Um Modelo murino de metástases hepáticas pré-clínica

Resumo

A modelo pré-clínico, murino de metástases hepáticas realizado através de uma técnica de injeção hemispleen.

Resumo

Numerosos modelos murinos foram desenvolvidas para estudar os cancros humanos e avançar o entendimento de tratamento e o desenvolvimento do cancro. Aqui, um modelo pré-clínico, murino tumor pancreático de metástases hepáticas através de uma injecção de células tumorais hemispleen pancreáticos de murino singeneicas é descrito. Este modelo imita muitas das condições clínicas em pacientes com doença metastática para o fígado. Ratos consistentemente desenvolvem metástases no fígado, permitindo a investigação do processo metastático, testes terapia experimental, e a pesquisa da imunologia tumoral.

Introdução

Adenocarcinoma ductal pancreático (PDA) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos ^1. A sobrevida em cinco anos para pacientes com PDA metastático é 2-12% ^1. Embora a quimioterapia adjuvante e neoadjuvante para câncer de pâncreas é mais eficaz do que nunca hoje em dia, ainda há uma necessidade desesperada de novas terapias.

O desenvolvimento de novas terapêuticas necessita de modelos animais pré-clínicos fidedignos. Embora os modelos de tumores subcutâneos são simples de utilizar, desvantagens incluem a incapacidade destes tumores e a metástase imitar a progressão do tumor e microambientes visto em cancros humanos. Modelos geneticamente modificados, tais como o rato geneticamente modificadas contendo Kras e p53 knock-in mutações oncogénicas (o modelo KPC) ² e o modelo KPC com um marcador de linhagem YFP (o modelo PKCY ³⁾ permitem o estudo de tumores que ocorrem naturalmente em immunocompetecamundongos NT. Além disso, o micro-ambiente do tumor é inalterada e é mais parecida com a observada na progressão de tumores humanos. Infelizmente, o tempo de desenvolvimento do tumor é variável dentro desses modelos, o que torna difícil de estudar terapias experimentais. Além disso, backcrossing desses ratos requer uma quantidade significativa de tempo e recursos financeiros, o que nem sempre é viável. Por fim, os modelos de mouse xenotransplante PDA implantados tornem indispensável ratos, que foram alterados ou microambientes tumorais ausentes imunocomprometidos. Como resultado, a eficácia de terapias experimentais demonstraram nestes modelos pré-clínicos são muitas vezes não reprodutíveis em ensaios clínicos humanos ^4.

Este modelo de rato hemiesplenectomia utiliza células tumorais Panc02, que são um, metilcolantreno induzida linha celular de tumor pancreático altamente tumorigénicas derivadas de C57BL / 6 ^{5, 6.} Além disso, outras linhas celulares PDA murino derivado do mic KPCe pode ser utilizado neste modelo. Schulick et al. Já desenvolveu uma técnica hemiesplenectomia e criou um modelo singênico rato de metástases de câncer de cólon ^7. Este modelo hemiesplenectomia (Figura 1) oferece a inoculação do tumor consistente e iguais em camundongos imunocompetentes prestando-se à investigação de novos agentes terapêuticos ^7-10.

Protocolo

Todos os experimentos com animais conformados com as orientações do Comitê de Cuidados e Uso da Universidade Johns Hopkins animal, e os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes da Associação para a Avaliação e Acreditação do Laboratório de Cuidados (AAALAC). O procedimento cirúrgico é realizado sob condições estéreis, numa sala de operações, que passa por um mínimo de quinze trocas de ar por hora. Todos os instrumentos são esterilizados em autoclave antes do procedimento e novamente com etanol a 70%, entre cada um dos ratinhos durante o procedimento. Todos os ratos que não se espera para sobreviver ao procedimento cirúrgico são sacrificados sob CO ₂ durante 3 min, seguido por deslocação cervical, enquanto ainda sob anestesia.

1. celular Preparação

1. Ressuspender as células em cultura in Panc02 salina tamponada com fosfato a 2 x10 ⁷ células / ml, e manter em gelo.

2. Rato Preparação

1. Administrar cetamina-E (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg) por via intraperitoneal com 8-12 semanas de idade C57BL / 6 fêmeas, em doses divididas.
2. Verifique se o dedo do pé retirada pitada reflexo é abolido para garantir que o mouse é totalmente anestesiado.
3. Administrar doses suplementares de cetamina (100 mg / kg) misturado com xilazina (10 mg / kg), conforme necessário para anestesiar completamente os ratinhos.
4. Aplicar Puralube Vet Pomada para os olhos dos camundongos para evitar a secagem quando os ratos estão sob anestesia.
5. Raspar a área cirúrgica dos ratinhos a fim de evitar a contaminação da ferida.
6. Prep a área subcostal esquerda da incisão com etanol a 70% e depois de iodo.
7. Coloque um campo cirúrgico em torno do abdômen para manter a esterilidade.

3. Laparotomia

1. Fazer uma incisão subcostal esquerda em linha com a orelha esquerda através da pele e através do peritoneu utilizando um bisturi.
2. Expresse o baço através da incisão através da aplicação p digitais simultânearessão ao longo dos aspectos cranial e caudal da incisão.
3. Localizar os vasos sanguíneos do baço na extremidade inferior do baço.
4. Divida o baço, colocando dois Horizonte médias clips ligadura no centro do baço tomando cuidado para não danificar os vasos sanguíneos do baço nos pólos do baço.
5. Inserir o pólo superior do baço de volta para o peritoneu para evitar a contaminação.

4 Tumor Injeção

1. Desenha-se 150 ul de solução salina tamponada com fosfato para um 26 L x 5/8 "seringa.
2. Elaborar 100 l de Panc02 (2 x10 ⁶⁾ células para a mesma seringa manter a seringa na posição vertical em todos os momentos durante a injecção.
3. Mergulhar a agulha numa solução de etanol a 70%. A agulha é imersa em etanol a 70% para assegurar a esterilidade.
4. Injetar as células lentamente no hemispleen exposto tendo a certeza da seringa é mantido na vertical em todos os momentos. O bisel da syringe devem ser observados em todos os momentos através da cápsula do baço para evitar a injeção das células sob o baço. A clareamento dos vasos baço e de sangue devem ser observados após a injecção.
5. Eleve o baço e aplicar um meio Horizon clipe sob o baço para ocluir os vasos sanguíneos do baço.
6. Aplicar um pequeno clipe Horizon para o aspecto mais distal do pâncreas e vasos esplênicos.
7. Ligadura do pâncreas e vasos esplênicos da hemispleen cortando acima dos clips horizonte.
8. Posicione o mouse sobre o seu 'lado, e irrigar a incisão com água destilada.

5. Abdominal Encerramento e recuperação da anestesia

1. Feche o peritônio com um ponto 4-0 em execução.
2. Aplicar 2-3 clips de pele para fechar a incisão na pele.
3. Administrar 0,1 mg / kg de buprenorfina ou 5-10 mg / kg por via subcutânea Carprofen para aliviar a dor pós-cirúrgica.
4. Posicione o mouse sobre uma almofada de aquecimento para recovery até celular eo mouse demonstra padrões respiratórios regulares. Os animais só são devolvidos para a companhia de outros animais depois de se recuperar totalmente do procedimento cirúrgico.

6. Necropsia Exame e colheita do Fígado

1. Entre 30 a 60 dias após a cirurgia, os ratos começam a mostrar sintomas clínicos de metástase e vai exigir a eutanásia. Sinais de doença metastática que requerem a eutanásia humanitária incluem abdomens dilatados eo desenvolvimento de ascite. Eutanásia ratos por inalação de _CO2.
2. Após a inalação, realizar deslocamento cervical.
3. Depois que o animal tenha sido determinada a ser não responsivo, fazer uma incisão através do peritônio para expor o abdômen com uma tesoura.
4. Utilizando uma pinça e uma tesoura, cortou delicadamente o fígado para fora do abdômen.
5. Coloque o fígado em composto outubro, eo flash congelar usando nitrogênio líquido. Armazenar o fígado a -80 ° C. Alternativamente, o ao vivor pode ser fixado em 16% de formalina neutra tamponada a TA durante 24 h e embebido em parafina.

Resultados

Células tumorais Panc02 injetados na hemispleen (Figura 1) formar metástases hepáticas em 100% dos ratos, enquanto metástases pulmonares e peritoneal não são observados se a técnica é realizada corretamente. Esta técnica foi realizada em mais de cem ratos usando células Panc02 em vários experimentos independentes, e reprodutível, todos os ratos não tratados morrem com metástases hepáticas entre 30 e 60 dias após o procedimento hemiesplenectomia (Figura 2). Para obter sig...

Discussão

Este modelo murino pré-clínico de metástase do câncer pancreático para o fígado através de uma técnica de injeção hemispleen é o primeiro modelo descrito que espelha muitas das condições clínicas e imunológicas de pacientes com doença metastática para o fígado. Este modelo apresenta várias vantagens em relação aos outros modelos de murino. Em primeiro lugar, ao contrário dos modelos transgénicos de cancro pancreático, em que apenas 30% dos ratinhos desenvolvem metástases do fígado e a temporiza...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251