A aplicação de ácido retinóico para obter culturas de osteócitos principal do mouse osteoblastos

Resumo

Tratamento de osteoblastos primários de rato com ácido retinóico produz uma população homogênea de células ramificadas que carregam características morfológicas e moleculares de osteócitos. O método supera a dificuldade de obtenção e manutenção de osteócitos primárias em cultura, e pode ser vantajosa para o estudo de células derivadas de modelos transgénicos.

Resumo

A necessidade de culturas osteócitos é bem conhecido para a comunidade de pesquisadores de osso; isolamento de osteócitos primário é difícil e produz números de celular de baixa. Portanto, o sistema celular mais extensamente utilizado é a linha de células MLO-Y4-osteócito semelhantes.

O método aqui descrito refere-se à utilização de ácido retinóico para gerar uma população de células homogéneas ramificadas com características morfológicas e osteócitos moleculares.

Após o isolamento de osteoblastos de calvárias de ratinho, o ácido all-trans retinóico (ATRA) é adicionado ao meio celular, e monitorização celular é conduzida por dia, sob um microscópio invertido. Primeiros alterações morfológicas são detectáveis ​​após 2 dias de tratamento e diferenciação está geralmente completa em 5 dias, com o desenvolvimento progressivo de dendrites, a perda da capacidade para produzir matriz extracelular, a infra-regulação de marcadores de osteoblastos e a sobre-regulação de moléculas específicas de osteócitos. conteúdo "> monitoramento de células diária é necessária devido à variabilidade inerente de pilhas, eo protocolo pode ser adaptado com variação mínima de células obtidas a partir de diferentes linhagens de camundongos e aplicadas a modelos transgênicos.

O método é fácil de realizar e não requerem instrumentação especial, que é altamente reprodutível, e rapidamente gera uma população osteócito madura em completa ausência de matriz extracelular, que permite a utilização destas células para aplicações biológicas ilimitadas.

Introdução

Osteócitos, o tipo de célula mais abundante do osso, são terminalmente diferenciados, células altamente ramificados profundamente situadas dentro do esqueleto. O corpo celular de osteócitos maduros estão contidas em lacunas de osso e têm diversas formas; osteócitos com corpos celulares alongados são encontrados no osso cortical, enquanto osteocytes arredondadas são mais freqüentes no osso trabecular ^1. Dendritos ramificados estender a partir do corpo celular e residem em pequenos canais chamados canalículos, formando uma intrincada rede que faz com que vários contatos não só com outros osteócitos, mas também com outros tipos de células do osso, medula óssea, vasos sanguíneos e pericitos associados. Através do fluido intersticial contido nas lacunas e canalículos, osteócitos estão também em última análise, ligado ao sistema de circulação, pelo que pode influenciar não só local, mas também efeitos sistémicos, e vice-versa, o seu comportamento pode ser regulada por ambas as alterações locais e sistémicas ^2.

Oestudo de osteócitos recentemente ganhou impulso, graças a uma série de avanços técnicos, tais como a geração de-tecidos e animais transgénicos específicos de células, a utilização de técnicas de microscopia potentes e de rastreio molecular de alto rendimento ^3,4. No entanto, o conhecimento destas células ainda é incompleta, principalmente devido à escassez relativa de adequada em modelos in vitro. Na verdade, osteócitos sempre foram difíceis de obter e manter na cultura devido à localização profunda, e ao baixo nível de proliferação que caracteriza esse tipo de célula diferenciada.

Ao longo dos anos, um número de métodos tem sido desenvolvida para isolar osteócitos primário ^5-7, embora eles geralmente produzem rendimentos celulares baixas e comporta o risco de que mesmo poucos fibroblastos contaminantes irá cobrir rapidamente osteócitos ^8. Por esta razão, a maior parte do trabalho experimental in vitro tem sido realizada até agora para a célula osteócito bem estabelecida line MLO-Y4 ^9.

Metodologias in vitro adicionais podem aumentar a possibilidade de estudar essas células e pode melhorar a análise da biologia osteócito e fisiopatologia. Para ser amplamente adotada, tais métodos devem ser fáceis de reproduzir, e não exigiria instrumentos especiais ou tempos muito longos para alcançar a maturação celular. Mais importante, se for o caso de células primárias, elas tornam possível tirar proveito de animais transgénicos. Descrevemos recentemente que o tratamento de células da linha osteoblástica MC3T3-E1 e em osteoblastos primários com ácido retinóico induz uma mudança de fenótipo rápida que leva ao desenvolvimento de uma população de células homogéneas ramificadas rolamento características morfológicas e moleculares de osteócitos ^10.

All-trans ácido retinóico (ATRA) é um produto metabólico ativa da vitamina A, que regula a transcrição de genes pelos receptores de ácido retinóico nucleares (RAR) vinculativo. RARse ligam ao DNA, como heterodímeros com os receptores de retinóide X (RXRs), em última análise conduzindo à modulação de ácido retinóico (RA)-responsivo genes alvo ^11. ATRA foi mostrado para modular a diferenciação e maturação de vários tipos de células, entre as quais as outras células ramificadas, tais como as células neuronais e podócitos ^{12 13.}

O método aqui descrito baseia-se na adição de ATRA para osteoblastos primários. Para ser eficaz, a ATRA tem de ser adicionado a uma fase de maturação precisas sobre células plaqueadas a uma densidade definida; em nossa experiência essas condições são fundamentais para obter a chave de fenótipo de osteoblastos para osteócitos.

Protocolo

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com a regulamentação em vigor da Europa em matéria de protecção dos animais utilizados para fins científicos e foram analisados ​​e aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Milão e Nacional.

1. Isolamento de osteoblastos primários

O método, com modificações menores, segue o procedimento descrito por Dodig et al ^14.

1. Prepare digerindo médio, por adição de 0,1% de colagenase P e 0,05% de tripsina (a partir de 2,5% de tripsina 10x, sem vermelho de fenol) com meio HBSS (Solução Salina Equilibrada de Hanks, sem cálcio, magnésio, ou vermelho de fenol).
2. Use 3-4 dias os ratos velhos (o processo pode ser aplicado para tão poucos como um ratinho).
3. Sacrifício por decapitação. Pulveriza-se a cabeça com etanol a 70% e manter em gelo. Remover as camadas da pele e dos músculos por pinças e dissecação / tesoura cirúrgica.
4. Remova cuidadosamente os ossos parietais esepará-las após a sutura sagital, em duas metades. Certifique-se que os ossos são livres de suturas e qualquer tecido aderente e coloque pedaços de ossos individuais em bem-placas contendo meio HBSS até que o processo seja concluído.
5. Descartar HBSS e adicionar a cada poço meio de digerir durante 15 minutos a 37 ° C.
6. Desprezar o sobrenadante.
7. Adicionar mais uma vez o meio para digerir durante 15 minutos a 37 ° C.
8. Este tempo de guardar o sobrenadante e colocá-lo em alfa-MEM (Meio Essencial Mínimo) suplementado com 10% de FBS (Soro Fetal Bovino) e 1% de estreptomicina / penicilina.
9. Repita os passos 1.7 e 1.8 2x.
10. Reúnem-se os três fracções recolhidas, as células de rotação por centrifugação a 425 g durante 5 minutos, descarta-se o sobrenadante, adicionar 3 ml de alfa-MEM suplementado para ressuspender o sedimento de células, e transferir para um frasco de 25 cm ^2.
11. Mude o meio após 24 horas para remover detritos e células mortas.
12. Adicionar 50 ug / ml de ácido ascórbico (AA) e 3 mM de gliCerol 2-fosfato de hidrato de sal de dissódio (GP) para o meio alfa-MEM.
13. Depois disso, mudar o meio (alfa-MEM mais AA / PG) a cada dois dias.

2. Protocolo ATRA

1. Realizar todos os experimentos com ATRA (ácido trans-retinóico), em uma sala escura para evitar a inativação.
2. Prepara-se uma solução de tripsina 1X em meio HBSS e manter a 37 ° C até à sua utilização.
3. Remova o meio de células confluentes e cuidadosamente lave-os com HBSS.
4. Adicionar 1 ml de tripsina, rodar suavemente o frasco para permitir que todas as células a serem cobertas pela tripsina e incubar durante 3 min a 37 ° C.
5. Verifique se o desprendimento real de células sob um microscópio invertido.
6. Adicionar 3 ml de meio alfa-MEM para inactivar a tripsina.
7. Recuperar as células e centrifugar durante 15 min a 425 g.
8. Ressuspender o sedimento de células em meio fresco.
9. Coloque uma gota de uma câmara de contagem do hemocitômetro, deixar repousar por alguns minutos e contar o cenúmero ll.
10. Colocar as células em frascos de 25 centímetros ² a uma densidade de 10.000 células / cm ² com alfa-MEM mais AA / GP. Esteja ciente de que a densidade celular é relevante para o melhor desenvolvimento de processos celulares e contatos intercelulares. Uma densidade de partida maior do que 10.000 células / cm ² prejudica o bom desenvolvimento de processos celulares, mas os números de células mais baixos resultam em morte celular prematura, devido à ausência de contactos intercelulares.
11. Adicionar 5 mM ATRA ao meio cada 24 horas.
12. Monitorar as células diariamente para avaliar a morfologia: alterações morfológicas são geralmente observadas após 48 horas. Se, após a primeira 24-48 horas, as células estão ainda em proliferação, replate na densidade acima. Uma população homogénea de osteócitos madura está presente após 4-5 dias. Dependendo das necessidades, utilizar as células, em qualquer ponto de tempo, até 12-15 dias.
13. Quando as células são colocadas em outros suportes (como lamelas ou bem-placas), certifique-se que a densidade acima é mantido econtinuar a adicionar ATRA cada 24 horas até à sua utilização. Deixar as células a aderir ao novo suporte para, pelo menos, 24 horas antes da experiência.

3. Imunocoloração

1. Para imunocoloração, placa das células sobre lamínulas e seguir metodologias estabelecidas (ver, por exemplo Burry ^15).
2. Por exemplo, por imunofluorescência indirecta, fixar em 4% de paraformaldeído ou acetona fria, sequencialmente incubar com o anticorpo primário, à TA, durante 1 hora numa câmara húmida, em seguida, com o anticorpo secundário marcado com fluorescência, no escuro, à TA, durante 30 min, numa câmara húmida.
3. Use DAPI ou análogos para contracoloração nuclear, e montar em meio anti-desbotamento.

4. Alizarin coloração vermelha e Extração

1. Placa as células em lamelas.
2. Fixar as células imergindo as lamelas com etanol a 70% durante 10 min.
3. Cobrir as células com algumas gotas de solução de coloração de vermelho de alizarina (1 mg / ml, pH 5,5)durante 30 min.
4. Lave as lamelas com água da torneira. Monte com uma gota de glicerol em lâminas de vidro e tirar fotos usando um microscópio vertical em 10x e 20x de ampliação.
5. Após o procedimento acima, recuperar as lamelas por imersão das lâminas em água da torneira.
6. Coloque cada lamela em um prato bem.
7. Adicionar 60% de ácido perclórico (a quantidade deve ser suficiente para cobrir completamente as células) e deixar de O / N a 4 ° C com agitação suave.
8. Leia a densidade óptica do sobrenadante por espectrofotometria a 450 nm de comprimento de onda.
9. Para normalizar os valores para o número de células, adicionar Janus verde (solução a 0,2% em PBS) para cobrir a preparação de células durante 10 min.
10. Lave cuidadosamente com água ultrapura.
11. Adicionar 0,5 N HCl (a quantidade deve ser suficiente para cobrir todas as células) e agitar suavemente com a mão por alguns segundos.
12. Leia a absorvância a 615 nm por espectrofotometria.

Resultados

Os resultados foram obtidos 5-10 experiências independentes.

Morfologia celular

AA / GP tratado pilhas têm características principalmente de paralelepípedos-like, característica dos osteoblastos maduros. Células ramificadas intercaladas (conforme indicado pelas setas vermelhas na Figura 1A) pode ser encontrado, o que provavelmente representa cerca de osteócitos.

Com o tratamento com ATRA, as células começam rapidam...

Discussão

Nos últimos anos, o osteócito emergiu como a célula mais central do osso. Avanços da pesquisa são progressivamente revelando um número de propriedades osteócitos anteriormente insuspeitas ou não comprovadas, que são de enorme valor para a concepção de novos e melhores tratamentos para uma variedade de doenças ósseas. No entanto, a investigação de biologia osteócito tem vindo a sofrer de disponibilidade limitada de modelos in vitro de tal forma que os osteoblastos têm sido utilizados como substi...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius