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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Linear-vermittelte Amplifikation (LAM)-PCR ist eine Abwicklung, die genauen Positionen der Integration von viraler Vektoren in das Genom zu identifizieren Verfahren. Die Technik hat sich weiterentwickelt, um die überlegene Methode zur klonalen Dynamik in der Gentherapie-Patienten, biologische Sicherheit von neuartigen Technologien Vektor, T-Zell-Vielfalt, die Krebsstammzellen Modelle usw. studieren

Zusammenfassung

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Einleitung

Linear-PCR-vermittelte Amplifikation (LAM-PCR) ermöglicht die Identifizierung und Charakterisierung von unbekannten flankierenden DNA benachbart zu bekannten DNA beliebigen Ursprungs. Genauer gesagt, LAM-PCR wurde zur viralen Vektor Integrationsstellen zu lokalisieren (IS) innerhalb des Wirtsgenoms 1,2. Genetische Elemente wie Transposons oder Retroviren integrieren ihr Genom in das Wirtsgenom in einer (halb-) zufälliger Weise 3-6. In vielen Fällen ist es entscheidend, genau die Position, wo diese Vektoren integriert kennen. LAM-PCR nachgewiesen worden überlegen alternative Techniken wie PCR-vermittelte Ligation 7 und seiner Varianten oder inversen PCR-8 sein. Die Empfindlichkeit und Robustheit dieses Verfahrens ergibt sich aus der anfänglichen Vorverstärkung der Vektor-Genom Gänge und magnetische Auswahl amplifizierte PCR-Produkte. Wie die genannten alternativen Verfahren beruht LAM-PCR auf der Verwendung von Restriktionsenzymen, die Einführung eines Bias in Abrufkapazität 9-11. Folglichnur ein Teil des IS-Repertoire (die integrome) in einer Reaktion nachgewiesen werden. Diese Vorspannung wird durch die parallele Analyse einer gegebenen Probe mit optimalen Kombinationen von Restriktionsenzymen 9 minimiert. Kürzlich wurde eine Variante der Technik bezeichnet nicht einschränkenden LAM-PCR (nrLAM-PCR) entwickelt worden, die die Verwendung von Restriktionsenzymen umgeht und ermöglicht unvoreingenommene genomweiten Analyse einer Probe in einem einzigen Reaktions 9,12.

In der Vergangenheit LAM-PCR wurde zur Identifizierung der Verursacher retroviralen IS, die zu Leukämie bei einigen Patienten in der klinischen Gentherapie-Versuche 13-15. Seitdem LAM-PCR wurde angepasst, um zu identifizieren, ist von anderen Integrationsvektoren (lentiviralen Vektoren, Transposons) sowie Integrationsmuster passiv integrierende Vektoren wie Adeno-assoziierten Vektoren (AAV) oder Integrase-defekt lentiviralen Vektoren (IDLV) identifizieren 16 -21. Anwendungen der LAM-PCR sind weit verbreitet: traditionellely, die Technik ist weit verbreitet, um die klonale Zusammensetzung von Gen-veränderten Zellen bei Patienten, die Gen-Therapie unterzogen haben oder studieren, um die biologische Sicherheit von neuartigen Vektorsysteme mit der Entschlüsselung ihrer Integration 15,16,22-24 Verhalten zu beurteilen. Kürzlich LAM-PCR aktiviert Bestimmung Spezifität und Off-Target-Aktivität von Designer-Nukleasen durch eine IDLV Trapping-Assay 25.

Darüber hinaus ermöglicht LAM-PCR, um leicht folgen das Schicksal einer Zelle transduziert im Laufe der Zeit in einem Organismus. Dies erlaubt es, Proto-Onkogene als auch Tumor-Suppressor-Gene zu identifizieren und auch zu Blutbildung oder Krebsstammzellbiologie 26-28 studieren. Nicht zuletzt, LAM-PCR wurde an T-Zell-Rezeptor-Diversity beim Menschen 29 (unveröffentlichte Daten) zu studieren.

Die Eigenleistung der Technik wird durch die Verknüpfung der Methode, um tiefe Sequenzierungstechnologien, die Charakterisierung von Millionen von unbekannten flankierenden DNA mit Einzel-Nukleotid-r erlauben verstärkteSOLUTION in ganzer Genome. In dem folgenden Protokoll beschreiben wir Schritt für Schritt die Amplifikation und Identifizierung von unbekannten DNA-flankierenden exemplarisch zu identifizieren Lentivirusvektor IST. Oligonukleotide in dem Protokoll verwendet wird, sind in Tabelle 1 aufgeführt. Heraus DNA oder cDNA von jeder Quelle kann als DNA-Matrize für LAM-PCR und nrLAM-PCR verwendet werden.

Protokoll

1. Vorbereitung der Linker-Kassetten (LC)

  1. Mischungs 40 ul LC1 Oligonukleotid (Tabelle 1), 40 ul Oligonukleotid LC2 (Tabelle 1, mit der richtigen Restriktionsenzym Hang), 110 &mgr; l Tris-HCl (100 mM, pH 7,5) und 10 ul 250 mM MgCl 2.
  2. Inkubation bei 95 ° C für 5min und ließ die Reaktion abkühlen langsam auf Raumtemperatur. In 300 ul H 2 O und konzentrieren dsLinker-DNA auf einem Zentrifugation Filter. In 80 ul H 2 O zu den aliquoten Eluat und 10 ul bereit Linker-Kassette in 0,2 PCR-Röhrchen.

2. Vorverstärkung der Vektor-Genom-Junctions

  1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
    1. Bestimmen Konzentration der DNA-Proben. Pipette x ul (1-1000 ng für LAM/100-1, 000 ng für nrLAM) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen der DNA sollte in jeder Probe und in der ran gleich seinge von 0,5 bis 25 &mgr;.
    2. Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 2 beschrieben Mix (50 - x). &mgr; L Mastermix mit jeder DNA-Probe in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
  2. Preamplify Vektorgenom Kreuzungen mit PCR-Bedingungen in Tabelle 2 veranschaulicht. Nach Abschluss der PCR mit 0,5 ul Taq-Polymerase zu jedem PCR-Röhrchen und erneut PCR-Programm. PCR-Produkte können bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden

3. Magnetische Trennung von PCR-Produkt

  1. Vorbereitung der Magnetic Beads
    1. Je 20 ul (200 ug) von Streptavidin-beschichteten magnetischen Kügelchen in ein 1,5-ml-Röhrchen und setzen für 1 min auf dem Magnet Partikelabscheider (MPS) bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen.
    2. Röhrchen aus MPS und resuspendieren magnetischen Kügelchen in 40 ul PSB / 0,1% BSA (pH 7,5). Expose MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal.
    3. Wash Perlen witen 20 ul 3 M LiCl-Lösung (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) aussetzen MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren Perlen in 50 ul 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
  2. Mix gesamten PCR-Reaktion aus Schritt 2.2 mit 50 ul hergestellten magnetischen Kügelchen. Inkubieren auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) mindestens 2 h bei Raumtemperatur. Dieser Schritt ermöglicht die Bindung von biotinylierten PCR-Produkt zu beschichteten Kügelchen (DNA-Bead-Komplex) Streptavidin. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
  3. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min bei Raumtemperatur entfernen Überstand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Sofort mit Schritt 4 für LAM oder Schritt 5 für nrLAM fortzufahren.

4. LAM-Verfahren

  1. Doppelstrang-DNA (dsDNA) Synthese (LAM nur)
    1. Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3,3 bis 1 min und dis MPSKartenstand. Hinzufügen 8,25 ul H &sub2; O, 1 &mgr; l 10 × Puffer Hexanukleotid, 0,25 ul dNTPs (10 mM) und 0,5 ul (2 U) Klenow-Polymerase. Inkubieren bei 37 ° C für 1 Stunde.
    2. Hinzufügen von 90 &mgr; l H 2 O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O.
  2. Beschränkung Digest
    1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Add 8,5 ul H &sub2; O, 1 ul 10x Restriktionsenzym-Puffer und 0,5 ul Restriktionsenzym inkubieren Reaktion für 1 Stunde. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
      HINWEIS: Inkubieren Reaktion bei der Temperatur, die vom Hersteller des Restriktionsenzyms empfohlen. Stellen Sie sicher, dass es innerhalb von nicht vorhanden oder nach der Primer-Bindungsstelle für die Vorverstärkung in der DNA von Interesse verwendet Restriktionsstelle. Für die Wahl des geeigneten Restriktionsenzymen / Restriktionsenzym-Kombinationen beziehen sich auf neun.
  3. Ligation von ds Linker (LK)
    1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Mit 5 &mgr; l H 2 O, 1 ul 10x Fastlink-Puffer, 1 ul ATP (10 mM), 2 &mgr; l Linker Kassette aus Schritt 1.2 und 1 ul Fast-Link-DNA-Ligase (2 U / ul). Inkubieren bei Raumtemperatur für 5 min. Wiederholen Sie Schritt 4.1.2.
  4. Denaturierung von Synthesizer-dsDNA
    1. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen. Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 5 ul 0,1 N NaOH. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler.
    2. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und sammeln vorverstärktes Vektor-Genom-Übergang Überstand in neue 1,5 ml Röhrchen mit. Sofort mit Schritt 6 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C

