JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

ליניארי הגברה בתיווך (לאם)-PCR היא שיטה שפותחה כדי לזהות את העמדות של שילוב וקטורים ויראליים בגנום המדויקות. הטכניקה התפתחה להיות השיטה מעולה ללמוד דינמיקה משובט בחולי ריפוי גנטי, בטיחות ביולוגית של טכנולוגיות חדישות וקטורית, גיוון תא T, מודלים תא גזע סרטני, וכו '

Abstract

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introduction

ליניארי הגברה בתיווך PCR (לאם-PCR) מאפשר זיהוי ואפיון DNA איגוף לא ידוע הסמוך לDNA ידוע מכל מקור. באופן ספציפי יותר, לאם-PCR פותח כדי לבצע לוקליזציה של אתרי אינטגרציה וקטור ויראלי (IS) בתוך הגנום המארח 1,2. אלמנטים גנטיים כמו רטרווירוסים או transposons לשלב הגנום שלהם לתוך הגנום המארח באופן אקראי (למחצה) 3-6. במקרים רבים זה הוא מכריע לדעת בדיוק המצב שבו הווקטורים האלה משולבים. לאם-PCR הוכח להיות עדיף על שיטות אלטרנטיביות כמו בתיווך קשירת PCR 7 וגרסותיה או PCR ההפוך 8. הרגישות וחוסנה של שיטה זו נובעים מpreamplification הראשוני של צמתים וקטור הגנום ובחירה מגנטית של מוצרי ה-PCR מוגבר. כמו השיטות חלופיות שהוזכרו, לאם-PCR מסתמך על השימוש באנזימי הגבלה, מציג נטייה ליכולת אחזור של IS 9-11. כך,רק קבוצת משנה של הרפרטואר (integrome) ניתן לאתרם בתגובה אחת. הטיה זו היא למזער על ידי הניתוח המקביל של מדגם נתון באמצעות שילובים אופטימליים של אנזימי הגבלה 9. לאחרונה, גרסה של הטכנולוגיה שמכונה שאינם מגבילה לאם-PCR (nrLAM-PCR) פותח שעוקפת את השימוש באנזימי הגבלה ומאפשרת ניתוח הגנום משוחד של מדגם בתגובה אחת 9,12.

בעבר, לאם-PCR נעשה שימוש כדי לזהות את רטרווירלי סיבתי נותן עלייה לוקמיה בכמה חולים בניסויים בריפוי גנטי קליניים 13-15. מאז, לאם-PCR הותאם לזהות IS מוקטורים אחרים שילוב (וקטורי lentiviral, transposons) וגם לזהות דפוסי השתלבות של פסיבי שילוב וקטורים כמו וקטורי adeno קשור (AAV) או וקטורי lentiviral אינטגראז פגום (IDLV) 16 -21. יישומים של האם-PCR הם רחב התפשטו: מסורתיly, הטכניקה היא בשימוש נרחב כדי לחקור את ההרכב המשובט של תאי גנים שונה בחולים שעברו טיפול גנטי או להעריך את הבטיחות הביולוגית של מערכות וקטור רומן של התרת האינטגרציה שלהם התנהגות 15,16,22-24. לאחרונה, לאם-PCR אפשר קביעת הספציפיות ופעילות מחוץ היעד של nucleases מעצב ידי assay השמנת IDLV 25.

יתר על כן, לאם-PCR מאפשר לעקוב בקלות את גורלו של תא transduced לאורך הזמן באורגניזם. זה מאפשר לזהות אב - אונקוגנים כמו גם גנים מדכאי סרטן וגם ללמוד ביולוגיה של תא גזע סרטני hematopoiesis או 26-28. אחרון אך לא פחות חשוב, לאם-PCR הותאם ללמוד גיוון קולט תא T בבני אדם 29 (ונתונים שלא פורסמו).

הכוח הפנימי של הטכנולוגיה מקבל חיזוק על ידי קישור השיטה לטכנולוגיות רצף עמוקים המאפשרות אפיון מיליונים DNA ידוע איגוף עם r נוקלאוטיד יחידesolution בגנומים שלמים. בפרוטוקול הבא, אנו מתארים צעד אחר צעד ההגברה וזיהוי של איגוף DNA ידוע exemplarily לזהות וקטור lentiviral IS. Oligonucleotides שימוש בפרוטוקול מפורטת בטבלה 1. חולץ DNA או cDNA של כל מקור יכול לשמש כתבנית ה-DNA לאם-PCR וnrLAM-PCR.

Protocol

1. הכנת קלטות לינקר (LC)

  1. מערבבים 40 μl של oligonucleotide LC1 (טבלת 1), 40 μl של oligonucleotide LC2 (טבלת 1, עם הסככה אנזים הגבלה מתאימה), 110 μl טריס-HCl (100 מ"מ, pH 7.5), ו10 μl 250 מ"מ MgCl 2.
  2. לדגור על 95 מעלות צלזיוס למשך 5min ולתת התגובה להתקרר באיטיות לטמפרטורת חדר. הוסף 300 μl H 2 O ולהתרכז dsLinker-DNA על מסנן צנטריפוגה. הוסף 80 μl H 2 O לeluate וaliquot 10 μl של קלטת מקשר מוכנה ב0.2 צינורות PCR.

2. Preamplification של צמתי הגנום וקטור

  1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
    1. לקבוע את הריכוז של דגימות דנ"א. פיפטה x μl (1-1,000 ng לLAM/100-1, 000 ng לnrLAM) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה וברןGE של 0.5-25 μl.
    2. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 2 מיקס (50 - x). Μl של תמהיל ההורים עם כל דגימת ה-DNA ב0.2 מיליליטר צינורות PCR.
  2. צמתים הגנום וקטור Preamplify באמצעות תנאי PCR שהודגם בטבלה 2. לאחר השלמת PCR להוסיף 0.5 μl תקי פולימראז לכל צינור PCR ותכנית ה-PCR בשידור חוזר. ניתן לאחסן את מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.

3. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR

  1. הכנת חרוזים מגנטיים
    1. פיפטה 20 μl (200 מיקרוגרם) של חרוזים מגנטיים streptavidin המצופה לתוך צינור 1.5 מ"ל ולחשוף דקות 1 על מפריד החלקיקים המגנטי (MPS) בטמפרטורת חדר. בטל supernatant.
    2. הסר את הצינור מMPS ו resuspend חרוזים מגנטיים ב40 PSB μl / BSA 0.1% (pH 7.5). לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חזור על פעולה זו פעם אחת.
    3. לשטוף חרוזי wiה 20 μl של 3 פתרון M LiCl (3 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA) לחשוף לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. חרוזים resuspend ב 50 μl של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA).
  2. מערבבים את תגובת PCR כל משלב 2.2 עם 50 μl של חרוזים מגנטיים שהוכנו מראש. דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) לפחות לשעה 2 בטמפרטורת חדר. שלב זה מאפשר קשירה של מוצר ה-PCR biotinylated לstreptavidin חרוזים מצופים (מורכב ה-DNA ביד). מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
  3. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS 1 דקות בטמפרטורת חדר, להסיר supernatant, resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. מייד להמשיך בשלב 4 לאם או על שלב 5 עבור nrLAM.

4. לאם-סדר דין

  1. הכפול הגדיל DNA (dsDNA) סינתזה (לאם בלבד)
    1. לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPS דקות 1 ודיסsupernatant כרטיס. הוספת 8.25 μl של H 2 O, 1 μl חיץ 10x hexanucleotide, 0.25 dNTPs μl (10 מ"מ) ו0.5 μl (2 U) פולימראז Klenow. לדגור על C ° 37 במשך שעה 1.
    2. הוספת 90 μl של H 2 O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב 100 μl H 2 O.
  2. ההגבלה Digest
    1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוספת 8.5 μl H 2 O, 1 μl חיץ 10x אנזים הגבלה ו0.5 μl של אנזים הגבלה ודגירת תגובה במשך שעה 1. חזור על השלב 4.1.2.
      הערה: דגירה תגובה בטמפרטורה המומלצת על ידי היצרן של אנזים ההגבלה. ודא כי אין כיום אתר הגבלה בתוך או במורד הזרם של האתר מחייב פריימר משמש לpreamplification ב-DNA של עניין. לבחירה של שילובי אנזים אנזימי הגבלה / הגבלה המתאימים להתייחס ל9.
  3. קשירה של ds לינקר (LK)
    1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. הוסף 5 μl H 2 O, 1 μl חיץ 10x Fastlink, ATP μl 1 (10 מ"מ), 2 μl קלטת לינקר משלב 1.2, ו1 μl מהיר-Link-DNA אנזים (2 U / μl). דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5 דקות. חזור על השלב 4.1.2.
  4. Denaturation של המסונתז dsDNA
    1. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant. מורכב resuspend-DNA חרוז ב5 μl 0.1 N NaOH. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי.
    2. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 ולאסוף צומת וקטור הגנום preamplified המכילה supernatant בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך בשלב 6 או supernatant חנות ב -20 ° C.

5. NrLAM-סדר דין

  1. קשירה של מקשר חד גדילים (ssLC) (nrLAM בלבד)
    1. לחשוף את ה-DNA המורכב ביד מהשלב 3.3 לMPSדקות 1 ו supernatant קלפים שנזרקו. הוספת 6.5 μl H 2 O, μl 1 CircLigase 10x תגובת הצפת, 0.5 μl MnCl 2 (50 מ"מ), 0.5 μl-ATP (1 מ"מ), oligonucleotide ssLinker μl 1 וCircLigase 0.5 μl (100 U / μl). לדגור על C ° 60 במשך שעה 1.
    2. הוספת 90 μl של H 2 O ולחשוף לMPS דקות 1. בטל supernatant ולשטוף מורכבים-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. שוב לחשוף לMPS דקות 1, supernatant קלפים שנזרקו ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב H μl 10 2 O.

6. מעריכי ההגברה אני

  1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
    1. פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 4.4.2 (לאם) או 5.1.2 (nrLAM)) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
    2. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 3. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 6.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי conditio PCRNS שהודגם בטבלה 3. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.

7. הפרדה מגנטית של מוצרי ה-PCR

  1. הכן את חרוזים מגנטיים כפי שהודגם בצעדים 3.1.1 - 3.1.3. חרוזים resuspend ב 20 μl (לאם) או 50 μl (לnrLAM) של 6 פתרון M LiCl (6 M LiCl, 10 מ"מ טריס-HCl, 1 mM EDTA). מערבבים 20 μl (לאם) או 50 μl (nrLAM) של תגובת PCR מהצעד 6.1.2 עם חרוזים מגנטיים מוכנים (צעד 7.1) ו דגירה על שייקר אופקי (300 סל"ד) עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר. מורכב חרוז ה-DNA יכול להיות מודגרות שבייקרה לילה או מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים.
  2. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1, להסיר את supernatant ו resuspend מורכב-DNA חרוז ב100 μl H 2 O. לחשוף מורכב-DNA חרוז לMPS דקות 1 וזורקים supernatant.
  3. קומפלקס ה-DNA חרוז resuspend ב 20 μl (לאם) או 5 μl (nrLAM) 0.1 N NaOH. Incuבייט ל10 דקות בטמפרטורת חדר על שייקר אופקי, לחשוף לMPS דקות 1 ולאסוף supernatant DNA המכיל מוגבר בצינור 1.5 מיליליטר חדש. מייד להמשיך עם צעד 8.1 או supernatant חנות ב -20 ° C.

8. מעריכי ההגברה השני

  1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
    1. פיפטה 2 תבנית ה-DNA μl (משלב 7.3) לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר.
    2. הכינו תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 4. הוספת 48 μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 8.1.1 ולהגביר צמתים הגנום וקטור ידי תנאי ה-PCR שהודגם בטבלה 4. ניתן לאחסן מוצרי ה-PCR על 4 מעלות צלזיוס עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
  2. כדי להמחיש (ע"נ) מוצרים לאם-PCR, עומס 10 μl של המוצר ה-PCR מצעד 8.1.2 על ג'ל agarose 2%. אם להקות גלויות, לנתח 10 μl של המוצר לאם-PCR על ג'ל ברזולוציה גבוהה. זהירות: Etברומיד hidium הוא mutagenic. לעבוד בזהירות ותמיד ללבוש כפפות מתאימות.

