Linear Amplificazione Mediata PCR - Localizzazione di Genetica Elementi e caratterizzazione di Unknown Aggirare DNA

Riepilogo

Linear-amplificazione mediata (LAM)-PCR è un metodo sviluppato per identificare le posizioni esatte di integrare vettori virali nel genoma. La tecnica si è evoluta per essere il metodo superiore per studiare la dinamica clonali nei pazienti di terapia genica, biosicurezza delle tecnologie innovative vettore, la diversità delle cellule T, modelli di cellule staminali del cancro, ecc

Abstract

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introduzione

Linear-amplificazione mediata PCR (LAM-PCR) permette di identificare e caratterizzare Sconosciuto DNA fiancheggiante adiacente DNA nota di qualsiasi origine. Più specificamente, LAM-PCR è stato sviluppato per localizzare siti di integrazione vettore virale (IS) all'interno del genoma ospite ^1,2. Elementi genetici come retrovirus o trasposoni integrando il loro genoma nel genoma dell'ospite in un (semi-) modo casuale ^3-6. In molti casi è determinante conoscere esattamente la posizione in cui questi vettori integrati. LAM-PCR ha dimostrato di essere superiore a tecniche alternative come la legatura mediata PCR ⁷ e le sue varianti o inversa PCR ^8. La sensibilità e la robustezza di questo metodo nasce dalla preamplificazione iniziale delle giunzioni vettore genoma e selezione magnetica dei prodotti della PCR amplificati. Come i metodi alternativi citati, LAM-PCR si basa sull'utilizzo di enzimi di restrizione, presentare una deviazione in capacità di recupero IS ^9-11. Così,solo un sottoinsieme del repertorio IS (il integrome) può essere rilevata in una reazione. Questa polarizzazione è minimizzato dall'analisi parallela di un dato campione utilizzando combinazioni ottimali di enzimi di restrizione ^9. Recentemente, una variante della tecnologia definito non limitativo LAM-PCR (nrLAM-PCR) è stato sviluppato che aggira l'uso di enzimi di restrizione e permette imparziale analisi dell'intero genoma di un campione in una singola reazione ^9,12.

In passato, LAM-PCR è stato utilizzato per identificare il retrovirale causale dà luogo alla leucemia in alcuni pazienti in sperimentazioni cliniche di terapia genica ^13-15. Da allora, LAM-PCR è stato adattato per identificare IS da altri vettori di integrazione (vettori lentivirali, trasposoni) e anche per identificare i modelli di integrazione delle passivamente integrazione di vettori come vettori adeno-associati (AAV) o vettori lentivirali integrasi-difettoso (IDLV) ^{16 -21.} Applicazioni della LAM-PCR sono molto diffusa: tradizionalely, la tecnica è ampiamente utilizzata per studiare la composizione clonale delle cellule geneticamente modificate in pazienti che hanno subito la terapia genica o per valutare la biosicurezza dei sistemi vettore nuovi disfacendo il loro comportamento integrazione ^15,16,22-24. Recentemente, LAM-PCR ha permesso determinare la specificità e l'attività off-target di nucleasi firmati da un IDLV saggio di cattura ^25.

Inoltre, LAM-PCR permette di seguire facilmente il destino di una cellula transdotte nel tempo in un organismo. Questo permette di identificare proto-oncogeni e geni oncosoppressori e studiare ematopoiesi o staminali cancerose biologia cellulare ^26-28. Ultimo ma non meno importante, LAM-PCR è stato adattato per studiare diversità recettore delle cellule T nell'uomo e ²⁹ (dati non pubblicati).

La potenza intrinseca della tecnologia è rafforzata collegando il metodo di tecnologie di sequenziamento profonde che permettono caratterizzare milioni di Sconosciuto accompagnamento DNA a singolo nucleotide reSolution nei genomi interi. Nel seguente protocollo, si descrive passo per passo l'amplificazione e l'identificazione di accompagnamento DNA sconosciuto esemplare di identificare vettori lentivirali IS. Gli oligonucleotidi utilizzati nel protocollo sono elencati nella Tabella 1. Estratto il DNA o cDNA di qualsiasi sorgente possono essere usati come stampo di DNA per LAM-PCR e nrLAM-PCR.

Protocollo

1. Preparazione dei linker Cassette (LC)

1. Mescolare 40 ml di LC1 oligonucleotide (Tabella 1), 40 ml di LC2 oligonucleotide (Tabella 1, con l'enzima di restrizione adeguato sbalzo), 110 ml di Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), e 10 microlitri 250 mM MgCl _2.
2. Incubare a 95 ° C per 5 min e lasciare che la reazione raffreddare lentamente a temperatura ambiente. Aggiungere 300 ml H ₂ O e concentrare dsLinker-DNA su un filtro centrifugazione. Aggiungere 80 ml ​​H ₂ O per l'eluato e aliquote di 10 ml di cassette linker pronti a 0.2 provette per PCR.

2. Preamplificazione del vettore Genoma giunzioni

1. Per ogni campione da analizzare preparare un 50 microlitri di reazione PCR.
   1. Determinare la concentrazione dei campioni di DNA. Dispensare x ml (1-1,000 ng per LAM/100-1, 000 ng per nrLAM) di DNA in una provetta da 0,2 ml PCR. Volume di DNA deve essere uguale in ciascun campione e nel RNAge da 0,5 a 25 pl.
   2. Preparare PCR master mix, come descritto nella tabella 2 Mix (50 - x). Microlitri della master mix con ciascun campione di DNA in 0,2 ml provette PCR.
2. Preamplificare vettore giunzioni genomiche utilizzando condizioni di PCR esemplificati nella Tabella 2. Dopo il completamento della PCR aggiungono 0,5 microlitri Taq Polymerase a ciascuna provetta PCR e rieseguire programma PCR. I prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° C per 4 giorni o lungo termine a -20 ° C.

3. Separazione magnetica della PCR prodotto

1. Preparazione di Magnetic Beads
   1. Pipettare 20 ml (200 mg) di streptavidina rivestite con perline magnetiche in una provetta da 1,5 ml ed esporre per 1 min sul separatore particella magnetica (MPS) a temperatura ambiente. Scartare il surnatante.
   2. Rimuovere il tubo da MPS e risospendere sfere magnetiche in 40 microlitri PSB / 0,1% di BSA (pH 7.5). Esporre a MPS per 1 minuto e scartare il surnatante. Ripetere questa operazione una sola volta.
   3. Wash Perle with 20 ml di soluzione 3 M LiCl (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA) esporre a MPS per 1 minuto e scartare il surnatante. Risospendere le sfere in 50 ml di soluzione 6 M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA).
2. Mescolare intero reazione di PCR dal punto 2.2 con 50 ml di sfere magnetiche preparate. Incubare su un agitatore orizzontale (300 rpm) per almeno 2 ore a temperatura ambiente. Questo passaggio consente legame di biotinilato prodotto di PCR di streptavidina perle rivestite (complessi DNA-Bead). DNA complesso tallone può essere incubata nel shaker notte o conservato a 4 ° C per 4 giorni.
3. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 minuto a temperatura ambiente, rimuovere il surnatante e risospendere complesso DNA-Bead in 100 ml H ₂ O. Procedere immediatamente con la fase 4 per LAM o il punto 5 per nrLAM.

4. LAM-Procedure

1. DNA a doppio filamento (dsDNA) Sintesi (solo LAM)
   1. Esporre complesso DNA-Bead dal punto 3.3 a MPS per 1 min e dissurnatante carta. Aggiungere 8.25 ml di H ₂ O, 1 ml di buffer 10x hexanucleotide, 0,25 dNTP microlitri (10 mm) e 0,5 microlitri (2 U) Klenow polimerasi. Incubare a 37 ° C per 1 ora.
   2. Aggiungere 90 ml di H ₂ O e esporre a MPS per 1 min. Gettare il surnatante e risospendere complesso DNA-Bead in 100 ml H ₂ O.
2. Limitazione Digest
   1. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 minuto e scartare il surnatante. Aggiungere 8,5 ml H ₂ O, 1 microlitri tampone 10x restrizione enzimatica e 0,5 ml di enzima di restrizione e incubare la reazione per 1 ora. Ripetere passo 4.1.2.
      NOTA: Incubare la reazione alla temperatura raccomandata dal produttore dell'enzima di restrizione. Assicurarsi che non vi è alcun sito di restrizione presenti all'interno oa valle del sito di legame di primer utilizzati per preamplificazione nel DNA di interesse. Per la scelta di opportune combinazioni di enzimi di restrizione / enzimi di restrizione riferimento a ^9.
3. Legatura dei ds Linker (LK)
   1. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 minuto e scartare il surnatante. Aggiungere 5 ml H ₂ O, 1 ml di buffer 10x FastLink, 1 ml ATP (10 mm), 2 microlitri Linker cassetta dal punto 1.2, e 1 ml veloce-Link DNA Ligase (2 U / mL). Incubare a temperatura ambiente per 5 min. Ripetere passo 4.1.2.
4. Denaturazione delle sintetizzato dsDNA
   1. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 minuto e scartare il surnatante. Complesso Risospendere DNA-Bead in 5 ml di 0,1 N NaOH. Incubare 5 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orizzontale camera.
   2. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 min e raccogliere preamplificato svincolo vettore genoma contenente surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Procedere immediatamente con la fase 6 o conservare il surnatante a -20 ° C.

5. NrLAM-Procedure

1. Legatura di un singolo filamento linker (SSLC) (nrLAM solo)
   1. Esporre complesso DNA-Bead dal punto 3.3 a MPSper 1 min e scartare il surnatante. Aggiungere 6,5 microlitri H ₂ O, 1 ml CircLigase 10X Reaction Buffer, 0,5 microlitri MnCl ₂ (50 mm), 0,5 microlitri ATP (1 mm), 1 ml ssLinker oligonucleotide e 0,5 microlitri CircLigase (100 U / mL). Incubare a 60 ° C per 1 ora.
   2. Aggiungere 90 ml di H ₂ O e esporre a MPS per 1 min. Gettare il surnatante e lavare complesso DNA-Bead in 100 ml H ₂ O. Ancora una volta esporre a MPS per 1 min, il surnatante scarti e risospendere complesso DNA-Bead in 10 microlitri H ₂ O.

6. Esponenziale Amplificazione I

1. Per ogni campione da analizzare preparare un 50 microlitri di reazione PCR.
   1. Pipettare 2 Template microlitri di DNA (dal punto 4.4.2 (LAM) o 5.1.2 (nrLAM)) in una provetta da 0,2 ml PCR.
   2. Preparare PCR master mix come descritto nella Tabella 3. Aggiungere 48 ml di master mix per ogni campione dal punto 6.1.1 e amplificare vettoriali genoma giunzioni mediante PCR conditions esemplificati nella Tabella 3. prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° C per 4 giorni o lungo termine a -20 ° C.

7. Separazione magnetica della PCR prodotto

1. Preparare sfere magnetiche come esemplificato nei passaggi 3.1.1 - 3.1.3. Risospendere le sfere in 20 microlitri (per LAM) o 50 ml (per nrLAM) del 6 soluzione M LiCl (6 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA). Mescolare 20 microlitri (LAM) o 50 microlitri (nrLAM) della reazione PCR dal punto 6.1.2 con perline magnetiche preparate (punto 7.1) e incubare su un agitatore orizzontale (300 rpm) per 2 ore a temperatura ambiente. DNA complesso tallone può essere incubata nel shaker notte o conservato a 4 ° C per 4 giorni.
2. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 min, rimuovere il surnatante e risospendere complesso DNA-Bead in 100 ml H ₂ O. Esporre complesso DNA-Bead di MPS per 1 minuto e scartare il surnatante.
3. Risospendere complesso DNA-Bead in 20 microlitri (LAM) o 5 microlitri (nrLAM) 0,1 N NaOH. Incubate per 10 minuti a temperatura ambiente su un agitatore orizzontale camera, esporre a MPS per 1 minuto e raccogliere amplificato DNA contenente surnatante in una nuova provetta da 1,5 ml. Procedere immediatamente con la fase 8.1 o conservare il surnatante a -20 ° C.

8. Esponenziale Amplificazione II

1. Per ogni campione da analizzare preparare un 50 microlitri di reazione PCR.
   1. Pipettare 2 Template microlitri DNA (dal punto 7.3) in una provetta da 0,2 ml PCR.
   2. Preparare PCR master mix come descritto nella Tabella 4. Aggiungere 48 ml di master mix per ogni campione dal punto 8.1.1 e amplificare vettoriali genoma giunzioni da condizioni di PCR esemplificati nella Tabella 4. Prodotti di PCR possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 4 giorni o lungo termine a -20 ° C.
2. Per visualizzare (nr) LAM-PCR prodotti, carico 10 microlitri del prodotto di PCR dal punto 8.1.2 su un gel di agarosio al 2%. Se le strisce sono visibili, analizzare 10 ml di prodotto LAM-PCR su gel ad alta risoluzione. ATTENZIONE: Ethidium bromuro è mutageno. Lavorare con molta attenzione e indossare sempre guanti appropriati.

9. Preparazione High-throughput sequencing

1. Purificazione di (nr) prodotti LAM-PCR
   1. Mescolare 40 microlitri PCR-prodotto dal punto 8.1.2 con 44 ml di temperatura ambiente AMPure XP sfere magnetiche. Incubare 5 min a temperatura ambiente e esporre a MPS per ulteriori 2 min.
   2. Gettare il surnatante e lavare due volte con 200 microlitri 70% EtOH sulle MPS.
   3. Gettare il surnatante e risospendere complesso DNA-Bead in 30 microlitri H ₂ O. Incubare 1 min e trasferimento surnatante in fiala 0,2 ml. Determinare la concentrazione di DNA purificato.
2. Fusionprimer PCR per aggiungere il sequenziamento di adattatori specifici.
   1. Per ogni campione da analizzare preparare un 50 microlitri di reazione PCR.
   2. Pipettare x microlitri (40 ng) di DNA in una provetta da 0,2 ml PCR. Volume di DNA deve essere uguale in ciascun campione e nella gamma da 0,5 a 25 pl.
   3. Preparare PCR master mix, come descritto nella tabella 5 Aggiungi (50 - x). Microlitri di Master Mix per ogni campione dal punto 9.2.2 e di introdurre adattatori Sequencing a (nr) LAM-PCR prodotti da condizioni di PCR esemplificati nella Tabella 5 prodotti di PCR. possono essere conservati a 4 ° C per un massimo di 4 giorni o lungo termine a -20 ° C.
   4. Per visualizzare Fusionprimer-PCR prodotti carico 10 ml di prodotto di PCR a partire dal punto 9.2.3 su un gel di agarosio al 2%. Purificare rimanente prodotto di PCR come descritto ai punti 9.1.1 - 9.1.3. Analizzare 1 ml di prodotto di PCR purificato dal passo 9.4 su un dispositivo per elettroforesi ad alta risoluzione automatizzata quantificare accuratamente concentrazione e frammento dimensioni dei prodotti Fusionprimer-PCR.

Risultati

LAM-PCR si traduce in amplificazione del vettore genoma giunzioni con una dimensione frammento definito per ogni incrocio. La dimensione dei singoli frammenti di PCR dipende dalla distanza tra la posizione del DNA noto nel genoma e il sito di riconoscimento dell'enzima di restrizione più vicino. Questo permette di visualizzare la diversità delle giunzioni amplificate in campioni analizzati mediante elettroforesi su gel, per es., Se sono presenti sul gel unico singolo (monoclonali), vari (oligoclonali), o ...

Discussione

La tecnica LAM-PCR permette di identificare sconosciuti sequenze di DNA che fiancheggiano una regione del DNA noto. A causa della elevata sensibilità risultante dalla preamplificazione delle giunzioni con primers specifici ibridazione nella sequenza di DNA nota, è possibile amplificare e rilevare anche giunzioni rare fino al livello di singola cellula. Contrario, in una situazione policlonale LAM-PCR è in grado di amplificare migliaia di differenti giunzioni in una singola reazione.

Tutta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerases may be used
PCR Buffer	Qiagen	201203	Use of this buffer is recommended
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)	MWG Biotech		HPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	or any other supplier
EDTA	Applichem	A1103,0250	or any other supplier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mixture	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		or any other supplier
Fast-Link DNA ligation kit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	or any other supplier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	or any other supplier
TBE buffer	Amresco	0658	or any other supplier
Ethidium bromide	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158696	for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	or other electrophoresis system
TProfessional 96	Biometra	050-551	or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubes	Eppendorf	12682	or other 1.5 ml tubes
Gel documentation system	PeqLab		or any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 precast gel	Elchrom Scientific	3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA