Lazer kaynaklı Arıza Spektroskopisi: Organ Doku Nanopartikülün en Mapping ve Nicelik için Yeni Bir Yaklaşım

Özet

Ince organ ve tümör dokusu üzerinde yapılan lazer kaynaklı arıza spektroskopi başarıyla Gd-tabanlı nanopartikülleri çıkarılacak doğal unsurlar ve yapay enjekte gadolinyum (Gd), tespit. Kimyasal elementlerin Görüntüler 100 mikron ve kantitatif alt mM hassasiyet çözünürlüğü ulaştı. Standart optik mikroskop ile kurulum uyumluluğu aynı biyolojik doku birden fazla görüntü sağlama potansiyelini vurguluyor.

Özet

Lazer kaynaklı plazma emisyon spektroskopisi biyolojik numunelerin element analizi uygulanmıştır. Lazer kaynaklı arıza Spektroskopisi (LIBS) kemirgen dokuların ince bölümlerinde gerçekleştirilmiştir: böbrekler ve tümör sağlar, örneğin, (i), Na, Ca, Cu, Mg, P ve Fe, vücutta doğal olarak bulunan ve benzeri gibi inorganik elemanlarının tespiti (ii) Si ve Gd, gadolinyum bazlı nanopartiküllerin enjeksiyonundan sonra algılandı. Hayvanlar, parçacıkların damar içine enjeksiyonundan sonra 1-24 saat kurban edilmiştir. Numunenin iki boyutlu tarama, kızılötesi bir lazer ışını bir yanal çözünürlüğü az 100 μ m ile yüzey keşfetmek izin verilen, bir motorlu mikrometrik olarak 3D-sahne kullanılarak gerçekleştirilir. Organ içindeki Gd elementinin kantitatif kimyasal görüntüleri alt mM duyarlılığı ile elde edilmiştir. LIBS herhangi bir labeli olmayan inorganik maddelerin dağılımını incelemek için basit ve sağlam bir yöntem sunmaktadırng. , Element moleküler veya hücresel: Ayrıca, standart optik mikroskop ile kurulum uyumluluğu tepkisinin farklı tipleri ile aynı biyolojik doku birden fazla görüntü sağlama potansiyelini vurguluyor.

Giriş

Biyolojik uygulamalarda nanopartiküllerinin büyük gelişme biyolojik örneklerindeki miktar ve görüntüleme için analitik teknikler paralel iyileşme istedi. Genellikle organlarda nanopartiküllerin algılama ve eşleme floresan veya konfokal mikroskopi ile yapılır. Ne yazık ki, bu yöntem özellikle hidrofobik özellikleri nedeniyle çok küçük nano partikül için, nanopartiküllerin biyodağılımı değiştirmek için, bir yakın kızıl ötesi boya ile nanopartiküllerin etiketleme gerektirir. Etiketli nanopartiküller ve özellikle çok küçük nano partiküller (boyut <10 nm) tespiti, ve böylece bütün vücut ölçekli değil, aynı zamanda, doku ve hücre seviyelerde biyo-dağılımının etkileşebilir. Herhangi bir etiketleme olmadan nanopartıküllerıni tespit edebiliyoruz yeni cihazların geliştirilmesi davranışları ve kinetik çalışmaları için yeni olanaklar sunuyor. Ayrıca, bu tür beyin demir ve bakır gibi iz elementlerinin rolü bir hastalıklarıBöyle Alzheimer ^1, Menkes ^2,3, veya Wilson ⁴ olarak d nörodejeneratif hastalıklar dokularındaki bu unsurları incelemek ve lokalize ilgi öneririz.

Çeşitli teknikler farklı malzemelerin elemental eşleme veya mikroanaliz temin etmek üzere kullanılmıştır. 2006 yılında yayınladıkları yorumu kağıt, R. Lobinski vd. Biyolojik ortamda, analitik bilimler ⁵ için en zorlu ortamlarda birinde element mikroanalizi için mevcut standart tekniklerin bir bakış sağladı. Element konsantrasyonu yeterli ise bir transmisyon elektron mikroskobu enerji dispersif X-ışını mikroanalizi oluşur elektron mikroprob, çok sayıda çalışma uygulanabilir (> 100-1.000 ug / g). Alt algılama sınırlarını ulaşmak için aşağıdaki teknikler kullanılır olmuştur:

• kullanılarak iyon demeti mikroprop parçacık kaynaklı X-ışını emisyonu μ-PIXE (1-10 ug / g) ⁶
• synradyasyon mikroanaliz μ-SXRF chrotron (0.1-1 ug / g) ⁷
• ikincil iyon kütle spektrometrisi SIMS (0.1 ug / g), ⁸
• lazer ablasyon indüktif (aşağı 0.01 ug / g) LA-ICP-MS ^9,10 kütle spektrometresi birleştiğinde

Lobinski et al çıkarılan, Tablo 1 de gösterildiği gibi, yukarıda belirtilen teknikler mikrometrik çözünürlüğü sağlar.

Seri 2D soruşturmaların 3D rekonstrüksiyon da derin dokulara ¹¹ yeniden inşası için teklif olabilir. Ancak, tüm cihazları ve sistemlerinin her ikisi de son derece pahalı ekipman orta nitelikli profesyoneller, ve uzun süreli deneyler (bir μ-SXRF için x 100 mikron 100 mikron ve LA-ICP-MS için x 10 mm 10 mm için genellikle fazla 4 saat gerektirir ) ^12. Toplamda, bu gereksinimleri, element mikro çok kısıtlayıcı ve geleneksel optik görüntüleme sistemleri ile uyumlu halefloresan mikroskobu ya da doğrusal olmayan mikroskopisi. Burada bahsettiğimiz bir başka nokta kantitatif ölçüm yeteneği hala oldukça sınırlıdır ve matriks uyumlu laboratuvar standartları bulunmasına bağlıdır olmasıdır. Sanayi süreçleri, jeoloji, biyoloji ve uygulamalar diğer alanlarda element mikroanalizi kullanımının daha da yaygınlaştırılması önemli kavramsal ve teknolojik atılımlar üretecektir.

Mevcut yazının amacı, geleneksel optik mikroskop ile tam uyumlu bir masaüstü enstrümantasyon ile biyolojik dokular kantitatif element haritalama (veya element mikroanalizi) için çözümler önermektir. Yaklaşımımız lazer kaynaklı arıza spektroskopisi (LIBS teknolojisi) dayanmaktadır. LIBS olarak, lazer darbeli malzemenin bozulmasını ve kıvılcım oluşturmak için ilgi numune üzerinde odaklanmıştır. Plazmada yayılan radyasyonu atom, daha sonra, bir spektrometre ile analiz edilir Elemental konsantrasyonları ^13,14 önceden yapılan kalibrasyon ölçümleri ile alınabilir. LIBS avantajları, kompakt, çok temel numune hazırlama, numune ile temas anında tepki olarak ve tam anlamıyla (mikro) yüzey analizi yokluğu (hemen hemen tüm unsurları için ug / g) duyarlılığı içerir. Doku lazer ablasyon ince birlikte mikrogram / ​​g aralığında ^15,16 duyarlılığı yüksek uzaysal çözünürlüğü ile haritaları gerçekleştirmek için kontrol edilmelidir Ancak, doku kimyasal görüntüleme uygulaması zorlu kalır.

Bu tür bir çözüm sayesinde, izleyici ya da etiketleme ajanlar adjunction biyolojik dokulardaki kendi doğal ortamında doğrudan inorganik elementler tespit sağlar ki, gerekli değildir. Laboratuvarımızda geliştirilen KIBS enstrüman sağlar 0.1 mm ^16, eşdeğer 35 ug / g altında Gd için tahmini bir hassasiyet ile 100 mikron aşağı bir akım çözünürlüğü sunuyorbüyük numunelerin eşleme (> 1 ^cm2), 30 dakika içinde. Buna ek olarak, ev yapımı yazılım veri alma ve sömürü kolaylaştırır. Bu alet gadolinyumun doku dağılımı, ilk tespit etmek ve ölçmek için kullanılır (Gd) bazlı nanopartiküller ^{17 -} küçük hayvanlardan böbrekler ve tümör örneklerinde ^18, 1 parçacıkların damar içine enjeksiyonundan sonra 24 saat için (boyut <5 nm) . Örneğin Fe, Ca, Na ve P gibi içsel bir biyolojik doku içerdiği inorganik elementler, aynı zamanda tespit edilebilir ve görüntülü edilmiştir.

Protokol

1.. Biyolojik Örnek Hazırlığı

Bu çalışmada açıklanan tüm deneyler CECCAPP (Lyon, Fransa) (yetki # LYONSUD_2012_004) Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanmış ve deneyler yetkili kişiler (L. Sancey, DDPP yetki içinde gözetiminde yapılmıştır 38 05 32).

1. Gadolinyum (Gd) bazlı nanopartiküllerin 100 umol, H ₂ O 1 ml 15 dakika bekleyin ve ₂ H O 100 ul ve 80 ul HEPES 50 mM 20 ul, 1.325 M NaCl, 20 mM _CaCI2 eklemek Gd-tabanlı nanopartiküller birincil çözeltisinin hazır-inject 40 mM (: Villeurbanne, laboratuarda City) de 200 ul çözüm elde etmek.
2. Intravenöz anestezi tümör taşıyan kemirgenlerde (: Lyon Sud (Oullins), laboratuarda 15 km Şehir) içine 200 ul Gd-tabanlı nanopartiküller çözüm enjekte.
3. 1-24 saat enjeksiyonundan sonra, fareler kurban birsıvı nitrojen ile soğutulan izopentanın içine biyolojik örnekleri koydu d. (: Laboratuarda Lyon Sud (Oullins), 15 km Şehir) 80 ° C - en örnekleri saklamak.
4. Örnek dilimleyin (Şehir: Genellikle Grenoble, laboratuardan 100 km; ben Lyon Sud bir erişim için çalışacağız) 100 mikron kalınlığında slaytlar ve özel plastik tabaklar (Petri) üzerinde biyolojik slaytlar koydu. -80 ° C'de saklayın
   Not: Plastik yemekleri temelde çok saf polimer örnek vardır. Bunlar doku içerdiği öğeleri karışmalarını önlemek için kullanılır.

Kalibrasyon için 2. Numune Hazırlama

1. Su (0 nM, 100 nM, 500 nM, 1 uM, 5 uM, 10 uM, 50 uM, 100 uM, 500 uM, 1 mM, ve 5 mM) Gd bazlı nanoparçacık artan dozları ile şişeler hazırlayın.
2. Düzenli olarak Petri tabağına 3 mm aralıklı, her bir solüsyon 5 ul-damla koyun.
3. 20 dakika boyunca oda sıcaklığında kurutulur.

3.. LIBS Deney

1. LIBS Kur başlatılıyor
   1. Lazer Ayarları. Araçların açıldıktan sonra, lazer darbe enerji stabilizasyon için 10-20 dakika bekleyin ve -20 ° C'ye ICCD kamera soğuma Zayıflatıcı ile darbe enerjisini ayarlayın.
      Not: haritalama dokular için uygun lazer parametreleri 5 NSEC darbe süresi, 1.064 nm dalga boyu ve yaklaşık 4 mJ darbe enerji vardır. YAG lazer nanosaniye: kullanan lazer tipik bir Nd.
   2. LIBS Ayarları. Daha küçük krater çapı elde etmek için (örnek yüzeyine göre) lazer odaklama konumunu ayarla (yaklaşık 50 um veya daha az.)
      Not: Bu bir lazer darbeli odaklılığıyla numune yüzeyinin altında 100 um karşılık gelir.
   3. Spektrometre Ayarları. Izgara, 1.200 satır / mm ve yüksek zamansal çözünürlük ICCD kamera ile kombine Czerny-Turner spektrometre kullanın. Bilgisayardaki tüm bu cihazları kontrol. 40 um giriş yarık değerini ayarlayın. Spektral aralığı yeniden ayarlayınanaliz edilecek elemanı mesi. Spektral yüksek hassasiyet ile tespit Gd 325-355 nm aralığı kapsayan, hem de Na, Cu ve Ca kullanın. 300 nsaniye bir gecikme, 2 mikro saniye bir kapısı ve 200 kazanç ile ICCD parametrelerini ayarlayın.
2. Haritalama Ölçme
   1. LIBS motorlu örneği üzerindeki biyolojik numunenin yerleştirin.
   2. Lazer odak konumuna göre numunenin yüksekliği ayarlayın.
   3. Örnek dilimin yüksek çözünürlüklü fotoğraf çekmek.
   4. Yaklaşık 100 mikron çözünürlükte aralıklı genellikle 100 x 100 ölçüm noktaları ile bir harita gerçekleştirmek için KIBS toplama yazılımı eşleme modülü ayarlayın.
   5. Satın alma başlayın. Bu noktadan itibaren her şey otomatik; sekansını hem de spektrum kayıt taşıma ve tasarruf sağlar. 40 dakika (100 um çözünürlüğü için 1 ^cm2 eşdeğer) 10.000 puan bir eşleme için gereklidir. Aynı dosyanın içine tüm kaydedilen spektrumları yeniden toplamak.
   6. Ne zaman finished, örnek dilimin ikinci bir fotoğraf çekmek
3. Kalibrasyon Ölçüm

Aynı deney parametreleri ile (hazırlık ayrıntılar için bakınız bölüm 2) Kalibrasyon örneklerini ölçmek. Kalibrasyon damla her birinde bir ilk ya da (damla merkez kısmında ölçüm bölgelerinde de elde edilmiş) 25 kayıt spektrumları yapın.

4 LIBS Spektrum Analizi:. Kimyasal Görüntüler İnşası

1. Tutanak tüm LIBS doku haritalama spektrumları ve KIBS yazılım analizi yükleyin. Her spektrum için temel çıkarma ve yanlış bir renk kullanarak bağıl şiddet ölçeği ile kimyasal görüntüler oluşturmak.
   Not: Bir algoritması, Gd, Cu, Na ya da Ca gibi belirli çizgi yoğunlukları, alır.
2. Kalibrasyon eğrileri hesaplama (yoğunluk ve konsantrasyon arasındaki ilişki) izin ve aq inşa kalibre örnekten ölçülen spektrumları üzerine aynı işlemiuantitative harita veya görüntü Gd için (veya diğer ilgi elemanı).
3. Böyle interpolasyon veya düzleştirme gibi kimyasal görüntüleri, yeterli tedavi uygulayın. Görüntü formatı (bitmap) olarak yoğunluğu veya konsantrasyon haritalar kaydedin.

Sonuçlar

Şekil 1, bir Nd ışın gösterildiği gibi: 1.064 nm temel dalga boyunda YAG lazer 50 mm odak uzaklığı bir kuvars lens ile doku dilim dikey aşağı duruldu. Darbe enerji 4 mJ ve tekrarlama oranı 10 Hz. Hava plazma oluşumunu önlemek için, lazer ışını, numune yüzeyinin altında 100 um civarında odaklanmıştır. Resim plazma hava bu durumda gözlenmiştir. Deneyler sırasında, numune, numunenin (tek atış) sadece tek bir konumda bir plazma oluşturmak için bir kademeli motor tarafından...

Tartışmalar

Biyolojik numune uygulandığında bu teknik, farklı organlarda enjekte Gd bazlı nano parçacıklardan Gd ve Si haritalama ve miktarının, örneğin, kimyasal görüntüleme sağlar. Ana kritik ayarlarından, lazer özellikleri (dalga boyu, darbe enerjisi, odaklama ve kararlılık) kontrol hassas ve ince doku ablasyonu (örneğin, eşleme çözünürlük) için hem de hassasiyeti için çok önemlidir. Yüksek enerji çalışmak daha iyi bir hassasiyet sağlar ama maalesef bozulmuş uzaysal çözün...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Laser nanosecond Nd:YAG	Quantel	Brillant	5 nsec pulse width, wavelength 1,064 nm
Spectrometer	Andor Technology	Shamrock 303	with 1,200 lines/mm blazed at 300 nm grating
Detector ICCD	Andor Technology	Istar	2 nsec temporal resolution
LIBS Unit	ILM		Homemade Instrumentation
Gd-based nanoparticles	Nano-H		particles
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034	for particle's dilution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21108	for particle's dilution
NaCl	Sigma-Aldrich	S5886	for particle's dilution
Mice	Charles River	depending of animal breeding
Isoflurane	Coveto / Virbac		for anaesthesia - Isofluranum
Isopentane	Sigma-Aldrich	59060	to froze the sample  slowly
Liquid nitrogen	Air Liquide		to cool down the isopentane
Cryostat	Leica	CM-3050S	to slide the samples
Petri dishes	Dutscher	353004	to stick the sample