9. הכנה לרצף תפוקה גבוהה

  1. טיהור (ע"נ) מוצרים לאם-PCR
    1. מערבבים 40 μl PCR-מוצרים מהצעד 8.1.2 עם 44 μl של חרוזים מגנטיים טמפרטורת חדר AMPure XP. דגירה 5 דקות בטמפרטורת חדר ולחשוף לMPS למשך 2 דקות נוספות.
    2. בטל supernatant ולשטוף פעמיים עם 200 μl EtOH 70% על MPS.
    3. בטל supernatant ומורכב ה-DNA חרוז resuspend ב30 H μl 2 O. דגירה 1 דקות וsupernatant העברה לצינור 0.2 מיליליטר טרי. לקבוע את הריכוז של ה-DNA מטוהר.
  2. Fusionprimer PCR להוסיף רצף מתאמים ספציפיים.
    1. עבור כל מדגם להיות מנותחים להכין תגובת PCR 50 μl.
    2. פיפטה x μl (40 ng) של ה-DNA לתוך צינור PCR 0.2 מיליליטר. נפח של ה-DNA צריך להיות שווה בכל דגימה ובטווח של 0.5-25 μl.
    3. הכן תערובת אב PCR כפי שמתואר בטבלה 5 הוסף (50 - x). Μl של מיקס מאסטר כל דגימה מהצעד 9.2.2 ולהציג את מתאמי רצף ל( ע"נ) מוצרים לאם-PCR על ידי תנאי ה-PCR שהודגם בלוח 5 מוצרי ה-PCR. יכול להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד 4 ימים או לטווח ארוך ב -20 ° C.
    4. כדי להמחיש את עומס מוצרי Fusionprimer-PCR 10 μl של המוצר ה-PCR מהצעד 9.2.3 על ג'ל agarose 2%. לטהר את המוצר ה-PCR שנותר כפי שמתואר בצעדים 9.1.1 - 9.1.3. נתח 1 μl מוצר ה-PCR מטוהר מצעד 9.4 על מכשיר אלקטרופורזה ברזולוציה גבוהה אוטומטי מדויק לכמת גודל ריכוז ושבר של מוצרי Fusionprimer-PCR.

תוצאות

לאם-PCR תוצאות בהגברה של צמתים הגנום וקטור עם גודל שבר שהוגדר עבור כל צומת. הגודל של שברי PCR פרט תלוי במרחק בין המיקום של ה-DNA הידוע בגנום ואתר ההכרה הקרוב ביותר הגבלת האנזים. זה מאפשר לדמיין את המגוון של צמתים מוגברות בדגימות נותחו על ידי ג'ל אלקטרופורזה, למשל., אם ...

Discussion

הטכניקה לאם-PCR מאפשרת זיהוי רצפי DNA ידועים כי האגף אזור ה-DNA ידוע. בגלל הרגישות הגבוהה וכתוצאה מpreamplification של צמתים עם הכלאת פריימרים ספציפיים ברצף ה-DNA הידוע, אפשר להגביר ולזהות אפילו צמתים נדירים עד לרמת התא הבודד. להיפך, במצב polyclonal לאם-PCR הוא מסוגל להגביר אלפי צמתים שונ?...

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Taq DNA PolymeraseGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Alternative Taq Polymerases may be used
PCR BufferQiagen201203Use of this buffer is recommended
dNTP-MixtureGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)MWG BiotechHPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860.1% wt/vol BSA
6 M LiClRoth3739.110 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5USB Corporation 22637or any other supplier
EDTAApplichemA1103,0250or any other supplier
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
Hexanucleotide mixtureRoche Diagnostics11277081001
Restriction endonucleaseNEBor any other supplier
Fast-Link DNA ligation kitEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase ssDNA Ligase KitEpicentre BiotechnologiesCL4111K
NaOHSigma-Aldrich72068or any other supplier
Agarose LERoche Diagnostics11685660001or any other supplier
TBE bufferAmresco0658or any other supplier
Ethidium bromideApplichemA2273,0005Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA LadderInvitrogen15628-050or any other DNA ladder
20 mM NaClSigma-Aldrich71393-1Lor any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator Life TechnologiesK158501for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle SeparatorLife TechnologiesK158696for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membraneMilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515or other electrophoresis system 
TProfessional 96Biometra050-551or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basicIKA2980200or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 mlBiozym Scientific GmbH711082or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubesEppendorf12682or other 1.5 ml tubes
Gel documentation systemPeqLabor any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometerThermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 precast gelElchrom Scientific3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 Elchrom Scientific2001E
2100 Electrophoresis BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA

References

  1. Schmidt, M., et al. Detection and direct genomic sequencing of multiple rare unknown flanking DNA in highly complex samples. Hum Gene Ther. 12, 743-749 (2001).
  2. Schmidt, M., et al. High-resolution insertion-site analysis by linear amplification-mediated PCR (LAM-PCR). Nat Methods. 4, 1051-1057 (2007).
  3. Schroeder, A. R., et al. HIV-1 integration in the human genome favors active genes and local hotspots. Cell. 110, 521-529 (2002).
  4. Wu, X., Li, Y., Crise, B., Burgess, S. M. Transcription start regions in the human genome are favored targets for MLV integration. Science. 300, 1749-1751 (2003).
  5. Vigdal, T. J., Kaufman, C. D., Izsvak, Z., Voytas, D. F., Ivics, Z. Common physical properties of DNA affecting target site selection of sleeping beauty and other Tc1/mariner transposable elements. J Mol Biol. 323, 441-452 (2002).
  6. Lewinski, M. K., et al. Retroviral DNA integration: viral and cellular determinants of target-site selection. PLoS Pathog. 2, (2006).
  7. Mueller, P. R., Wold, B. In vivo footprinting of a muscle specific enhancer by ligation mediated PCR. Science. 246, 780-786 (1989).
  8. Silver, J., Keerikatte, V. Novel use of polymerase chain reaction to amplify cellular DNA adjacent to an integrated provirus. Journal of virology. 63, 1924-1928 (1989).
  9. Gabriel, R., et al. Comprehensive genomic access to vector integration in clinical gene therapy. Nature medicine. 15, 1431-1436 (2009).
  10. Harkey, M. A., et al. Multiarm high-throughput integration site detection: limitations of LAM-PCR technology and optimization for clonal analysis. Stem Cells Dev. 16, 381-392 (2007).
  11. Wang, G. P., et al. DNA bar coding and pyrosequencing to analyze adverse events in therapeutic gene transfer. Nucleic acids research. 36, (2008).
  12. Paruzynski, A., et al. Genome-wide high-throughput integrome analyses by nrLAM-PCR and next-generation sequencing. Nat. Protocols. 5, 1379-1395 (2010).
  13. Hacein-Bey-Abina, S., et al. Insertional oncogenesis in 4 patients after retrovirus-mediated gene therapy of SCID-X1. J Clin Invest. , 3132-3142 (2008).
  14. Hacein-Bey-Abina, S., et al. LMO2-associated clonal T cell proliferation in two patients after gene therapy for SCID-X1. Science. 302, 415-419 (2003).
  15. Howe, S. J., et al. Insertional mutagenesis combined with acquired somatic mutations causes leukemogenesis following gene therapy of SCID-X1 patients. J Clin Invest. 118, 3143-3150 (2008).
  16. Cartier, N., et al. Hematopoietic stem cell gene therapy with a lentiviral vector in X-linked adrenoleukodystrophy. Science. 326, 818-823 (2009).
  17. Matrai, J., et al. Hepatocyte-targeted expression by integrase-defective lentiviral vectors induces antigen-specific tolerance in mice with low genotoxic risk. Hepatology. 53, 1696-1707 (2011).
  18. Penaud-Budloo, M., et al. Adeno-associated virus vector genomes persist as episomal chromatin in primate muscle. Journal of virology. 82, 7875-7885 (2008).
  19. Kaeppel, C., et al. A largely random AAV integration profile after LPLD gene therapy. Nature medicine. 19, 889-891 (2013).
  20. Voigt, K., et al. Retargeting sleeping beauty transposon insertions by engineered zinc finger DNA-binding domains. Mol Ther. 20, 1852-1862 (2012).
  21. Yanez-Munoz, R. J., et al. Effective gene therapy with nonintegrating lentiviral vectors. Nature medicine. 12, 348-353 (2006).
  22. Boztug, K., et al. Stem-Cell Gene Therapy for the Wiskott-Aldrich Syndrome. N Engl J Med. 363, 1918-1927 (2010).
  23. Deichmann, A., et al. Vector integration is nonrandom and clustered and influences the fate of lymphopoiesis in SCID-X1 gene therapy. J Clin Invest. 117, 2225-2232 (2007).
  24. Schwarzwaelder, K., et al. Gammaretrovirus-mediated correction of SCID-X1 is associated with skewed vector integration site distribution in vivo. J Clin Invest. 117, 2241-2249 (2007).
  25. Gabriel, R., et al. An unbiased genome-wide analysis of zinc-finger nuclease specificity. Nat Biotechnol. 29, 816-823 (2011).
  26. Dieter, S. M., et al. Distinct types of tumor-initiating cells form human colon cancer tumors and metastases. Cell Stem Cell. 9, 357-365 (2011).
  27. Montini, E., et al. Hematopoietic stem cell gene transfer in a tumor-prone mouse model uncovers low genotoxicity of lentiviral vector integration. Nature biotechnology. 24, 687-696 (2006).
  28. Zavidij, O., et al. Stable long-term blood formation by stem cells in murine steady-state hematopoiesis. Stem Cells. 30, 1961-1970 (2012).
  29. Martins, V. C., et al. Thymus-autonomous T cell development in the absence of progenitor import. J Exp Med. 209, 1409-1417 (2012).
  30. Arens, A., et al. Bioinformatic clonality analysis of next-generation sequencing-derived viral vector integration sites. Hum Gene Ther Methods. 23, 111-118 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

88integromePCRretrovirallentiviralAAVmutagenesis

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved