Amplification linéaire d'une PCR - Localisation des éléments génétiques et caractérisation de Unknown ADN flanquant

Résumé

Linéaire amplification médiée (LAM)-PCR est une méthode mise au point pour identifier la position exacte de l'intégration des vecteurs viraux dans le génome. La technique a évolué pour devenir la meilleure méthode pour étudier la dynamique clonale chez les patients de thérapie génique, de la biosécurité de nouvelles technologies de vecteur, la diversité des lymphocytes T, des modèles de cellules souches du cancer, etc

Résumé

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introduction

Linéaire d'amplification médiée par PCR (LAM-PCR) permet d'identifier et de caractériser inconnu ADN flanquant adjacente à ADN connu de toute origine. Plus précisément, LAM-PCR a été développée pour localiser les sites d'intégration de vecteurs viraux (IS) dans le génome hôte ^1,2. Les éléments génétiques comme les rétrovirus ou transposons intégrer leur génome dans le génome de l'hôte dans un (semi-) de manière aléatoire ^3-6. Dans de nombreux cas, il est décisif de savoir exactement l'endroit où ces vecteurs intégrés. LAM-PCR a été prouvé pour être supérieur à d'autres techniques comme la ligature et d'une PCR ⁷ et ses variantes ou PCR inverse ^8. La sensibilité et la robustesse de cette méthode résultent d'une pré-amplification initiale des jonctions vecteur du génome et la sélection magnétique de produits de PCR amplifiés. Comme les autres méthodes mentionnées, LAM-PCR repose sur l'utilisation d'enzymes de restriction, l'introduction d'un biais dans la capacité de récupération de l'IS ^9-11. Ainsi,seulement un sous-ensemble du répertoire IS (la integrome) peut être détecté dans une réaction. Ce biais est minimisé par l'analyse en parallèle d'un échantillon donné en utilisant des combinaisons optimales des enzymes de restriction ^9. Récemment, une variante de la technologie dite non restrictive LAM-PCR (nrLAM-PCR) a été développé qui contourne l'utilisation d'enzymes de restriction et permet impartiale analyse du génome d'un échantillon dans une seule réaction ^9,12.

Dans le passé, LAM-PCR a été utilisée pour identifier le responsable rétrovirale donne lieu à la leucémie chez quelques patients dans les essais cliniques de thérapie génique ^13-15. Depuis lors, LAM-PCR a été conçu pour identifier IS d'autres vecteurs d'intégration (vecteurs lentiviraux, transposons) et aussi d'identifier des modèles d'intégration d'intégration passivement vecteurs comme vecteurs adéno-associés (AAV) ou vecteurs lentiviraux intégrase défectueux (IDLV) ^{16 -21.} Applications de LAM-PCR sont largement répandus: traditionnellement, la technique est largement utilisée pour étudier la composition clonale de cellules de gènes modifiés chez les patients qui ont subi la thérapie génique ou pour évaluer la biosécurité des nouveaux systèmes de vecteurs par démêler leur comportement d'intégration ^15,16,22-24. Récemment, LAM-PCR a permis de déterminer la spécificité et de l'activité hors cible des nucléases de luxe par un essai de piégeage IDLV ^25.

En outre, LAM-PCR permet de suivre facilement le sort d'une cellule transduction au fil du temps dans un organisme. Ceci permet d'identifier les proto-oncogènes ainsi que des gènes suppresseurs de tumeurs et également pour étudier l'hématopoïèse ou de la tige de biologie des cellules cancéreuses ^26-28. Last but not least, LAM-PCR a été adapté pour étudier la diversité de récepteur des cellules T chez l'homme ⁽²⁹ et données non publiées).

La puissance intrinsèque de la technologie est renforcée par le procédé de liaison à des technologies de séquençage profondes qui permettent la caractérisation des millions d'ADN flanquant inconnu avec un seul nucléotide résolution dans les génomes entiers. Dans le protocole suivant, nous décrivons étape par étape l'amplification et l'identification de l'ADN flanquant inconnu exemplairement pour identifier vecteur lentiviral EST. Les oligonucleotides utilisés dans le protocole sont répertoriés dans le tableau 1. Extrait d'ADN ou d'ADNc de n'importe quelle source peuvent être utilisés en tant que matrice d'ADN pour LAM-PCR et PCR-nrLAM.

Protocole

1. Préparation de l'éditeur de liens Cassettes (LC)

1. Mélanger 40 ul de LC1 oligonucléotide (Tableau 1), 40 pl de LC2 oligonucléotide (Tableau 1, avec l'enzyme appropriée de restriction saillie), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), et 10 ul de 250 mM de MgCl _2.
2. Incuber à 95 ° C pendant 5 minutes et laisser la réaction refroidir lentement à température ambiante. Ajouter 300 ul de H ₂ O et on concentre dsLinker-ADN sur un filtre de centrifugation. Ajouter 80 ul H ₂ O à l'éluat et aliquote de 10 ul de la cassette de liaison préparés dans des tubes PCR de 0,2.

2. Préamplification de génome vecteur jonctions

1. Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
   1. Déterminer la concentration des échantillons d'ADN. Pipette x pi (1-1,000 ng pour LAM/100-1, 000 ng pour nrLAM) de l'ADN dans un tube PCR de 0,2 ml. Volume de l'ADN devrait être égale dans chaque échantillon et en l'range de 0,5 à 25 pl.
   2. Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 2 Mix (50 - x). Pl du mélange maître avec chaque échantillon d'ADN dans 0,2 ml tubes PCR.
2. Préamplifier vecteur jonctions du génome en utilisant des conditions de PCR illustrés dans le tableau 2. Après l'achèvement de la PCR ajouter 0,5 ul de Taq polymérase dans chaque tube PCR et PCR programme de réexécution. Les produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.

3. Séparation magnétique de produit PCR

1. Préparation des billes magnétiques
   1. Introduire à la pipette 20 ul (200 pg) de billes magnétiques revêtues de streptavidine dans un tube de 1,5 ml et exposer pendant 1 min sur le séparateur de particules magnétiques (MPS) à la température ambiante. Rejeter le surnageant.
   2. Retirer le tube du MPS et remettre en suspension des billes magnétiques dans 40 ul PSB / BSA à 0,1% (pH 7,5). Exposer à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Répétez cette étape une fois.
   3. Lavez perles wie 20 ul de solution 3 M de LiCl (3 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA) à exposer MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Resuspendre les billes dans 50 pl de solution 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA).
2. Mélanger ensemble de la réaction de PCR provenant de l'étape 2.2 avec 50 ul de billes magnétiques préparées. Incuber sur un agitateur horizontal (300 rpm), au moins pendant 2 h à température ambiante. Cette étape permet de lier de produit PCR biotinylé à la streptavidine billes revêtues (complexe ADN-Bead). complexe de bourrelet d'ADN peut être incubée pendant une nuit dans un agitateur ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours.
3. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min à température ambiante, enlever le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead 100 pi H ₂ O. Procéder immédiatement à l'étape 4 pour LAM ou l'étape 5 pour nrLAM.

4. LAM-procédure

1. Strand ADN double (ADN double brin) Synthèse (LAM seulement)
   1. Exposer complexe ADN-perle de l'étape 3.3 de MPS pendant 1 min et discarte surnageant. Ajouter 8,25 pi de H ₂ O, 1 pl 10x tampon hexanucléotidique, 0,25 dNTP pi (10 mm) et 0,5 pi (2 U) polymérase de Klenow. Incuber à 37 ° C pendant 1 heure.
   2. Ajouter 90 ul de H ₂ O et exposer à MPS pour 1 min. Rejeter le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 100 pi de H ₂ O.
2. Restriction Digest
   1. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 8,5 pi de H ₂ O, 1 ul de 10 x tampon d'enzyme de restriction et 0,5 ul d'enzyme de restriction de réaction et incuber pendant 1 heure. Répétez l'étape 4.1.2.
      NOTE: Incuber la réaction à la température recommandée par le fabricant de l'enzyme de restriction. Assurez-vous qu'il n'ya pas de site de restriction présents dans ou en aval du site de liaison de l'amorce utilisée pour pré-amplification de l'ADN d'intérêt. Pour le choix des combinaisons appropriées des enzymes de restriction / enzyme de restriction reportez-vous à ^9.
3. La ligature des DS Linker (LK)
   1. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 5 ul de H ₂ O, 1 pi de tampon 10x FastLink, 1 ul d'ATP (10 mM), 2 ul de lieur de cassette de l'étape 1.2, et de 1 ul de production rapide-Link ADN ligase (2 U / pl). Incuber à température ambiante pendant 5 min. Répétez l'étape 4.1.2.
4. Dénaturation des ADN double brin synthétisé
   1. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 5 pi de NaOH 0,1. Incuber 5 minutes à température ambiante sur un agitateur horizontal.
   2. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et collecter préamplifié jonction vecteur du génome contenant surnageant dans nouveau tube de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l'étape 6 ou magasin surnageant à -20 ° C.

5. NrLAM-procédure

1. La ligature de liaison unique brin (sslc) (nrLAM seulement)
   1. Exposer complexe ADN-perle de l'étape 3.3 de MPSpendant 1 min et éliminer le surnageant. Ajouter 6,5 pi de H ₂ O, 1 ul de tampon de réaction CircLigase 10x, 0,5 pi de _MnCl2 (50 mM), 0,5 ul d'ATP (1 mM), 1 pl ssLinker oligonucléotide et 0,5 ul CircLigase (100 U / pl). Incuber à 60 ° C pendant 1 heure.
   2. Ajouter 90 ul de H ₂ O et exposer à MPS pour 1 min. Jeter le surnageant et laver complexe ADN-Bead 100 pi H ₂ O. Encore une fois exposer à MPS pendant 1 min, le surnageant et remettre en suspension des rejets complexe ADN-Bead dans 10 pl H ₂ O.

6. Amplification exponentielle je

1. Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
   1. Pipette ADN matrice 2 yl (de l'étape 4.4.2 (LAM) ou 5.1.2 (nrLAM)) dans un tube PCR de 0,2 ml.
   2. Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 3. Ajouter 48 pi de mélange maître à chaque échantillon de l'étape 6.1.1 et amplifier vecteur génome jonctions par conditio PCRns illustrés dans le tableau 3. produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.

7. Séparation magnétique de produit PCR

1. Préparer des billes magnétiques comme illustré dans les étapes 3.1.1 - 3.1.3. Resuspendre les billes dans 20 pl (par LAM) ou 50 pi (par nrLAM) de solution 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mélanger 20 ul (LAM) ou 50 pi (nrLAM) de réaction de PCR à partir de l'étape 6.1.2 préparés avec des billes magnétiques (étape 7.1) et incuber sur un agitateur horizontal (300 rpm) pendant 2 h à température ambiante. complexe de bourrelet d'ADN peut être incubée pendant une nuit dans un agitateur ou stocké à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours.
2. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min, enlever le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead 100 pi H ₂ O. Exposer complexe ADN-Talon à MPS pendant 1 min et éliminer le surnageant.
3. Remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 20 pi (LAM) ou 5 pi (nrLAM) NaOH 0,1 N. Incudébat pendant 10 min à température ambiante sur un agitateur horizontal, exposer à MPS pour 1 minute et recueillir l'ADN amplifié contenant surnageant dans nouveau tube de 1,5 ml. Procéder immédiatement à l'étape 8.1 ou magasin surnageant à -20 ° C.

8. Amplification exponentielle II

1. Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
   1. Pipette ADN matrice 2 yl (de l'étape 7.3) dans un tube PCR de 0,2 ml.
   2. Préparer PCR Master Mix, comme décrit dans le tableau 4. Ajouter 48 pi de mélange maître pour chaque échantillon à partir de l'étape 8.1.1 et amplifier le génome vecteur jonctions par des conditions de PCR illustrés dans le tableau 4. Produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
2. Pour visualiser (nr) les produits LAM-PCR, charge 10 pi du produit de PCR provenant de l'étape 8.1.2 sur un gel d'agarose à 2%. Si les bandes sont visibles, 10 ul d'analyser le produit LAM-PCR sur gel à haute résolution. ATTENTION: Etbromure de hidium est mutagène. Travailler très soigneusement et toujours porter des gants appropriés.

9. Préparation de séquençage à haut débit

1. Purification de (nr) produits LAM-PCR
   1. Mélanger 40 pi PCR-produit de l'étape 8.1.2 avec 44 pi de température ambiante AMPure XP billes magnétiques. Incuber 5 minutes à température ambiante et à exposer MPS pendant encore 2 min.
   2. Rejeter le surnageant et laver deux fois avec 200 ul EtOH à 70% sur les MPS.
   3. Rejeter le surnageant et remettre en suspension complexe ADN-Bead dans 30 pl H ₂ O. Incuber 1 min surnageant et les frais tube de 0,2 ml. Déterminer la concentration de l'ADN purifié.
2. Fusionprimer PCR pour ajouter séquençage adaptateurs spécifiques.
   1. Pour chaque échantillon à analyser préparer une réaction de PCR de 50 ul.
   2. Pipette x pi (40 ng) d'ADN dans un tube PCR de 0,2 ml. Volume de l'ADN devrait être égale dans chaque échantillon et dans la gamme de 0,5 à 25 pl.
   3. Préparer PCR master mix comme décrit dans le tableau 5 Ajouter (50 - x). Pi de mélange maître à chaque échantillon de l'étape 9.2.2 et introduire des adaptateurs de séquençage à (nr) produits LAM-PCR en conditions de PCR illustrés dans le tableau 5 produits de PCR. peuvent être stockées à 4 ° C pendant jusqu'à 4 jours ou à long terme à -20 ° C.
   4. Pour visualiser Fusionprimer-PCR de produits de charge 10 ul du produit de PCR provenant de l'étape 9.2.3 sur un gel d'agarose à 2%. Purifier le produit PCR reste comme décrit dans les étapes 9.1.1 - 9.1.3. Analyser une pl de produit PCR purifié de l'étape 9.4 sur un dispositif d'électrophorèse à haute résolution automatisées pour quantifier avec précision la concentration et la taille des fragments produits Fusionprimer-PCR.

Résultats

Résultats de LAM-PCR dans l'amplification de génome vecteur jonctions avec une taille de fragment défini pour chaque jonction. La taille des fragments de PCR individuels dépend de la distance entre l'emplacement de l'ADN connues dans le génome et le site de reconnaissance de l'enzyme de restriction le plus proche. Ceci permet la visualisation de la diversité des jonctions amplifiées dans les échantillons analysés par électrophorèse sur gel, par exemple., Si ce n'est que seule (mon...

Discussion

La technique LAM-PCR permet d'identifier des séquences d'ADN inconnues qui flanquent une région d'ADN connue. En raison de la sensibilité élevée résultant de pré-amplification de la jonction avec l'hybridation des amorces spécifiques de la séquence d'ADN connue, il est possible d'amplifier et de détecter même des jonctions rares jusqu'au niveau de la cellule unique. A l'inverse, dans une situation polyclonal LAM-PCR est capable d'amplifier les milliers de différentes jonct...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerases may be used
PCR Buffer	Qiagen	201203	Use of this buffer is recommended
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)	MWG Biotech		HPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	or any other supplier
EDTA	Applichem	A1103,0250	or any other supplier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mixture	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		or any other supplier
Fast-Link DNA ligation kit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	or any other supplier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	or any other supplier
TBE buffer	Amresco	0658	or any other supplier
Ethidium bromide	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158696	for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	or other electrophoresis system
TProfessional 96	Biometra	050-551	or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubes	Eppendorf	12682	or other 1.5 ml tubes
Gel documentation system	PeqLab		or any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 precast gel	Elchrom Scientific	3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA