初代マウス骨芽細胞から骨細胞培養物を入手するレチノイン酸のアプリケーション

要約

レチノイン酸によるマウスの主骨芽細胞の治療は、骨細胞の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団を生成します。この方法は、培養中の一次骨細胞を取得し、維持することの難しさを克服し、トランスジェニックモデル由来の細胞を研究することが有利である。

要約

骨細胞培養の必要性は、骨の研究者のコミュニティによく知られている。一次骨細胞の単離は困難であり、低細胞数を生成する。したがって、最も広く使用される細胞系は、骨細胞様MLO-Y4細胞株である。

ここで説明する方法は、形態学的および分子骨細胞の機能と分岐した細胞の均質な集団を生成するために、レチノイン酸の使用を意味する。

マウス頭蓋冠骨芽細胞からの単離後、全トランスレチノイン酸（ATRA）を細胞培地に添加され、セル監視を倒立顕微鏡下で毎日行われる。最初の形態学的変化は、治療の2日後に検出可能であり、差別化は、一般的に骨芽細胞マーカーのレギュレーションダウンとアップレギュレーション骨細胞特異的分子の細胞外マトリックスを産生する能力が失われ、樹状突起の漸進的発展に伴い、5日間で完了する。 コンテンツ ">毎日のセル監視が原因初代細胞の固有の変動性に必要とされており、プロトコルは、異なるマウス系統から得た細胞への最小限の変化に適応し、トランスジェニックモデルに適用することができる。

この方法は、実行が容易であり、特別な器具類を必要とせず、それは非常に再現性があり、かつ急速に無制限の生物学的用途のためのこれらの細胞の使用を可能にする、細胞外マトリックスの完全な非存在下で成熟した骨細胞集団を生成する。

概要

骨細胞、最も豊富な骨細胞型は、深く骨格内に位置する高度に分岐した細胞は最終分化している。成熟した骨細胞の細胞体は、骨小腔に含まれており、多様な形状を有する;丸みを帯びた骨細胞は、骨梁¹に、より頻繁であるのに対し、細長い細胞体と骨細胞は、皮質骨で発見されています。分枝樹状突起は、他の骨ではなく、他の骨の細胞型、骨髄、血管及び関連する周皮細胞を有するだけでなく、複数の連絡先を行う複雑なウェブを形成する、細管と呼ばれる小さなチャネルにおいて細胞体から延びて存在する。小腔と細管間質液中に含まれる介して、骨細胞はまた、最終的に循環系に接続されているので、それらはローカルでなく、イベントだけでなく、全身に影響を与えることができ、その逆もその挙動は、局所および全身の両方の変化によって調節することができる^2。

ザ·骨細胞の研究は、最近、このような組織および細胞特異的なトランスジェニック動物の生成、強力な顕微鏡技術のハイスループット分子スクリーニング^3,4の使用などのいくつかの技術的な進歩のおかげで勢いを得ている。しかしながら、これらの細胞の知識は、主に、in vitroモデルにおいて適切な相対的希少性のために、依然として不完全である。実際に、骨細胞が原因の深い位置の取得と文化の中で維持するためには、常に困難であった、そしてそのような分化した細胞の種類を特徴づける低レベルの増殖している。

それらは一般的に低い細胞収量を生産し、さらにいくつかの混入線維芽細胞は急速に骨⁰⁸過増殖というリスクを運ぶのに年に沿って、多数の方法は、一次骨^5-7を単離するために開発されてきた。この理由のために、 インビトロの実験作業の中で最も、十分に確立された骨細胞の細胞リットルでこれまで行われてきたINE MLO-Y4 ^9。

追加のin vitroでの方法論は、これらの細胞を研究する可能性を高めることができるし、骨細胞生物学と病態生理の解析を向上させることができます。主に採用される、そのような方法は、再現することが容易であるべきであり、細胞成熟に達するために、特別な器具類又は非常に長い時間を必要としない。初代細胞に該当する場合重要なことに、彼らはそれが可能なトランスジェニック動物を利用することであろう。我々は最近、レチノイン酸による骨芽細胞株MC3T3-E1のと初代骨芽細胞の治療は骨¹⁰の形態学的および分子的特徴をもつ分岐した細胞の均質な集団の開発につながる迅速な表現型変化を誘導することを説明した。

オールトランスレチノイン酸（ATRA）は、核レチノイン酸受容体（RARは）を結合することにより遺伝子転写を調節するビタミンAの活性代謝産物である。 RARは最終的に、レチノイン酸（RA）応答性標的遺伝子の¹¹の変調をもたらす、レチノイドX受容体（RXRの）とヘテロダイマーとしてDNAに結合する。 ATRAは、例えば、神経細胞¹²および有足¹³のような他の分岐した細胞は、それらのうち、いくつかの細胞型の分化および成熟を ​​調節することが示されている。

ここで説明する方法は、一次骨芽細胞に対するATRAの加算に基づいています。効果的にするために、ATRAは、定義された密度で播種した細胞上の正確な成熟段階で添加されなければならない;我々の経験では、これらの条件は、骨芽細胞から骨細胞への表現型のスイッチを得るために重要である。

プロトコル

全ての動物実験は、科学的な目的のために使用される動物の保護に関する国内および欧州の現行の規制に従って行ったとミラノ大学の倫理委員会によって審査され、承認された。

初代骨芽細胞の1。分離

この方法では、わずかな修正を加えて、Dodig ら ¹⁴によって記載された手順に従います。

1. 0.1％コラゲナーゼPおよび0.05％トリプシンHBSS培地に（2.5％トリプシン、10X、無フェノールレッドから開始）（ハンクス平衡塩溶液、無カルシウム、マグネシウム、またはフェノールレッド）を追加することで、メディアを消化準備します。
2. （手順はわずか1などのマウスに適用することができます）3〜4日齢のマウスを使用してください。
3. 断頭により犠牲に。 70％エタノールでスプレーヘッド、氷上に保つ。ピンセット及び解剖/外科ハサミで皮膚や筋肉層を除去する。
4. 優しく頭頂骨を削除し、2等分に矢状縫合に従うことによって、それらを分離する。骨は縫合糸および任意の接着性組織を含まず、手続きが完了するまでHBSS培地を含むウェルプレート内の個々の骨片を配置していることを確認してください。
5. HBSSを捨て、各ウェルに37℃で15分間消化培地を追加
6. 上清を捨てる。
7. 再び37℃で15分間消化培地を追加
8. このとき上清を保存し、α-MEM（最小必須培地）に入れて、10％FBS（ウシ胎児血清）および1％ストレプトマイシン/ペニシリンを補充。
9. 繰り返します1.7と1.8倍を繰り返します。
10. プール5分間425グラムで遠心分離して回収した画分3、スピン細胞、上清を捨て、細胞ペレットを再懸濁し、25cm ^2のフラスコに転送するために補充したα-MEMの3ミリリットルを追加します。
11. 破片および死細胞を除去するために24時間後に培地を変更します。
12. グリコ50μg/ mlのアスコルビン酸（AA）および3mMの追加cerol 2 - リン酸二ナトリウム塩水和物（GP）α-MEM培地である。
13. その後、一日おきに（α-MEMプラスAA / GP）培地を変更してください。

2。ATRAプロトコル

1. 不活性化を防止する暗い部屋でATRA（オールトランス型レチノイン酸）ですべての実験を行っています。
2. HBSS培地中の1Xトリプシン溶液を調製し、使用するまで37℃で維持する。
3. フルエント細胞から培地を除去し、慎重にHBSSでそれらを洗ってください。
4. 1ミリリットルのトリプシンを添加し、穏やかにすべての細胞は、トリプシンによって覆われることを可能にするために、フラスコを回転させ、37℃で3分間インキュベート
5. 倒立顕微鏡下で細胞の実際の剥離を確認してください。
6. トリプシンを不活性化するα-MEM培地の3ミリリットルを追加します。
7. 細胞を回収し、425グラムで15分間遠心する。
8. 新鮮な培地中で細胞ペレットを再懸濁する。
9. 血球計数器の計数室の低下を置き、数分のために解決することを可能にし、CEを数えるLL番号。
10. 10,000個の細胞のα-MEMプラスAA / GPと/ cm ²の密度で25cm ^2のフラスコ内で場所細胞。細胞密度が細胞突起および細胞間の接点の最適な開発に関連していることに注意してください。出発密度より高く、10,000細胞/ cm ^2の細胞プロセスの適切な発達を阻害するが、より低い細胞数は、細胞間の連絡先が存在しないため、時期尚早の細胞死をもたらす。
11. 24時間毎に培地から5μmのATRAを追加します。
12. 形態を評価するために日々のセルを監視：形態学的変化は、一般的に48時間後に観察される。場合は、最初の24〜48時間後に、細胞は、依然として上記の密度でreplate、増殖している。成熟した骨細胞の均質な集団は、4〜5日後に存在している。必要に応じて、12〜15日まで、任意の時点で細胞を使用する。
13. 細胞は、（このようなカバースリップまたはウェルプレートのような）他の支持体上にメッキされている場合、上記の濃度が維持されていることを確認してくださいと使用するまで、ATRAごとに24時間を追加していく。実験の前に少なくとも24時間のための新しいサポートに付着する細胞を残す。

