Einer präklinischen Mausmodell der Lebermetastasen

Zusammenfassung

Eine präklinische, Mausmodell der Lebermetastasen über eine hemispleen Injektionstechnik durchgeführt.

Zusammenfassung

Zahlreiche murine Modelle wurden entwickelt, um menschliche Karzinome zu studieren und zu fördern, das Verständnis der Krebsbehandlung und Entwicklung. Hier, ein präklinischer, murinen Pankreastumormodell von Lebermetastasen über eine Injektion von syngenen hemispleen murinen Pankreastumorzellen beschrieben. Dieses Modell imitiert viele der klinischen Bedingungen bei Patienten mit Metastasen in die Leber. Mäuse konsequent entwickeln Metastasen in der Leber so dass für die Untersuchung des metastatischen Prozess, experimentelle Therapie Testen und Tumorimmunologie Forschung.

Einleitung

Duktalen Adenokarzinom des Pankreas (PDA) ist die vierthäufigste Ursache von Krebs Todesfälle in den Vereinigten Staaten ^1. Der fünfjährige Überlebensrate für Patienten mit metastasiertem PDA ist 2-12% ^1. Obwohl Adjuvans und neoadjuvante Chemotherapie bei Bauchspeicheldrüsenkrebs ist heute effektiver als je zuvor, bleibt es immer noch einen verzweifelten Bedarf an neuen Therapien.

Die Entwicklung neuartiger Therapeutika erfordert zuverlässige präklinischen Tiermodellen. Obwohl subkutanen Tumormodellen sind einfach zu bedienen, sind Nachteile, die Unfähigkeit dieser Tumoren, Metastasen zu bilden und imitieren die Tumorprogression und Mikroumgebungen in menschlichen Krebserkrankungen gesehen. Gentechnisch veränderte Modelle, wie der gentechnisch veränderte Maus enthalten, Kras und p53-Knock-in onkogene Mutationen (die KPC-Modell) ² und die KPC-Modell mit einem YFP-Linie Tracer (die PKCY Modell) ³ ermöglichen die Untersuchung von natürlich vorkommenden Tumoren in immunocompetent Mäusen. Zusätzlich ist der Tumor-Mikroumgebung unverändert und ähnelt mehr der in menschlichen Tumorprogression angesehen. Leider ist die Zeitsteuerung der Tumorentwicklung Variable innerhalb dieser Modelle, was es schwierig experimentelle Therapien zu studieren. Zusätzlich Rückkreuzung dieser Mäuse erfordert eine erhebliche Menge an Zeit und finanziellen Engagement, das nicht machbar ist immer. Schließlich implantierten Xenograft PDA Mausmodelle erforderlich machen immungeschwächten Mäusen, die verändert wurden oder nicht vorhanden Tumormikroumgebungen. Als ein Ergebnis wird die Wirksamkeit von experimentellen Behandlungen in diesen Tiermodellen gezeigt werden oft in klinischen Studien am Menschen ⁴ nicht reproduzierbar.

Diese Hemisplenektomie Mausmodell verwendet Panc02 Tumorzellen, die ein hoch tumorigenen, Methylcholanthren induzierten Pankreastumorzelllinie aus C57BL / 6 Mäusen, ^{5, 6} ableiten. Zusätzlich anderen murinen PDA Zelllinien aus der KPC mic abgeleitete kann in diesem Modell verwendet werden. Schulick et al. Zuvor entwickelte eine Technik Hemisplenektomie und schuf eine syngenen Mausmodell von Darmkrebs Metastasen ^7. Diese Hemisplenektomie Modell (Abbildung 1) bietet konsistente und gleich Tumorimpfung bei immunkompetenten Mäusen Kredit sich auf die Untersuchung von neuen therapeutischen Mittel ^7-10.

Protokoll

Alle Tierversuche entsprach den Richtlinien der Animal Care und Verwenden Ausschuss der Johns Hopkins University, und die Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Laborbetreuung (AAALAC) gehalten. Das chirurgische Verfahren wird unter sterilen Bedingungen im Operationssaal, die ein Minimum von fünfzehn Luftwechsel pro Stunde unterzogen geführt. Alle Instrumente werden durch Autoklavieren vor der Prozedur und erneut mit 70% Ethanol in zwischen jeder Maus während des Verfahrens sterilisiert. Alle Mäuse nicht erwartet, dass das chirurgische Verfahren überleben werden unter CO ₂ für 3 min, gefolgt durch Genickbruch noch unter Narkose eingeschläfert.

1. Zellpräparation

1. Resuspendieren kultiviert Panc02 Zellen in phosphatgepufferter Salzlösung mit 2 x 10 ⁷ Zellen / ml, und auf Eis halten.

2. Maus Vorbereitung

1. Verwalten KetaminE (100 mg / kg) mit Xylazin (10 mg / kg) gemischt intraperitoneal 8-12 Wochen alte weibliche C57BL / 6 Mäuse in geteilten Dosen.
2. Überprüfen Sie, ob der Zeh Prise Rückzug Reflex wird abgeschafft, um sicherzustellen, dass die Maus vollständig betäubt wird.
3. Verwaltung zusätzlicher Dosen von Ketamin (100 mg / kg) mit Xylazin (10 mg / kg) nach Bedarf, um die Mäuse vollständig betäuben gemischt.
4. Anwenden Puralube Vet Salbe auf die Augen der Mäuse um das Trocknen zu verhindern, während die Mäuse unter Anästhesie.
5. Rasur das Operationsgebiet der Mäuse zu einer Kontamination der Wunde zu vermeiden.
6. Bereiten Sie die linke subkostalen Bereich der Schnittführung mit 70% Ethanol und dann Iod.
7. Legen Sie ein Operationstuch um den Bauch, um die Sterilität zu erhalten.

3. Laparotomie

1. Sie links subkostalen Einschnitt im Einklang mit dem linken Ohr durch die Haut und durch das Peritoneum mit einem Skalpell.
2. Ausdruck der Milz durch den Einschnitt durch die Anwendung gleichzeitiger digitaler pruck entlang der kranialen und kaudalen Aspekte des Einschnitts.
3. Suchen Sie die Milz Blutgefäße am unteren Ende der Milz.
4. Teilen Sie die Milz, indem zwei Horizon mittlerer Größe Liga Clips in der Mitte der Milz vorsichtig, um eine Beschädigung der Milz-Blutgefäße an der Milz Pole.
5. Legen Sie den oberen Pol der Milz zurück in die Bauchhöhle, um Verunreinigungen zu vermeiden.

4. Tumorinjektion

1. Auszuarbeiten 150 ul Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung in einer 26 G x 8.5 "Spritze.
2. Auszuarbeiten 100 ul Panc02 (2 x10 ⁶ Zellen) in die gleiche Spritze Aufrechterhaltung der Spritze in einer aufrechten Position zu jedem Zeitpunkt während der Injektion.
3. Tauchen Sie die Nadel in einem 70% igen Ethanollösung. Die Nadel wird in 70% Ethanol eingetaucht, um Sterilität zu gewährleisten.
4. Injizieren die Zellen langsam in die freigelegte hemispleen wobei Sie die Spritze aufrecht zu allen Zeiten gehalten. Die Abschrägung der syringe zu allen Zeiten durch die Milz Kapsel beobachtet werden, um zu vermeiden Injektion der Zellen in der Milz. Eine Weißfärbung der Milz und Blutgefäße sollte bei Injektion beobachtet werden.
5. Erhöhen die Milz und gelten ein Medium Horizont Clip unter der Milz, die Milz Blutgefäße verschließen.
6. Wenden Sie einen kleinen Horizont Clip auf die meisten distalen Aspekt der Bauchspeicheldrüse und Milz Gefäße.
7. Ligieren die Bauchspeicheldrüse und Milz Schiffe aus der hemispleen durch Schneiden über dem Horizont Clips.
8. Platzieren Sie die Maus auf seiner 'Seite, und bewässern den Schnitt mit destilliertem Wasser.

5. Bauchdeckenverschluss und aus der Narkose

1. Schließen Sie das Bauchfell mit einem 4-0 Lauf Stich.
2. Gelten zwei vor drei Hautklammern, um den Hautschnitt zu schließen.
3. Verwalten 0,1 mg / kg Buprenorphin oder 5-10 mg / kg Carprofen subkutan postoperative Schmerzen zu lindern.
4. Platzieren Sie die Maus auf einem Heizkissen für recOvery, bis Handy und die Maus zeigt, regelmäßige Atmung. Tiere werden nur in der Gesellschaft von anderen Tieren, nach völlig von der Operation erholt zurückgekehrt.

6. Necropsy Prüfung und Ernten der Leber

1. Zwischen 30 bis 60 Tage nach der Operation, wird Mäusen beginnen, klinische Symptome der Metastasierung zeigen und Euthanasie verlangen. Anzeichen von Metastasen erfordern humane Sterbehilfe sind vergrößerte Bauch und die Entwicklung von Aszites. Euthanize Mäuse durch Inhalation von CO _2.
2. Nach Einatmen, führen Genickbruch.
3. Nachdem das Tier festgestellt worden, die auf nicht sein, einen Einschnitt durch das Peritoneum, um den Bauch mit einer Schere aus.
4. Mit einer Pinzette und Schere vorsichtig schneiden die Leber aus dem Bauch.
5. Legen Sie die Leber in OCT-Verbindung und Flash mit flüssigem Stickstoff einfrieren. Bewahren Sie die Leber bei -80 ° C. Alternativ kann das Liver kann in 16% neutral gepuffertem Formalin bei RT für 24 h und in Paraffin eingebetteten fixiert werden.

Ergebnisse

Panc02 Tumorzellen in das hemispleen spritzt (Figur 1) bilden Lebermetastasen bei 100% der Mäuse, während die Lunge und Peritonealmetastasen werden nicht beobachtet, wenn das Verfahren vollständig durchgeführt wird. Diese Technik hat zu über einhundert Mäusen mit Panc02 Zellen in mehrere, unabhängige Experimente durchgeführt worden, und reproduzierbar, sterben alle unbehandelten Mäuse mit Lebermetastasen zwischen 30 und 60 Tagen nach der Hemisplenektomie Verfahren (Figur 2). Um...

Diskussion

Diese präklinischen Mausmodell für Bauchspeicheldrüsenkrebs Metastasierung in die Leber über eine hemispleen Injektionstechnik ist das erste Modell beschrieben, die viele der klinischen und immunologischen Bedingungen der Patienten mit metastatischer Erkrankung der Leber spiegelt. Dieses Modell bietet mehrere Vorteile gegenüber anderen Mausmodellen. Erstens, anders als transgene Modelle von Pankreaskrebs, bei dem nur 30% der Mäuse entwickeln Metastasen in der Leber und dem Zeitpunkt der Metastasenbildung ist sehr ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251