יישום של חומצה הרטינואית לקבל תרבויות Osteocytes מOsteoblasts העכבר העיקרי

Summary

טיפול בosteoblasts עכבר העיקרי עם חומצה רטינואית מייצר אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes. השיטה מתגברת על הקושי בהשגה ושמירה על osteocytes העיקרי בתרבות, ויכולה להיות יתרון ללמוד תאים הנגזרים ממודלים מהונדסים.

Abstract

הצורך בתרבויות osteocyte ידוע לקהילת חוקרי עצם; בידוד של osteocytes העיקרי הוא קשה ומייצר מספרי תא נמוכים. לכן, המערכת הסלולרית הנפוצה ביותר היא שורת התאים כמו osteocyte-MLO-Y4.

השיטה שתוארה כאן מתייחסת לשימוש של חומצה רטינואית ליצירת אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים עם תכונות osteocyte מורפולוגיים ומולקולריים.

לאחר הבידוד של osteoblasts ממכסה גולגולת עכבר, חומצה רטינואית כל טרנס (ATRA) הוא הוסיף למדיום סלולרי, ותא ניטור מתבצע מדי יום תחת מיקרוסקופ הפוכה. שינויים מורפולוגיים הראשונים הם לגילוי לאחר 2 ימי טיפול והבידול הוא בדרך כלל מלא ב5 ימים, עם התפתחות הדרגתית של דנדריטים, אובדן היכולת לייצר מטריצה ​​תאית, למטה רגולציה של סמני תא עצם ועד הוויסות של מולקולות osteocyte ספציפי. תוכן "> יש צורך בניטור תא היומי בגלל ההשתנות הפנימית של תאים ראשוניים, והפרוטוקול יכול להיות מותאם עם וריאציה מינימאלית לתאים המתקבלים מזנים שונים עכבר וליישם מודלים מהונדסים.

השיטה היא קלה לביצוע ואינו דורשת מכשור מיוחד, היא לשעתקו מאוד, ומהירות יוצרת אוכלוסיית osteocyte בוגרת בהיעדר המטריצה ​​תאית מלא, המאפשרת שימוש בתאים אלה ליישומים ביולוגיים בלתי מוגבלים.

Introduction

Osteocytes, סוג תא עצם הנפוץ ביותר, הוא הבדיל סופני, תאים מסועפים מאוד עמוק הנמצאים בתוך השלד. גוף התא של osteocytes הבוגר כלולים בחסר עצם ויש צורות מגוונות; osteocytes עם גופי תא מוארכים נמצא בקליפת מוח העצם, ואילו osteocytes המעוגל הם תכופים יותר בעצמות הטרבקולות ^1. דנדריטים מסועפים להאריך מגוף התא ומתגוררים בערוצים זעירים המכונים נקבות, ויוצרים רשת סבוכה שגורמת לאנשי קשר מרובים לא רק עם osteocytes אחר, אלא גם עם סוגים אחרים של תאי עצם, מח עצם, כלי דם וpericytes הכרוך בכך. באמצעות נוזל ביניים הכלולים בקונות ונקבות, osteocytes גם סופו של דבר מחובר למערכת במחזור, ולכן הם יכולים להשפיע לא רק מקומיים, אלא גם אירועים מערכתיים, ולהיפך ההתנהגות שלהם יכולה להיות מוסדרת על ידי שני שינויים מערכתיים והמקומיים ^2.

מחקר של osteocytes לאחרונה צבר תאוצה, הודות לכמה חידושים טכנולוגיים, כגון הדור של רקמות ובעלי חיים מהונדסים תא ספציפי, השימוש בשיטות מיקרוסקופיה רבות עוצמה ושל הקרנה מולקולרית תפוקה גבוהה ^3,4. עם זאת, ידע של תאים אלה עדיין לא הושלם, בעיקר בשל מיעוט היחסי של דגמים מתאימים במבחנה. למעשה, osteocytes היה תמיד קשה להשיג ולשמור על בתרבות בגלל המיקום העמוק, והרמה הנמוכה של ריבוי המאפיין את סוג תא מובחן כזה.

לאורך השנים, במספר השיטות פותחו כדי לבודד osteocytes העיקרי ^5-7, למרות שהם בדרך כלל לייצר תשואות תא נמוכות ולשאת את הסיכון שאפילו כמה fibroblasts זיהום יהיה במהירות לגדול osteocytes ^8. מסיבה זו, רוב ניסיוני בעבודה חוץ גופית כבר נערך עד כה על ליטר תא osteocyte המבוסס היטבine MLO-Y4 ^9.

