Применение ретиноевой кислотой получить остеоцитов культур из первичных мыши остеобластов

Резюме

Лечение первичных остеобластов мыши с ретиноевой кислоты производит гомогенную популяцию разветвленных клеток, несущих морфологические и молекулярные особенности остеоцитов. Способ преодолевает трудность получения и сохранения первичных остеоцитов в культуре, и может быть выгодным для изучения клетки, полученные из трансгенных моделей.

Аннотация

Необходимость остеоцитарного культур хорошо известно в сообщество исследователей кости; изоляция первичной остеоцитов трудно и производит небольшое число клеток. Таким образом, наиболее широко используется система сотовой связи является остеоцит, как MLO-Y4 клеточной линии.

Способ здесь описано относится к использованию ретиноевой кислотой с образованием гомогенной популяции клеток с разветвленными морфологических и молекулярных особенностей остеоцитарного.

После выделения остеобластов из свода черепа мыши, полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) добавляют к клеточной среде, а также мониторинг соты выполняется ежедневно под инвертированным микроскопом. Первые морфологические изменения обнаруживаются после 2 дней лечения и дифференциации обычно завершается в течение 5 дней, с прогрессивного развития дендритов, потеря способности производить внеклеточный матрикс, понижающей регуляции остеобластов маркеров и до регулирования остеоцитарного конкретных молекул. Содержание "> Мониторинг Ежедневно клеток необходим из-за присущего изменчивости первичных клеток, и протокол может быть адаптирован с минимальным изменением в клетках, полученных из различных линий мышей и применяемых к трансгенных моделей.

Метод прост для выполнения и не требует специального оборудования, это очень воспроизводимые, и быстро генерирует зрелого населения остеоцитарного в полном отсутствии внеклеточного матрикса, что позволяет использовать эти клетки для неограниченного биологических применений.

Введение

Остеоциты, наиболее распространенный тип костных клеток, неизлечимо дифференцированной, очень разветвленные клетки глубоко расположенные в скелете. Тело клетки зрелой остеоцитов содержатся в костном лакун и имеют различные формы; остеоцитов с удлиненных тел клеток находятся в кортикальной кости, в то время как закругленные остеоцитов становятся все более частыми в губчатой ​​кости ^1. Разветвленные дендриты простираются от тела клетки и проживать в крошечных каналов называемых канальцы, образуя запутанную сеть, которая делает несколько контактов не только с другими остеоцитов, но и с другими типами костных клеток, костного мозга, кровеносных сосудов и связанных с ними перицитами. Через межклеточной жидкости, содержащейся в лакун и канальцев, остеоциты также в конечном счете, подключен к системе циркуляции, поэтому они могут влиять не только местные, но и системные события, и наоборот их поведение может регулироваться как местных, так и системных изменений ^2.

Изучение остеоцитов недавно набрала обороты, благодаря несколько технических достижений, таких как генерации ткани и клеточных конкретных трансгенных животных, использование мощных методов микроскопии и высокой пропускной молекулярной скрининга ^3,4. Тем не менее, знание этих клеток еще не завершен, в основном за счет относительного дефицита адекватной в пробирке моделей. На самом деле, остеоциты были всегда трудно получить и поддерживать в культуре из-за глубокого расположения, и низкий уровень пролиферации, которая характеризует такой дифференцированный тип клеток.

Вдоль лет, ряд методов были разработаны, чтобы изолировать первичный остеоцитов ^5-7, хотя они обычно производят урожаи низкие клеток и несут риск, что даже несколько загрязняющих фибробласты быстро перерастают остеоцитов ^8. По этой причине, самый экспериментальный в пробирке работы было проведено до сих пор на устоявшихся остеоцитов клеток лНИС MLO-Y4 ^9.

Дополнительные методологии в пробирке может повысить возможность изучения этих клеток и может улучшить анализ остеоцитарного биологии и патофизиологии. Чтобы быть в значительной степени приняты, такие методы должны быть легко воспроизвести, и не потребует специальных инструментов или очень длинные раза до клеток созревание. Важно отметить, что если применимо к первичных клеток, они дают возможность использовать преимущества трансгенных животных. Мы недавно описали, что обработка остеобластов линии клеток MC3T3-E1 и первичных остеобластов с ретиноевой кислоты вызывает быстрое изменение фенотипа, ведущий к развитию гомогенной популяции клеток, несущих разветвленных морфологические и молекулярные особенности остеоцитами ^10.

Полностью транс-ретиноевой кислоты (ATRA) является активным продуктом метаболической трансформации витамина А, который регулирует транскрипцию генов путем связывания ядерных рецепторов ретиноевой кислоты (РАКС). RARsсвязываются с ДНК, как гетеродимеров с ретиноидных X рецепторов (RXRs), в конечном итоге приводит к модуляции ретиноевой кислоты (RA)-отзывчивым генов-мишеней ^11. ATRA, как было показано модулировать дифференцировку и созревание нескольких типов клеток, в том числе другие разветвленные клетки, такие как нервные клетки ¹² и подоцитах ^13.

Способ здесь описано основана на добавлении к ATRA первичных остеобластов. Чтобы быть эффективной, ATRA должен быть добавлен в точном стадии созревания на клетки высевали при определенной плотности; в нашем опыте эти условия имеют решающее значение для получения переключатель фенотип от остеобластов к остеоцитов.

протокол

Все эксперименты на животных были проведены в соответствии с национальным и европейским действующих норм, касающихся защиты животных, используемых для научных целей и были рассмотрены и одобрены комитетом по этике Миланского университета.

1. Выделение первичных остеобластов

Метод, с небольшим изменением, в соответствии с процедурой, описанной Додиг и др. ^14.

1. Подготовка переваривание среды, путем добавления 0,1% коллагеназы P и 0,05% Трипсин (начиная с 2,5% трипсина 10X, не фенолового красного) в HBSS среды (Hanks Balanced Salt Solution, не кальций, магний, или фенола красного).
2. Использование 3-4 день старых мышей (процедура может быть применена к всего лишь 1 мыши).
3. Жертвоприношение путем обезглавливания. Спрей голову с 70% этанола и держать на льду. Удалить кожу и мышечные слои пинцетом и рассекая / хирургическими ножницами.
4. Аккуратно удалите теменной кости иотделить их, следуя стреловидного шва в двух половинок. Убедитесь, что кости были свободны от швов и любой приверженец ткани и поместите отдельные части кости в хорошо планшеты, содержащие HBSS среду пока процедура не будет завершена.
5. Отменить HBSS и добавить в каждую лунку переваривания среда в течение 15 мин при 37 ° С
6. Удалите супернатант.
7. Добавить вновь переваривая среды в течение 15 мин при 37 ° С.
8. На этот раз сохранить супернатант и поместить его в альфа-MEM (минимальной основной среде), дополненной 10% FBS (фетальная бычья сыворотка) и 1% стрептомицина / пенициллину.
9. Повторите шаги 1,7 и 1,8 2x.
10. Бассейн три собранных фракций, вращение клетки центрифугированием при 425 г в течение 5 мин, отбросить супернатант, добавляют 3 мл дополнен альфа-МЕМ с ресуспендируют осадок клеток, и перевод в 25 см ² колбы.
11. Измените среду после 24 часов для удаления мусора и мертвых клеток.
12. Добавить 50 мкг / мл аскорбиновой кислоты (AA) и 3 мм Glycerol 2-фосфат динатриевой соли гидрат (GP) в среде альфа-МЕМ.
13. После этого изменения среды (альфа-MEM плюс AA / GP) через день.