5. NrLAM-Verfahren

  1. Ligation von Einzelstrang-Linker (SSLC) (nrLAM nur)
    1. Expose DNA-Bead-Komplex aus Schritt 3.3 MPSfür 1 min und Ablagestand. Add 6,5 ul H &sub2; O, CircLigase 1 ul 10x Reaktionspuffer, 0,5 &mgr; l MnCl 2 (50 mM), 0,5 ul ATP (1 mM), 1 ul ssLinker Oligonukleotid und 0,5 ul CircLigase (100 U / ul). Inkubieren bei 60 ° C für 1 Stunde.
    2. Hinzufügen von 90 &mgr; l H 2 O und aussetzen MPS für 1 min. Überstand verwerfen und waschen DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Wieder zu MPS für 1 min, Ablagestand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 10 ul H 2 O. aussetzen

6. Exponential Amplification ich

  1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
    1. Pipette 2 ul Template-DNA (aus Schritt 4.4.2 (LAM) oder 5.1.2 (nrLAM)) in ein 0,2 ml PCR-Röhrchen.
    2. Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 3 beschrieben. Hinzufügen 48 ul der Master-Mix zu jeder Probe aus Schritt 6.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge durch PCR conditions in Tabelle 3 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden,

7. Magnetische Trennung von PCR-Produkt

  1. Bereiten magnetischen Kügelchen wie in den Schritten 3.1.1 Beispiel - 3.1.3. Resuspendieren Perlen in 20 ul (LAM) oder 50 &mgr; l (für nrLAM) von 6 M LiCl-Lösung (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mischungs 20 ul (LAM) oder 50 ul (nrLAM) der PCR-Reaktion aus Schritt 6.1.2 mit vorbereiteten magnetischen Kügelchen (Schritt 7.1) und Inkubation auf einem Horizontalschüttler (300 rpm) für 2 h bei Raumtemperatur. DNA-Bead-Komplex auf dem Schüttler über Nacht inkubiert und bei 4 ° C für 4 Tage aufbewahrt werden.
  2. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min, entfernen Stand und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 100 ul H 2 O. Expose DNA-Bead komplex MPS für 1 min und Überstand verwerfen.
  3. Resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 20 ul (LAM) oder 5 ul (nrLAM) 0,1 N NaOH. IncuDebatte für 10 Minuten bei Raumtemperatur auf einem Horizontalschüttler, aussetzen MPS für 1 min und sammeln amplifizierte DNA-haltige Überstand in neues 1,5-ml-Tube. Sofort mit Schritt 8.1 oder speichern Stand gehen bei -20 ° C

8. Exponential Amplification II

  1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
    1. Pipette 2 &mgr; l Matrizen-DNA (aus Stufe 7.3) in 0,2 ml PCR-Röhrchen.
    2. Vorbereitung PCR Master Mix, wie in Tabelle 4 beschrieben. In 48 &mgr; l Mastermix zu jeder Probe aus Schritt 8.1.1 und verstärken Vektorgenom Gänge von PCR-Bedingungen in Tabelle 4 veranschaulicht. PCR-Produkte bei 4 ° C für bis zu 4 gespeichert werden, Tage-oder langfristig bei -20 ° C
  2. Zu visualisieren (nr) LAM-PCR-Produkte, Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 8.1.2 auf einem 2% Agarosegel. Wenn Banden sichtbar sind, zu analysieren 10 ul der LAM-PCR-Produkt auf hochauflösenden Gel. ACHTUNG: Ethidium Bromid ist mutagen. Arbeiten Sie sehr sorgfältig und immer eine geeignete Schutzhandschuhe.

9. Vorbereitung für die Hochdurchsatz-Sequenzierung

  1. Reinigung von (nr) LAM-PCR-Produkte
    1. Mischen Sie 40 ul PCR-Produkt von Schritt 8.1.2 mit 44 ul der Raumtemperatur AMPure XP Magnetic Beads. Inkubiere 5 min bei Raumtemperatur ausgesetzt werden, um MPS für weitere 2 min.
    2. Überstand verwerfen und zweimal waschen mit 200 ul 70% EtOH auf den MPS.
    3. Überstand verwerfen und resuspendieren DNA-Bead-Komplex in 30 ul H 2 O. 1 min inkubieren und Überstand in frische 0,2 ml-Tube. Bestimmen Konzentration von DNA gereinigt.
  2. Fusionprimer PCR-Sequenzierung, um spezifische Adapter hinzufügen.
    1. Für jede zu analysierende Probe bereiten ein 50 ul PCR-Reaktion.
    2. Pipette x ul (40 ng) von DNA in eine 0,2 ml PCR-Röhrchen. Volumen von DNA sollte in jeder Probe und in dem Bereich von 0,5 bis 25 &mgr; gleich sein.
    3. Bereiten PCR Master Mix, wie in Tabelle 5 beschrieben hinzufügen (50 - x). Ul Master Mix zu jeder Probe aus Schritt 9.2.2 und Sequenzierung einzuführen Adapter (nr) LAM-PCR-Produkte von PCR-Bedingungen in Tabelle 5 PCR-Produkte veranschaulicht. bei 4 ° C für bis zu 4 Tage oder langfristig bei -20 º C gelagert werden
    4. Um Fusionprimer-PCR-Produkte sichtbar Last 10 ul des PCR-Produkts aus Schritt 9.2.3 auf einem 2% Agarosegel. Reinige verbleibenden PCR-Produkt wie in den Schritten 9.1.1 - 9.1.3. Analysieren 1 ul gereinigte PCR-Produkt aus Schritt 9.4 auf einem automatisierten Hochauflösung Elektrophorese-Gerät genau zu quantifizieren, Konzentration und Fragmentgröße von Fusionprimer-PCR-Produkte.

Ergebnisse

LAM-PCR-Amplifikation resultiert in der Vektor-Genom-Übergänge mit einer definierten Fragmentgröße für jede Kreuzung. Die Größe der einzelnen PCR-Fragmente hängt von der Entfernung zwischen dem Ort der bekannten DNA in das Genom und dem nächsten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle. Dies ermöglicht die Visualisierung der Vielfalt der amplifizierten Gänge in analysierten Proben durch Gelelektrophorese, zB. Wenn nur einzelne (monoklonal), mehrere (oligoklonale) oder mehrere (polyklonal) Banden auf dem Ge...

Diskussion

Die LAM-PCR-Technik ermöglicht die Identifizierung von unbekannten DNA-Sequenzen, die eine bekannte DNA-Region flankieren. Wegen der hohen Empfindlichkeit von Vorverstärkung der Verbindungen mit spezifischen Primern hybridisiert in der bekannten DNA-Sequenz ergeben, ist es möglich, zu verstärken und zu detektieren, auch seltene Kreuzungen auf Einzelzellebene. Gegenteil, in einem polyklonalen Situation LAM-PCR ist in der Lage, Tausende von verschiedenen Verbindungen in einer einzigen Reaktion zu verstärken.

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Danksagungen

Funding was provided by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, grant of the Tumor Center Heidelberg/Mannheim), by the Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), by the VIth + VIIth Framework Programs of the European Commission (CONSERT, CLINIGENE and PERSIST). We thank Ina Kutschera for demonstrating the protocol technique in the video.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Taq DNA PolymeraseGenaxxon Bioscience GmbHM3001.5000Alternative Taq Polymerases may be used
PCR BufferQiagen201203Use of this buffer is recommended
dNTP-MixtureGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)MWG BiotechHPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860.1% wt/vol BSA
6 M LiClRoth3739.110 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5USB Corporation 22637or any other supplier
EDTAApplichemA1103,0250or any other supplier
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
Hexanucleotide mixtureRoche Diagnostics11277081001
Restriction endonucleaseNEBor any other supplier
Fast-Link DNA ligation kitEpicentre BiotechnologiesLK11025
CircLigase ssDNA Ligase KitEpicentre BiotechnologiesCL4111K
NaOHSigma-Aldrich72068or any other supplier
Agarose LERoche Diagnostics11685660001or any other supplier
TBE bufferAmresco0658or any other supplier
Ethidium bromideApplichemA2273,0005Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA LadderInvitrogen15628-050or any other DNA ladder
20 mM NaClSigma-Aldrich71393-1Lor any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator Life TechnologiesK158501for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle SeparatorLife TechnologiesK158696for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membraneMilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515or other electrophoresis system 
TProfessional 96Biometra050-551or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basicIKA2980200or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 mlBiozym Scientific GmbH711082or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubesEppendorf12682or other 1.5 ml tubes
Gel documentation systemPeqLabor any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometerThermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 precast gelElchrom Scientific3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000 Elchrom Scientific2001E
2100 Electrophoresis BioanalyzerAgilent TechnologiesG2939AA

Referenzen

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