במבחנה מתודולוגיות נוספות יכולה לשפר את האפשרות ללמוד את התאים האלה ויכולות לשפר את הניתוח של הביולוגיה osteocyte והפתופיזיולוגיה. להיות במידה רבה אימצו, שיטות כאלה צריכה להיות קלים לשחזר, ולא דורשות מכשור מיוחד או פעמים רבות מאוד כדי להגיע להבשלת תא. חשוב לציין, אם רלוונטי לתאים ראשוניים, הם היו מאפשרים לנצל בעלי חיים מהונדסים. לאחרונה תוארו כי טיפול של הקו הסלולרי osteoblast MC3T3-E1 ושל osteoblasts העיקרי עם חומצה הרטינואית גורם לשינוי פנוטיפ מהיר שמוביל להתפתחות של אוכלוסייה הומוגנית של תאים מסועפים הנושאים תכונות מורפולוגיות ומולקולרית של osteocytes ^10.

כל טרנס החומצה רטינואית (ATRA) היא מוצר מטבולים פעיל של ויטמין A המסדיר שעתוק הגנים על ידי קשירה לקולטנים החומצה הרטינואית הגרעיניים (Rars). Rarsנקשרים ל-DNA כheterodimers עם קולטנים X retinoid (RXRs), סופו של דבר מוביל לאפנון של חומצה רטינואית (RA) מגיב לגני המטרה ^11. ATRA הוכח לווסת את התמיינות והתבגרות של כמה סוגי תאים, ובהם תאים מסועפים אחרים, כגון תאים עצביים ¹² וpodocytes ^13.

השיטה שתוארה כאן מתבססת על תוספת של ATRA לosteoblasts העיקרי. כדי להיות יעיל, ATRA יש להוסיף בשלב הבשלה מדויק על תאים מצופים בצפיפות מוגדרת; בניסיון שלנו בתנאים אלה הם קריטיים כדי להשיג את מתג פנוטיפ מosteoblasts לosteocytes.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם ללאומי ותקנות הנוכחיות באירופה בנוגע להגנה על בעלי החיים המשמשים למטרות מדעיות ונבדקו ואושרו על ידי ועדת האתיקה של אוניברסיטת מילאנו.

1. בידוד של Osteoblasts הראשי

השיטה, עם שינוי קל, כדלקמן ההליך שתואר על ידי Dodig et ¹⁴ אל.

1. הכן לעכל בינוני, על ידי הוספת 0.1% Collagenase P ו0.05% טריפסין (החל מ2.5% טריפסין 10X, לא פנול אדום) עד בינוני HBSS (תמיסת מלח מאוזנת הנקס, לא סידן, מגנזיום, או פנול אדום).
2. השתמש ישנים עכברי 3-4 יום (ההליך יכול להיות מיושם על כמה כמו עכבר 1).
3. להקריב על ידי עריפת ראש. לרסס את הראש עם 70% אתנול ולשמור על קרח. הסרת שכבות עור ושריר על ידי פינצטה ומספריים כירורגיות לנתח /.
4. להסיר בעדינות את העצמות הקודקודית ולהפריד ביניהם על ידי ביצוע תפר sagittal בשני חצאים. הפוך עצמות בטוחים הן ללא תפרים וכל רקמה חסיד ומניח את חתיכות עצם בודדות בגם צלחות המכילות בינוני HBSS עד ההליך הושלם.
5. בטל HBSS ולהוסיף לכל אחד גם בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C.
6. בטל supernatant.
7. להוסיף שוב בינוני לעכל במשך 15 דקות ב37 ° C.
8. הפעם להציל את supernatant ולמקם אותו באלפא-ממ (בינוני Essential Minimum) בתוספת 10% FBS (בסרום שור עוברי) ו -1% סטרפטומיצין / פניצילין.
9. חזור על שלבים 1.7 ו1.8 2x.
10. בריכת שלושה שברים שנאספו, תאי ספין על ידי צנטריפוגה ב425 גרם במשך 5 דקות, לבטל את supernatant, להוסיף 3 מיליליטר של אלפא-ממ בתוספת לresuspend התא גלולה, ולהעביר לבקבוק ² 25 סנטימטר.
11. שינוי הבינוני לאחר 24 שעות כדי להסיר שאריות ותאים מתים.
12. הוסף 50 חומצת מיקרוגרם / מיליליטר אסקורבית (AA) ו3 מ"מ גלאימימה cerol 2 פוספט מלח disodium (GP) למדיום אלפא-ממ.
13. לאחר מכן, לשנות את המדיום (אלפא-ממ AA פלוס / GP) בכל יום אחר.

