Linear Amplificação Mediada por PCR - Localização de elementos genéticos e Caracterização de Unknown Flanquear DNA

Resumo

Linear-amplificação mediada (LAM)-PCR é um método desenvolvido para identificar as posições exactas dos vectores de integração no genoma viral. A técnica evoluiu para ser o método superior para estudar a dinâmica clonais em pacientes de terapia genética, biossegurança de tecnologias inovadoras de vetores, a diversidade de células T, modelos de células-tronco do câncer, etc

Resumo

Linear-amplification mediated PCR (LAM-PCR) has been developed to study hematopoiesis in gene corrected cells of patients treated by gene therapy with integrating vector systems. Due to the stable integration of retroviral vectors, integration sites can be used to study the clonal fate of individual cells and their progeny. LAM- PCR for the first time provided evidence that leukemia in gene therapy treated patients originated from provirus induced overexpression of a neighboring proto-oncogene. The high sensitivity and specificity of LAM-PCR compared to existing methods like inverse PCR and ligation mediated (LM)-PCR is achieved by an initial preamplification step (linear PCR of 100 cycles) using biotinylated vector specific primers which allow subsequent reaction steps to be carried out on solid phase (magnetic beads). LAM-PCR is currently the most sensitive method available to identify unknown DNA which is located in the proximity of known DNA. Recently, a variant of LAM-PCR has been developed that circumvents restriction digest thus abrogating retrieval bias of integration sites and enables a comprehensive analysis of provirus locations in host genomes. The following protocol explains step-by-step the amplification of both 3’- and 5’- sequences adjacent to the integrated lentiviral vector.

Introdução

Linear-amplificação mediada por PCR (LAM-PCR) permite a identificação e caracterização de DNA flanqueando desconhecida adjacente ao ADN conhecida de qualquer origem. Mais especificamente, a LAM-PCR foi desenvolvido para localizar locais de integração de vectores virais (IS) dentro do genoma do hospedeiro ^{de 1,2.} Os elementos genéticos como retrovírus ou transposons integrar o seu genoma no genoma do hospedeiro em uma (semi-) forma aleatória ^3-6. Em muitos casos, é decisivo saber exactamente a posição em que esses vectores integrados. LAM-PCR tem sido provado ser superior a técnicas alternativas, como mediada por ligadura PCR ⁷ e suas variantes ou PCR inversa ^8. A sensibilidade e robustez deste método surge a partir da pré-amplificação inicial das junções vector de genoma e selecção magnética de produtos de PCR amplificados. Como os métodos alternativos mencionados, LAM-PCR baseia-se na utilização de enzimas de restrição, a introdução de um preconceito na capacidade de recuperação dos SI ^9-11. Assim,apenas um subconjunto do repertório é (a integrome) pode ser detectada numa reacção. Esta distorção é minimizada por meio da análise paralela de uma determinada amostra, utilizando as melhores combinações de enzimas de restrição de ^9. Recentemente, uma variante da tecnologia denominada não-restritivo LAM-PCR (PCR-nrLAM) tem sido desenvolvida que contorna o uso de enzimas de restrição e permite a análise de todo o genoma imparcial de uma amostra numa única reacção de ^9,12.

No passado, a LAM-PCR foi utilizada para identificar o retrovírus causador é o que dá origem a leucemia em alguns pacientes, em ensaios clínicos de terapia génica ^13-15. Desde então, a LAM-PCR foi adaptado para identificar é de outros vetores de integração (vetores lentivirais, transposons) e também para identificar padrões de integração de integrar passivamente vetores como vetores adeno-associados (AAV) ou lentivirais integrase-defeituoso (IDLV) ^{16 -21.} Aplicações da LAM-PCR são ampla: tradicionally, a técnica é utilizada para estudar a composição clonal de células de genes modificados em pacientes que foram submetidos a terapia de gene, ou para avaliar a segurança biológica de sistemas de vectores novos por desvendar o seu comportamento integração ^15,16,22-24. Recentemente, a LAM-PCR permitiu determinar especificidade e atividade fora do alvo de nucleases de grife por um ensaio prendendo IDLV ^25.

Além disso, a LAM-PCR permite seguir facilmente o destino de uma célula transduzida ao longo do tempo em um organismo. Isso permite identificar proto-oncogenes, bem como genes supressores de tumores e também para estudar hematopoiese ou caule câncer biologia celular ^26-28. Por último, mas não menos importante, a LAM-PCR foi adaptado para estudar a diversidade de receptores de células T em humanos ⁽²⁹ e dados não publicados).

O poder intrínseca da tecnologia é reforçada pela ligação entre o método de tecnologias de seqüenciamento de profundidade que permitem caracterizar milhões de desconhecido flanqueando DNA com um único nucleotídeo reSolution em genomas inteiros. No seguinte protocolo, descrevemos passo a passo a amplificação e identificação de DNA flanqueando desconhecido exemplarmente para identificar lentiviral vetor IS. Os oligonucleótidos utilizados no protocolo estão listadas na Tabela 1. Extraído DNA ou cDNA de qualquer fonte pode ser utilizado como modelo de ADN para a LAM-PCR e nrLAM-PCR.

Protocolo

1. Preparação de Linker Cassetes (LC)

1. Misturar 40 ul de oligonucleótido LC1 (Tabela 1), 40 ul de oligonucleótido LC2 (Tabela 1, com a enzima de restrição adequada saliência), 110 ul de Tris-HCl (100 mM, pH 7,5), e 10 ul de 250 mM _MgCl2.
2. Incubar a 95 ° C durante 5 minutos e deixar a reacção arrefecer lentamente até à temperatura ambiente. Adicionar 300 ul de _H2O e concentrar dsLinker-ADN num filtro de centrifugação. Adicionar 80 ul de H ₂ O para o produto de eluição e uma alíquota de 10 ul de cassete de ligação preparados em tubos de 0,2 PCR.

2. Pré-amplificação do genoma do vetor Junções

1. Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
   1. Determinar a concentração de amostras de DNA. Pipeta x ul (1-1,000 ng para LAM/100-1, 000 ng para nrLAM) de DNA para um tubo de PCR de 0,2 ml. Volume de ADN deve ser igual em cada uma das amostras e no range de 0,5 a 25 ul.
   2. Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 2 Mistura (50 - x). Ul da mistura principal em cada amostra de DNA em 0,2 ml de tubos de PCR.
2. Preamplify vector junções do genoma utilizando condições de PCR exemplificados na Tabela 2. Após conclusão da PCR adicionar 0,5 ul de Taq polimerase a cada tubo de PCR e PCR reprise programa. Os produtos da PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.

3. Separação Magnética de PCR Produto

1. Preparação de esferas magnéticas
   1. Pipetar 20 ul (200 ug) de pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina em um tubo de 1,5 ml e expor durante 1 min sobre o separador de partículas magnético (MPS), à temperatura ambiente. Elimine o sobrenadante.
   2. Retire os tubos de MPS e ressuspender as esferas magnéticas em 40 ul PSB / 0,1% de BSA (pH 7,5). Expor a MPS por 1 min e descartar o sobrenadante. Repita este passo uma vez.
   3. Lavar contas wiº 20 ul de uma solução M de LiCl três (3 M LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM) para expor MPS durante 1 min e rejeitar o sobrenadante. Grânulos Ressuspender em 50 ul de solução 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM).
2. Misturar toda a reacção de PCR, a partir do passo 2.2 com 50 uL de pérolas magnéticas preparadas. Incubar num agitador horizontal (300 rpm), pelo menos durante 2 horas à temperatura ambiente. Este passo permite a ligação do produto de PCR biotinilado com estreptavidina (esferas revestidas com complexos de ADN-grânulo). Complexo de cordão de ADN pode ser incubado num agitador durante a noite ou armazenado a 4 ° C durante até 4 dias.
3. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min, à temperatura ambiente, remover o sobrenadante e ressuspender complexo ADN-grânulo em 100 mL _de H ₂ O. Proceder imediatamente com a etapa 4 para LAM ou o passo 5 para nrLAM.

4. LAM-Processo

1. Duplo Strand DNA (dsDNA) Síntese (apenas LAM)
   1. Expor complexo ADN-grânulo a partir do passo 3.3 a MPS durante 1 min e dissobrenadante cartão. Adicionar 8,25 mL de _H2O, 1 ml de 10x tampão hexanucleotide, 0,25 ul de dNTPs (10 mM) e 0,5 mL (2 L), a polimerase de Klenow. Incubar a 37 ° C durante 1 hora.
   2. Adicionar 90 mL de H ₂ O e expor a MPS para 1 min. Elimine o sobrenadante e ressuspender complexo DNA-Bead em 100 mL _de H ₂ O.
2. Restrição Digest
   1. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 8,5 mL _{de H2O,} 1 ml de 10x tampão de enzima de restrição e 0,5 ul de enzima de restrição e reacção incubar durante 1 hora. Repita o passo 4.1.2.
      NOTA: Incubar reacção à temperatura recomendada pelo fabricante da enzima de restrição. Certifique-se de que não há nenhum local de restrição presente dentro ou a jusante do local de ligação do iniciador utilizado para a pré-amplificação do ADN de interesse. Para escolha de combinações de enzimas enzimas de restrição / restrição adequados referem-se a ^9.
3. Ligadura de ds Linker (LK)
   1. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Adicionar 5 mL _{de H2O,} 1 ml de 10x tampão FastLink, 1 ul de ATP (10 mM), 2 uL cassete Linker do passo 1.2, e 1 ul Fast-ligação do ADN ligase (2 U / mL). Incubar à temperatura ambiente durante 5 min. Repita o passo 4.1.2.
4. A desnaturação de Sintetizado dsDNA
   1. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante. Ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 5 mL de NaOH 0,1 N. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente num agitador horizontal.
   2. Expor complexo DNA-Talão a MPS por 1 min e recolher junção vetor do genoma pré-amplificado contendo sobrenadante em novo tubo de 1,5 ml. Proceder imediatamente com a etapa 6 ou loja sobrenadante a -20 ° C.

5. NrLAM-Procedimento

1. Ligadura de único vinculador encalhado (SSLC) (nrLAM apenas)
   1. Expor complexo DNA-Bead a partir do passo 3.3 para MPSpor 1 min e elimine o sobrenadante. Adicionar 6,5 mL _de H ₂ O, 1 ul CircLigase 10x tampão de reacção, 0,5 mL de _MnCl2 (50 mM), 0,5 ul de ATP (1 mM), 1 ul ssLinker oligonucleótido e 0,5 ul CircLigase (100 U / ul). Incubar a 60 ° C durante 1 hora.
   2. Adicionar 90 mL de H ₂ O e expor a MPS para 1 min. Elimine o sobrenadante e lava-se complexo de ADN-grânulo em 100 mL _de H ₂ O. Novamente expor a MPS para 1 min, o sobrenadante e ressuspender o descarte complexo ADN-grânulo em 10 mL _de H ₂ O.

6. Exponencial de amplificação I

1. Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
   1. Pipeta 2 ul de DNA molde (a partir do passo 4.4.2 (LAM) ou 5.1.2 (nrLAM)) dentro de um tubo de PCR de 0,2 ml.
   2. Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 3. Adicionar 48 ul de mistura principal para cada amostra a partir do passo 6.1.1 e amplificar vectores junções do genoma por PCR condins exemplificados na Tabela 3. produtos de PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.

7. Separação Magnética de PCR Produto

1. Prepare a esferas magnéticas como exemplificado nos passos 3.1.1 - 3.1.3. Grânulos Ressuspender em 20 ul (para LAM) ou 50 ul (para nrLAM) de solução 6 M de LiCl (6 M de LiCl, 10 mM Tris-HCl, EDTA 1 mM). Misturar 20 ul (LAM) ou 50 ul (nrLAM) de reacção de PCR a partir do passo 6.1.2 com esferas magnéticas preparadas (passo 7.1) e incuba-se num agitador horizontal (300 rpm) durante 2 horas à temperatura ambiente. Complexo de cordão de ADN pode ser incubado num agitador durante a noite ou armazenado a 4 ° C durante até 4 dias.
2. Expor complexo ADN-grânulo de MPS para 1 min, remover o sobrenadante e ressuspender complexo ADN-grânulo em 100 mL _de H ₂ O. Expor complexo ADN-Bead a MPS durante 1 min e descartar o sobrenadante.
3. Ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 20 ul (LAM) ou 5 mL (nrLAM) NaOH 0,1 N. INCUbate por 10 minutos à temperatura ambiente num agitador horizontal, expor a MPS para 1 min e coletar DNA contendo sobrenadante amplificado em novo tubo de 1,5 ml. Proceder de imediato com o passo 8.1 ou loja sobrenadante a -20 ° C.

8. Exponencial de amplificação II

1. Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
   1. Pipeta 2 ul de DNA molde (a partir do passo 7.3) a um tubo de PCR de 0,2 ml.
   2. Prepare PCR master mix como descrito na Tabela 4. Adicionar 48 ul de mistura principal para cada amostra a partir do passo 8.1.1 e amplificar vectores junções do genoma por condições de PCR exemplificados na Tabela 4. Produtos de PCR pode ser armazenada a 4 ° C durante até 4 dias ou a longo prazo a -20 ° C.
2. Para visualizar (nr) produtos LAM-PCR, carga de 10 ul do produto de PCR a partir do passo 8.1.2 em um gel de agarose a 2%. Se as bandas são visíveis, analisar 10 ul do produto a LAM-PCR em gel de alta resolução. CUIDADO: Etbrometo hidium é mutagênico. Trabalhe com muito cuidado e sempre usar luvas apropriadas.

9. Preparação de alta capacidade Seqüenciamento

1. Purificação de (nr) produtos LAM-PCR
   1. Misture 40 mL PCR-produto da etapa 8.1.2 com 44 l de temperatura ambiente AMPure XP esferas magnéticas. Incubar 5 minutos à temperatura ambiente e expor a MPS durante mais 2 min.
   2. Elimine o sobrenadante e lava-se duas vezes com 200 ul de EtOH a 70% sobre as MPS.
   3. Descartar o sobrenadante e ressuspender o complexo de ADN-grânulo em 30 mL _de H ₂ O. Incubar 1 min e transferência de sobrenadante para novo tubo de 0,2 ml. Determinar a concentração de ADN purificado.
2. Fusionprimer PCR para adicionar sequenciação adaptadores específicos.
   1. Para cada amostra a ser analisada preparar uma reacção de PCR de 50 uL.
   2. Pipeta x pi (40 ng) de ADN dentro de um tubo de PCR de 0,2 ml. Volume de ADN deve ser igual em cada uma das amostras e na gama de 0,5 a 25 ul.
   3. Prepare PCR master mix, conforme descrito na tabela 5 Adicionar (50 - x). ML de mistura de mestre para cada amostra a partir do passo 9.2.2 e introduzir adaptadores para Seqüenciamento (nr) produtos LAM-PCR por condições de PCR exemplificado na Tabela 5 produtos de PCR. pode ser armazenado a 4 ° C durante até 4 dias, ou a longo prazo a -20 ° C.
   4. Para visualizar os produtos de PCR Fusionprimer-carga de 10 ul do produto de PCR a partir do passo 9.2.3 em um gel de agarose a 2%. Purificar restante produto de PCR como descrito nos passos 9.1.1 - 9.1.3. Analise 1 ul do produto de PCR purificado a partir do passo 9.4 em um dispositivo de electroforese automatizada de alta resolução de quantificar com precisão a concentração eo fragmento de tamanho de produtos Fusionprimer-PCR.

Resultados

LAM-PCR resulta na amplificação do genoma do vetor cruzamentos com um tamanho de fragmento definido para cada junção. O tamanho dos fragmentos de PCR individuais depende da distância entre o local do ADN conhecido no genoma e o local de reconhecimento da enzima de restrição mais próximo. Isto permite visualizar a diversidade das junções amplificados em amostras analisadas por electroforese em gel, por exemplo. Se apenas simples (monoclonais), vários (oligoclonais), ou múltiplos (policlonais) as band...

Discussão

A técnica da LAM-PCR permite a identificação de sequências de ADN desconhecidas que flanqueiam uma região conhecida de ADN. Devido à elevada sensibilidade resultante do pré-amplificação dos cruzamentos com os iniciadores específicos de hibridação na sequência de ADN conhecida, que é possível amplificar e detectar até mesmo junções raras para baixo para o nível de uma única célula. Ao contrário, em uma situação policlonal LAM-PCR é capaz de amplificar milhares de junções diferentes numa única ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Taq DNA Polymerase	Genaxxon Bioscience GmbH	M3001.5000	Alternative Taq Polymerases may be used
PCR Buffer	Qiagen	201203	Use of this buffer is recommended
dNTP-Mixture	Genaxxon Bioscience GmbH	M3015.4020	or any other dNTPs
Oligonucleotides (Primers)	MWG Biotech		HPLC purified
Dynabeads M-280 Streptavidin	Invitrogen	11206D
PBS	Gibco	14190-086	0.1% wt/vol BSA
6 M LiCl	Roth	3739.1	10 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5	USB Corporation	22637	or any other supplier
EDTA	Applichem	A1103,0250	or any other supplier
Klenow Polymerase	Roche Diagnostics	10104523001
Hexanucleotide mixture	Roche Diagnostics	11277081001
Restriction endonuclease	NEB		or any other supplier
Fast-Link DNA ligation kit	Epicentre Biotechnologies	LK11025
CircLigase ssDNA Ligase Kit	Epicentre Biotechnologies	CL4111K
NaOH	Sigma-Aldrich	72068	or any other supplier
Agarose LE	Roche Diagnostics	11685660001	or any other supplier
TBE buffer	Amresco	0658	or any other supplier
Ethidium bromide	Applichem	A2273,0005	Ethidium bromide is mutagenic
100 bp DNA Ladder	Invitrogen	15628-050	or any other DNA ladder
20 mM NaCl	Sigma-Aldrich	71393-1L	or any other supplier
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158501	for use with 1.5 ml Tubes
Magna-Sep Magnetic Particle Separator	Life Technologies	K158696	for use with 96-well plates
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membrane	Millipore	UFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi S	PeqLab	40-1515	or other electrophoresis system
TProfessional 96	Biometra	050-551	or other Thermocycler for 96-well plates
Orbital shaker KS 260 basic	IKA	2980200	or other horizontal shaker
PCR softtubes 0.2 ml	Biozym Scientific GmbH	711082	or other 0.2 ml PCR tubes
1.5 ml tubes	Eppendorf	12682	or other 1.5 ml tubes
Gel documentation system	PeqLab		or any other gel documentation system
Nanodrop ND-1000 spectrophotometer	Thermo Scientific	ND-1000
Spreadex EL1200 precast gel	Elchrom Scientific	3497
Submerged gel electrophoresis apparatus SEA 2000	Elchrom Scientific	2001E
2100 Electrophoresis Bioanalyzer	Agilent Technologies	G2939AA