3。免疫染色

1. 免疫染色のために、カバースリップ上の細胞をプレート（例えばバリー¹⁵を参照）確立された方法に従ってください。
2. 例えば、間接的免疫蛍光のために、室温で30分間、次いで暗所で二次蛍光標識抗体と、加湿チャンバー内で室温で1時間一次抗体で順次インキュベートし、4％パラホルムアルデヒドまたは冷アセトン中で固定し、加湿チャンバー内。
3. 核対比のために、DAPIまたは類似体を使用し、退色防止媒体にマウントします。

4。アリザリンレッド染色と抽出

1. カバースリップ上の細胞をプレート。
2. 10分間、70％エタノールでカバースリップを浸漬することによって細胞を固定。
3. アリザリンレッド染色溶液（1 mg / ml、pH5.5）に数滴を有する細胞をカバー30分間。
4. 水道水でカバースリップを洗ってください。マウントスライドガラス上グリセロールの降下と直立10Xと20X顕微鏡で倍率を用いて画像を取る。
5. 上記の手順の後、水道水でスライドを浸漬することにより、カバースリップを回復する。
6. ウェルプレートの各カバースリップを置く。
7. 60％過塩素酸（量は細胞を完全にカバーするのに十分でなければなら）を追加し、穏やかに撹拌しながら4℃でO / Nのままにしておきます。
8. 450 nmの波長で分光光度法により上清の光学濃度を読み取る。
9. 細胞数の値を正規化するために、10分間、細胞調製物を覆うようにヤヌスグリーン（PBS中の0.2％溶液）を加える。
10. 超純水で丁寧に洗ってください。
11. 0.5NのHClを追加する（数量はすべてのセルをカバーするのに十分でなければなら）、数秒間、手でそっと振る。
12. 分光光度計で615 nmの吸光度を読んでください。

結果

結果は5〜10の独立した実験から得られた。

細胞形態学

AA / GPは初代細胞は主に玉石のような機能、成熟骨芽細胞の特性を持って処理した。散在枝状細胞は、（ 図1Aの赤い矢印で示すように）可能性がいくつかの骨を表す、見出すことができる。

ATRA処理によって、細胞が急速に一般的に2日後に観察される波及効果を、表?...

ディスカッション

最後の年で骨細胞は、骨の中の最も中心的な細胞として浮上している。研究の進歩は、徐々に骨様々な疾患のための新規およびより良い治療を設計するために多大な価値が以前に実証されていない又は疑われていない骨細胞の特性の数を明らかにしている。しかしながら、骨細胞生物学の調査は骨細胞様細胞株MLO-Y4が利用可能になる前に骨芽細胞が長期にわたってサロゲート細胞として使用?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name	Company	Cat #	comments
Collagenase P	Roche Applied Science	11213857001
Trypsin	Gibco, Life Technologies	15400054
HBSS	Gibco, Life Technologies	14175129	Pre-warm at 37°C before use
Alpha-MEM	Invitrogen, Life Technologies	22571038	Pre-warm at 37°C before use
FBS	Sigma-Aldrich	F4135
Streptomycin/Penicillin	Sigma-Aldrich	P4333
Ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A4403
glycerol 2-phosphate disodium salt hydrate	Sigma-Aldrich	G9422
ATRA	Sigma-Aldrich	R2625	Protect ATRA from light
paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	Dissolve in PBS and filter before use. Work always under a chemical hood.
DAPI	Sigma-Aldrich	32670	Can be added to the secondary antibody
Alizarin red	Sigma-Aldrich	A5533
Janus Green	Sigma-Aldrich	201677
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	176745	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
HCl	Sigma-Aldrich	320331	Use with caution (skin and eye protection are recommended)
glycerol	Sigma-Aldrich	G5516
fluorsave	Calbiochem - Merck	345789
Economy Tweezers #7, 0.40 x 0.5mm tips	World Precision Instruments	501981
Economy Tweezers #4, 0.40 x 0.45mm tips	World Precision Instruments	501978
Dissecting Scissors, straight,10cm curved	World Precision Instruments	14394
Surgical Scissors, 14 cm, straight, S/S	World Precision Instruments	501218
Culture flasks	Corning	430168
Well-plates	Corning	3335
Thermanox coverslips	Thermo Scientific Nunc	12-565-27
microscope	Zeiss Apotome
spectrometer	Safas Xenius