2. ATRA פרוטוקול

1. לנהל את כל הניסויים עם ATRA (All-Trans חומצה הרטינואית) בחדר חשוך כדי למנוע איון.
2. הכן פתרון טריפסין 1X במדיום HBSS ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. הוצא את המדיה מתאי subconfluent ובזהירות לשטוף אותם עם HBSS.
4. הוספת טריפסין 1 מיליליטר, בעדינות לסובב את הבקבוק כדי לאפשר לכל התאים להיות מכוסים על ידי טריפסין, ודגירה במשך 3 דקות על 37 ° C.
5. הגעה לניתוק בפועל של תאים תחת מיקרוסקופ הפוכה.
6. הוסף 3 מיליליטר של מדיום אלפא-ממ כדי להשבית טריפסין.
7. לשחזר את התאים ו צנטריפוגות במשך 15 דקות ב425 גרם.
8. Resuspend התא גלולה במדיום חדש.
9. מניחים ירידה בחדר ספירת hemocytometer, לאפשר להתיישב לכמה דקות ולספור את הספירהמספר ll.
10. תאי מקום ב25 סנטימטר ² צלוחיות בצפיפות של 10,000 תאים / ² סנטימטר עם אלפא-ממ AA פלוס / GP. להיות מודע לכך צפיפות תאים היא רלוונטית להתפתחות האופטימלית של תהליכים בתא ואנשי קשר אינטר. צפיפות התחלה גבוהה יותר מאשר 10,000 תאים / ² סנטימטר פוגע בהתפתחות תקינה של תהליכים בתא, אבל מספרים סלולריים נמוכים יותר לגרום למוות של תאים מוקדמים, בשל העדרו של קשר אינטר.
11. הוסף 5 מיקרומטר ATRA למדיום כל שעה 24.
12. לפקח על התאים מדי יום כדי להעריך את המורפולוגיה: שינויים מורפולוגיים הם נצפו בדרך כלל לאחר 48 שעות. אם לאחר שעה 24-48 הראשונה, תאים עדיין מתרבים, replate בצפיפות לעיל. אוכלוסייה הומוגנית של osteocytes הבוגר נמצאת אחרי 4-5 ימים. בהתאם לצרכים, להשתמש בתאים בכל נקודת זמן, עד 12-15 ימים.
13. כאשר תאים מצופה על תומך אחר (כגון coverslips או גם צלחות), כדי להיות בטוח כי הצפיפות מעל מתוחזק וממשיך להוסיף ATRA כל שעה 24 עד לשימוש. לצאת מתאים לדבוק בתמיכה החדשה עבור לפחות 24 שעות לפני הניסוי.

3. Immunostaining

1. עבור immunostaining, צלחת התאים על coverslips ובצע מתודולוגיות הוקמו (ראה למשל ¹⁵ בארי).
2. לדוגמא, עבור immunofluorescence העקיף, לתקן paraformaldehyde 4% או אצטון הקר, דגירה ברצף עם הנוגדן הראשוני ב RT עבור שעה 1 בתא humidified, ולאחר מכן עם הנוגדנים שכותרתו המשניים ניאון בחושך, על RT במשך 30 דקות, בתא humidified.
3. השתמש DAPI או אנלוגים לcounterstaining גרעיני, ולעגן באנטי הדהיה בינונית.

4. אליזרין אדום מכתים והפקה

1. פלייט התאים על coverslips.
2. תקן את התאים על ידי טבילת coverslip ב70% אתנול ל10 דקות.
3. לכסות את התאים עם כמה טיפות של פתרון מכתים אדום אליזרין (1 מ"ג / מיליליטר, pH 5.5)ל30 דקות.
4. שטוף את coverslips עם מי ברז. הר עם ירידה של גליצרול על שקופיות זכוכית ולקחת את התמונות באמצעות מיקרוסקופ זקוף ב10X והגדלה 20X.
5. לאחר ההליך הנ"ל, לשחזר את coverslips ידי טבילת השקופיות במים ברז.
6. שים את כל coverslip בצלחת היטב.
7. הוסף 60% חומצת perchloric (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את התאים לחלוטין) ולעזוב O / N ב 4 ° C עם תסיסה עדינה.
8. קראו את הצפיפות האופטית של supernatant ידי spectrophotometry ב450 אורך גל.
9. לנרמל את הערכים עבור מספר תאים, להוסיף יאנוס גרין (פתרון 0.2% ב-PBS) כדי לכסות את הכנת התא ל10 דקות.
10. לשטוף בזהירות עם מים ultrapure.
11. הוסף 0.5 N HCl (הכמות צריכה להיות מספיק כדי לכסות את כל התאים) ולנער בעדינות ביד במשך כמה שניות.
12. קראו את הספיגה ב 615 ננומטר על ידי ספקטרופוטומטר.

תוצאות

תוצאות התקבלו 5-10 ניסויים בלתי תלויים.

מורפולוגיה של תאים

AA / GP טופל יש תאים ראשוניים תכונות בעיקר כמו מרוצפות, אופייני לosteoblasts הבוגר. ניתן למצוא תאים מסועפים ביניהם (כפי שצוין על ידי חצים אדומים

Discussion

בשנים האחרונות osteocyte התפתחה כתא המרכזי ביותר בעצמות. התקדמות במחקר בהדרגה מגלה מספר מאפייני osteocyte בלתי צפויים או בלתי מוכחים בעבר, שהם בעלי ערך עצום לעיצוב חדשני וטיפול טוב יותר עבור מגוון רחב של מחלות עצם. עם זאת, חקירה של הביולוגיה osteocyte כבר סובלת מהזמינות המוגבלת של...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius