דגם Murine פרה של גרורות כבדית

Summary

מודל פרה קליני, עכברי של גרורות בכבד מבוצע באמצעות טכניקת הזרקת hemispleen.

Abstract

מודלים עכבריים רבים פותחו כדי ללמוד סרטן בבני אדם ולקדם את ההבנה של טיפול בסרטן ובפיתוח. כאן, מודל פרה קליני, עכברי לבלב גידול של גרורות בכבד באמצעות הזרקת hemispleen של תאים סרטניים syngeneic עכבריים לבלב מתואר. מודל זה מחקה רב של המצבים הקליניים בחולים עם מחלה גרורתית בכבד. עכברים לפתח באופן עקבי גרורות בכבד ומאפשר לחקירה של התהליך גרורתי, בדיקת טיפול ניסיוני, ומחקר אימונולוגיה גידול.

Introduction

אדנוקרצינומה ductal הלבלב (PDA) הוא הגורם המוביל הרביעי של מקרי מוות מסרטן הקשורים בארצות הברית ^1. ההישרדות של חמש שנים עבור חולים עם מחשב כף יד גרורתי היא 2-12 ^1%. למרות שטיפול כימותרפי אדג'וונטי וneoadjuvant לסרטן לבלב הוא יעיל יותר היום מאשר אי פעם, עדיין נותר צורך נואש בטיפולים חדשניים.

פיתוח תרופות חדשניות מחייב מודלים של בעלי חיים פרה קליניים אמין. למרות שהמודלים של גידול תת עורי הם קלים לשימוש, חסרונות כוללים את חוסר היכולת של גידולים אלה לשלוח גרורות ולחקות את התקדמות הגידול וmicroenvironments ראתה בסרטן בבני אדם. מודלים מהונדסים גנטי, כגון עכבר המהונדס גנטי המכיל קראס וp53 לדפוק במוטציות סרטניות (מודל KPC) ² ומודל KPC עם נותב שושלת YFP (מודל PKCY) ³ יאפשר לחקר גידולים מתרחשים באופן טבעי בimmunocompeteעכברי NT. בנוסף, microenvironment הגידול הוא ללא שינוי ודומה יותר לזו שנצפתה בהתקדמות גידול אנושית. לרוע המזל, העיתוי של התפתחות גידולים הוא משתנה בתוך המודלים האלה, שהופך אותו קשים ללמוד טיפולים ניסיוניים. בנוסף, backcrossing של עכברים אלו דורש כמות משמעותית של זמן והתחייבות כספית, וזה לא תמיד אפשרי. לבסוף, מודלים עכבר מחשב כף יד xenograft מושתלים מחייבים דיכוי חיסוני בעכברים, אשר שינו או microenvironments גידול נעדרה. כתוצאה מכך, יעילותם של טיפולים ניסיוניים הוכיחו במודלים פרה אלה הן לעתים קרובות לא לשחזור בניסויים קליניים בבני אדם ^4.

מודל עכבר hemisplenectomy זה מנצל תאי גידול Panc02, שהם קו סרטני מאוד, methylcholanthrene מושרה לבלב תאי גידול נגזר מעכברי C57BL / 6 ^{5, 6.} בנוסף, שורות תאים אחרות עכבריות מחשב כף יד נובעות ממיקרופון KPCדואר ניתן להשתמש במודל זה. Schulick et al. פתח בעבר טכניקת hemisplenectomy ויצרתי מודל עכבר syngeneic של גרורות סרטן מעי גס ^7. מודל hemisplenectomy זה (איור 1) מציע חיסון גידול עקבי ושווה בעכברים עם מערכת חיסון הלוואות עצמו לחקירה של סוכנים טיפוליים חדשניים ^7-10.

Protocol

כל הניסויים בבעלי החיים תאמו את הנחיות ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת ג'ונס הופקינס, ובעלי חיים נשמרו בהתאם להנחיות של האגודה להערכה והסמכה של מעבדה טיפול (AAALAC). ההליך כירורגי מבוצע בתנאים סטריליים בחדר ניתוח שעובר מינימום של חמישה עשר החלפות אוויר בשעה. כל המכשירים הם מעוקרים ידי המעוקר לפני ההליך ושוב עם 70% אתנול בין כל עכבר במהלך ההליך. כל העכברים לא צפויים לשרוד את ההליך כירורגי מורדמים תחת CO ₂ למשך 3 דקות ואחריו נקע בצוואר הרחם ועדיין תחת הרדמה.

.1 תא הכנה

1. Resuspend תאי Panc02 בתרבית שנאגרו מלוח פוספט ב2 x10 ⁷ תאים / מ"ל, ולשמור על קרח.

.2 עכבר הכנה

1. לנהל Ketaminדואר intraperitoneally ל8-12 שבוע נקבות עכברי C57BL / 6 ישנים במנות מחולקות (100 מ"ג / קילוגרם) מעורב עם Xylazine (10 מ"ג / קילוגרם).
2. בדוק שרפלקס נסיגת קמצוץ הבוהן הוא בוטל על מנת להבטיח שהעכבר הוא בהרדמה מלאה.
3. לנהל מינונים נוספים של קטמין (100 מ"ג / קילוגרם) מעורבים עם Xylazine (10 מ"ג / קילוגרם) לפי צורך כדי להרדים באופן מלא העכברים.
4. החל Vet המשחה Puralube לעיניים של העכברים כדי למנוע התייבשות ואילו העכברים נמצאים תחת הרדמה.
5. לגלח את אזור הניתוח של העכברים, כדי למנוע זיהום של הפצע.
6. הכן את שטח subcostal השמאלי של החתך עם 70% אתנול ולאחר מכן יוד.
7. מניחים לעטוף כירורגית סביב הבטן כדי לשמור על סטריליות.

.3 Laparotomy

1. לעשות חתך subcostal עזב בקנה אחד עם אוזן השמאל דרך העור ודרך הצפק באמצעות אזמל.
2. לבטא את הטחול דרך החתך על ידי יישום p הדיגיטלי בו זמניתressure לאורך היבטי גולגולת וזנב של החתך.
3. אתר את כלי דם הטחול בסוף הנחות של הטחול.
4. מחלקים את הטחול על ידי הצבת שני קליפים ligating גודל בינוני אופק במרכז להיות זהיר, כדי למנוע נזק לכלי דם הטחול בקטבי הטחול הטחול.
5. הנח את המוט העליון של הטחול בחזרה לתוך הצפק, כדי למנוע זיהום.

הזרקת .4 גידול

1. צייר את 150 μl של בופר פוספט לx 5/8 "מזרק 26 G.
2. צייר את של Panc02 100 μl (2 x10 ⁶⁾ תאים לאותו המזרק שמירה על המזרק בתנוחה זקופה בכל העת במהלך ההזרקה.
3. טובלים את המחט בפתרון אתנול 70%. המחט טבולה ב70% אתנול על מנת להבטיח סטריליות.
4. הזרק תאים לאט לתוך hemispleen נחשף להיות בטוח המזרק נשמר זקוף בכל העת. השיפוע של syrinיש לשים לב ge בכל העת באמצעות הקפסולה הטחול כדי למנוע הזרקת התאים תחת הטחול. ההלבנה של כלי הטחול ודם צריכה להיות שנצפתה על זריקה.
5. לרומם את הטחול ולהחיל קליפ האופק הבינוני אחד מתחת לטחול כדי לחסום את כלי דם של טחול.
6. החל קליפ אופק אחד קטן להיבט הדיסטלי ביותר של הלבלב וכלי הטחול.
7. לקשור את הלבלב וטחול כלי מhemispleen על ידי חיתוך מעל קליפים האופק.
8. מניחים את העכבר בצד שלה ", ולהשקות את החתך עם מים מזוקקים.

.5 בטן סגר והתאוששות מן ההרדמה

1. סגור את הצפק עם תפר 4-0 ריצה.
2. החל 02:58 קליפים עור כדי לסגור את החתך בעור.
3. לנהל 0.1 מ"ג / קילוגרם עצירות או 5-10 מ"ג תת עורי / קילוגרם carprofen כדי להקל על כאב שלאחר ניתוח.
4. מניחים את העכבר על כרית חימום לrecאוברי עד נייד והעכבר מדגים דפוסי נשימה רגילים. בעלי חיים חזרו רק לחברה של בעלי חיים אחרים לאחר שחלים באופן מלא מההליך כירורגי.

.6 Necropsy בחינה וקצירה של הכבד

1. בין 30 60 ימים לאחר הניתוח, עכברים יתחילו להראות תסמינים קליניים של גרורות וידרשו המתת חסד. סימנים של מחלה גרורתית, הדורשות הרדמה הומנית כוללים בטן מוגדלת ופיתוח של מיימת. להרדים עכברים על ידי שאיפה של CO _2.
2. בעקבות שאיפה, לבצע נקע בצוואר הרחם.
3. לאחר שבעל החיים נקבעו להיות לא מגיב, עושה חתך דרך הצפק לחשוף את הבטן באמצעות מספריים.
4. בעזרת מלקחיים ומספריים, בעדינות לחתוך את הכבד מחוץ לבטן.
5. מניחים את הכבד במתחם אוקטובר, ובזק להקפיא באמצעות חנקן נוזלי. אחסן את הכבד ב -80 מעלות צלזיוס. לחלופין, בשידור חיr יכול להיות קבוע ב16% ניטראלי שנאגרו פורמלין ב RT ל24 שעות ופרפין מוטבעים.

תוצאות

תאי גידול Panc02 מוזרקים לתוך hemispleen (איור 1) גרורות בכבד טופס בעכברי 100%, ואילו גרורות ריאות והצפק לא ציינו אם הטכניקה מבוצעת בצורה נכונה. טכניקה זו שבוצעה על יותר ממאה עכברים באמצעות תאי Panc02 בניסויים מרובים, עצמאיים, וreproducibly, כל עכברים שלא טופלו למות עם גרורות בכ?...

Discussion

מודל זה פרה קליני עכברי של גרורות בסרטן לבלב בכבד באמצעות טכניקת הזרקת hemispleen הוא הדגם הראשון שתואר, שמשקף רבים של מצבים הקליניים ואימונולוגיים של חולים עם מחלה גרורתית בכבד. מודל זה מציע מספר יתרונות על פני מודלים עכבריים אחרים. ראשית, בניגוד למודלים מהונדסים של סרטן...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251