Доклинические мышиной модели метастазами в печени

Резюме

Доклинические, мышиной модели метастазами в печени осуществляется через инъекции технику hemispleen.

Аннотация

Многочисленные мышиные модели были разработаны для изучения человека рака и улучшить понимание лечения рака и развития. Здесь, доклинические, мышиный поджелудочной модель опухоли печеночных метастазов через hemispleen инъекции сингенных мышиных панкреатических опухолевых клеток описана. Эта модель имитирует многие из клинических условиях у пациентов с метастазами в печень. Мыши последовательно развиваются метастазы в печени, позволяя для исследования метастатического процесса, экспериментальной проверки терапии, и иммунологии опухолей исследований.

Введение

Протока поджелудочной железы аденокарциномы (PDA) является четвертой по значимости причиной, связанных с раком смертей в Соединенных Штатах ^1. Пятилетняя выживаемость пациентов с метастатическим КПК является 2-12% ^1. Хотя адъювантной и неоадъювантной химиотерапии рака поджелудочной железы является более эффективным сегодня, как никогда, все еще остается отчаянную необходимость новых видов лечения.

Развитие новой терапии требует надежных доклинических моделей животных. Хотя подкожные моделях опухолей просты в использовании, недостатки включают неспособность этих опухолей к метастазированию и имитировать прогрессирование опухоли и микросреды видел в человеческих раковых клеток. Генно-инженерные модели, такие, как генно-инженерного мыши, содержащей Kras и p53 нокаут в онкогенных мутаций (модель KPC) ² и модель КЗК с клонов индикатора YFP (модель PKCY) ³ позволяют по изучению естественных опухолей в immunocompeteмышей NT. Кроме того, микросреда опухоли не изменяется и больше напоминает, что видел в опухолевой прогрессии человеческого. К сожалению, сроки развития опухоли можно изменять в этих моделях, что делает его трудно изучать экспериментальные методы лечения. Кроме того, возвратное скрещивание этих мышей требуется значительное количество времени и финансовых обязательств, что не всегда возможно. Наконец, имплантированные модели ксенотрансплантат PDA мыши вызывают необходимость иммунитетом мышей, которые изменили или отсутствующих микросреды опухоли. В результате, эффективность экспериментальных методов лечения продемонстрировали в этих доклинических моделей часто не воспроизводимы в человеческих клинических испытаний ^4.

Эта модель использует мышь hemisplenectomy Panc02 опухолевых клеток, которые в высшей степени онкогенными, индуцированной метилхолантреном поджелудочной железы линии опухолевых клеток, полученная из мышей C57BL / 6 ^{5, 6.} Кроме того, другие мышиные линии PDA клеток, полученных от микрофона KPCE может быть использован в этой модели. Schulick др. Ранее разработали методику hemisplenectomy и создал сингенную модель мыши рака толстой кишки метастазы ^7. Это hemisplenectomy модель (Рисунок 1) предлагает последовательное и равное прививку опухоли в иммунокомпетентных мышей кредитных себя к исследованию новых терапевтических агентов ^7-10.

протокол

Все эксперименты на животных соответствовали директивам уходу и использованию комитета животных университета Джонса Хопкинса, и животные были введены в соответствии с руководящими принципами ассоциации по оценке и аккредитации лаборатории санитарной помощи (AAALAC). Хирургическая процедура выполняется в стерильных условиях в операционной, который подвергается как минимум пятнадцати воздухообмена в час. Все инструменты стерилизуют в автоклаве до процедуры и снова с 70% этанола в период между каждой мыши во время процедуры. Все мыши не ожидается, чтобы выжить хирургическую процедуру эвтаназии в соответствии с СО ₂ в течение 3 мин с последующим смещением шейных позвонков, все еще ​​под наркозом.

1 Приготовление клеток

1. Ресуспендируют культивируемые клетки Panc02 в фосфатно-буферном солевом растворе при 2 x10 ⁷ клеток / мл, и держать на льду.

2 Подготовка Мышь

1. Администрирование кетаминаE (100 мг / кг) смешивают с ксилазином (10 мг / кг) внутрибрюшинно 8-12 недельных мышей C57BL / 6 самок мышей в разделенных дозах.
2. Проверьте, что носок щепотку снятие рефлекс отменены для того, чтобы мышь полностью под наркозом.
3. Администрирование дополнительных доз кетамина (100 мг / кг), смешанные с ксилазином (10 мг / кг) по мере необходимости, чтобы полностью анестезию мыши.
4. Применить Puralube Vet мазь для глаз мышей, чтобы предотвратить высыхание в то время как мыши под анестезией.
5. Бритье хирургическую область мышей, чтобы избежать загрязнения раны.
6. Подготовьте левую подреберье надреза с 70% этанола и затем йода.
7. Поместите хирургической простыне вокруг живота для сохранения стерильности.

3 Лапаротомию

1. Сделайте левой подреберье разрез в соответствии с левого уха через кожу и через брюшину скальпелем.
2. Экспресс селезенки через разрез, применяя одновременно цифровой рдав ления вдоль черепных и хвостовых аспектов разреза.
3. Найти селезенки кровеносные сосуды на нижнем конце селезенки.
4. Разделите селезенки, поставив два Horizon среднего размера лигирования клипы в центре селезенки будьте осторожны, чтобы не повредить селезенки кровеносные сосуды в селезенки полюсов.
5. Установите верхний полюс селезенки обратно в брюшину, чтобы избежать загрязнения.

4 опухоли Инъекции

1. Составление 150 мкл фосфатно-буферным раствором в 26 G 5/8 "х шприца.
2. Составьте 100 мкл Panc02 (2 x10 ⁶⁾ клеток в одном шприце поддержания шприц в вертикальном положении в течение всего времени во время инъекции.
3. Dip иглу в 70% растворе этанола. Игла погружают в 70% этаноле, чтобы обеспечить стерильность.
4. Введите клетки медленно в открытой hemispleen будучи уверенным, шприц хранится в вертикальном положении в любой момент времени. Конические из СиринGE должны соблюдаться во все времена через селезенки капсулы, чтобы избежать инъекционных клетки под селезенки. Отбеливание селезенки и сосудов следует соблюдать при инъекции.
5. Поднимите селезенку и применять один средний Horizon клип под селезенки окклюдировать селезенки кровеносные сосуды.
6. Нанесите один маленький клип Horizon в наиболее дистальной стороны поджелудочной железы и селезенки сосудов.
7. Лигировать поджелудочную железу и селезенки сосуды от hemispleen по резке над клипами Horizon.
8. Наведите на его 'стороне, и орошать разрез с дистиллированной водой.

5 животе Закрытие и выхода из наркоза

1. Закройте брюшины с 4-0 Бегущая строчка.
2. Применить 2:58 клипы кожи, чтобы закрыть разрез кожи.
3. Администрирование 0,1 мг / кг бупренорфина или 5-10 мг / кг подкожно Carprofen, чтобы облегчить сообщение хирургической боли.
4. Наведите на грелку для рекне Overy до мобильных и мышь демонстрирует закономерности дыхания. Животные только вернулся в компанию других животных после полного восстановления после хирургического вмешательства.

6 Вскрытие Экспертиза и Заготовка печени

1. В период с 30 до 60 дней после операции, мыши начнут показывать клинические симптомы метастазов и потребует эвтаназию. Признаки метастазов, требующие гуманного эвтаназию включать расширенный животы и развитие асцита. Усыпить мышей при вдыхании СО _2.
2. После ингаляции, выполнять шейки дислокации.
3. После того, как животное было определено быть не реагировать, сделать надрез через брюшину выставить живот с помощью ножниц.
4. Использование щипцов и ножниц, мягко сократить печень из живота.
5. Поместите печень в октябре соединения, и вспышка заморозить с помощью жидкого азота. Хранить печень при -80 ° С. С другой стороны, в прямом эфиреR может быть зафиксирована в 16% нейтральном формалине с буфером при комнатной температуре в течение 24 ч и парафин.

Результаты

Опухолевые Panc02 клетки вводят в hemispleen (Рисунок 1) форма печени метастазы в 100% мышей, в то время как в легких и перитонеальный метастазы не наблюдаются, если техника выполняется правильно. Эта техника была выполнена на более чем ста мышей с использованием Panc02 клетки в нескольких, ?...

Обсуждение

Это доклинические мышиной модели рака поджелудочной метастазов рака в печень через инъекции технику hemispleen является первой моделью описано, что отражает многие из клинических и иммунологических условий больных с метастазами в печень. Эта модель имеет ряд преимуществ по сравнению с др...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251