2. ATRA протокол

1. Провести все эксперименты с ATRA (All-транс-ретиноевой кислоты) в затемненной комнате, чтобы предотвратить инактивации.
2. Подготовка раствора трипсина 1X в HBSS среды и держать при 37 ° С до использования.
3. Снимите среды из субконфлюентных клеток и тщательно промойте их HBSS.
4. Добавить 1 мл трипсина, осторожно вращать колбу, чтобы все клетки должны быть охвачены трипсина и инкубировали в течение 3 мин при 37 ° С.
5. Проверьте фактического отряда клеток под инвертированным микроскопом.
6. Добавьте 3 мл альфа-MEM среде для инактивации трипсина.
7. Восстановление клеток и центрифугируют в течение 15 мин при 425 г.
8. Ресуспендируют осадок клеток в свежей среде.
9. Наведите падение счетной гемоцитометр камеры, дают отстояться в течение нескольких минут и подсчитать сеLL число.
10. Место клеток в 25 см ² колбы при плотности 10000 клеток / см ² с альфа-MEM плюс AA / GP. Знайте, что плотность клеток имеет отношение к оптимального развития клеточных процессов и межклеточных контактов. Отправной плотность выше, чем 10000 клеток / см ² ухудшает надлежащее развитие клеточных процессов, но более низкие количества клеток приводит к преждевременной гибели клеток, в связи с отсутствием межклеточных контактов.
11. Добавить 5 мкм ATRA в среду каждые 24 часа.
12. Монитор клетки ежедневно оценивать морфологию: морфологические изменения, как правило, наблюдается после 48 часов. Если после первых 24-48 часов, клетки все еще пролиферирующих, replate по указанному выше плотности. Однородная население зрелого остеоцитов присутствует через 4-5 дней. В зависимости от потребностей, использовать клетки в любой момент времени, до 12-15 дней.
13. Когда клетки высевают на других опорах (например, покровные или хорошо пластин), убедитесь, что выше плотность поддерживается иПродолжайте добавлять ATRA каждые 24 ч до использования. Оставьте клетки прилипать к новой поддержкой по меньшей мере 24 ч до начала эксперимента.

3. Иммуноокрашивание

1. Для иммуноокрашивания, пластины клеток на покровных и следовать установленным методологии (см., например, Барри ^15).
2. Например, для непрямой иммунофлуоресценции, фиксируют в 4% параформальдегида или холодным ацетоном, последовательно инкубируют с первичным антителом при комнатной температуре в течение 1 часа в увлажненной камере, а затем с вторичной флуоресцентной-меченого антитела в темноте, при комнатной температуре в течение 30 мин, в увлажненной камере.
3. Используйте DAPI или аналогов для ядерной контрастного, и смонтировать в борьбе с выцветания среднего.

4. Ализарин Красный Окрашивание и Добыча

1. Пластина клеток на покровные.
2. Фиксации клеток путем погружения покровное в 70% этаноле в течение 10 мин.
3. Обложка клеток с несколькими каплями ализарином решения красный окрашивания (1 мг / мл, рН 5,5)в течение 30 мин.
4. Вымойте покровные с водопроводной водой. Установите с каплей глицерина на стеклах и получать изображения с использованием прямой микроскоп в 10 раз и 20-кратным увеличением.
5. После описанной выше процедуры, восстановление покровные погружением слайдов в водопроводной воде.
6. Поместите каждый покровное в луночного планшета.
7. Добавить 60% хлорной кислоты (количество должно быть достаточно, чтобы полностью покрыть клетки) и оставить O / N при 4 ° С при осторожном перемешивании.
8. Считать оптическую плотность надосадочной жидкости спектрофотометрически при длине волны 450 нм.
9. Для нормализации значений числа клеток, добавьте Janus Green (0,2% раствор в PBS), чтобы покрыть клеточный препарат в течение 10 мин.
10. Вымойте тщательно сверхчистой водой.
11. Добавить 0,5 HCl (количество должно быть достаточно, чтобы покрыть все клетки) и слегка встряхнуть рукой в ​​течение нескольких секунд.
12. Считайте абсорбцию при 615 нм с помощью спектрофотометрии.

Результаты

Результаты были получены от 5 до 10 независимых экспериментов.

Морфология клеток

А.А. / GP обработаны первичные клетки имеют в основном булыжником, как черты, характерные для зрелых остеобластов. Перемежаются разветвленные клетки (как указано красными стрелка?...

Обсуждение

В последние годы остеоцитов стала самой центральной ячейки в кости. Научно-исследовательские достижения постепенно выявить ряд ранее непредвиденных или недоказанных свойств остеоцитарного, которые имеют огромное значение для проектирования новых и лучшее лечение для различных кос?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius