartes d'intensité ou de concentration dans le format d'image (bitmap).

Résultats

Comme le montre la figure 1, le faisceau d'un laser Nd: YAG à la longueur d'onde fondamentale de 1064 nm a été concentré verticalement vers le bas sur la tranche de tissu par une lentille de quartz de 50 mm de distance focale. L'énergie d'impulsion était de 4 mJ et le taux de répétition de 10 Hz. Afin d'éviter la génération de plasma dans l'air, le faisceau laser a été focalisé autour de 100 um sous la surface de l'échantillon. Pas de plasma d'air a été o...

Discussion

Appliqué à l'échantillon biologique, cette technique permet l'imagerie chimique, à savoir la cartographie et la quantification, de D.ieu et Si à partir de nanoparticules à base de Gd injectés dans différents organes. Des principaux paramètres critiques, le contrôle des propriétés laser (de longueur d'onde, l'énergie d'impulsion, de focalisation, et de stabilité) est essentiel pour une ablation de tissus fins et précis (c.-à-résolution de la cartographie) ainsi que p...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample