Un préclinique modèle murin de métastases hépatiques

Résumé

Un modèle murin de métastases hépatiques préclinique réalisée par une technique d'injection de hemispleen.

Résumé

De nombreux modèles murins ont été développées pour étudier les cancers humains et de faire progresser la compréhension du traitement du cancer et le développement. Ici, un modèle préclinique murin pancréas tumeur des métastases hépatiques par une injection de cellules syngéniques de hemispleen tumorales pancréatiques de souris est décrit. Ce modèle imite un grand nombre de conditions cliniques chez les patients ayant une maladie métastatique au foie. Souris développent constamment des métastases dans le foie qui permet d'observer le processus métastatique, les essais de thérapie expérimentale, et la recherche en immunologie tumorale.

Introduction

Canalaire pancréatique adénocarcinome (PDA) est la quatrième cause de décès liés au cancer aux États-Unis ^1. La survie à cinq ans pour les patients atteints de PDA métastatique est 2-12% ^1. Bien que la chimiothérapie adjuvante et néoadjuvante pour cancer du pancréas est plus efficace que jamais, il reste encore un besoin désespéré de nouvelles thérapies.

Le développement de nouveaux produits thérapeutiques requiert des modèles animaux précliniques fiables. Bien que les modèles de tumeurs sous-cutanées sont simples à utiliser, les inconvénients comprennent l'incapacité de ces tumeurs et de métastases imiter la progression de la tumeur et des microenvironnements vu dans les cancers humains. Des modèles génétiquement modifiés, tels que la souris transgénique contenant Kras et p53 knock-in mutations oncogéniques (le modèle KPC) ² et le modèle KPC avec une lignée traceur YFP (le modèle de PKCY) ³ permettent l'étude des tumeurs d'origine naturelle dans immunocompetesouris NT. En outre, le micro-environnement de la tumeur n'est pas modifiée et ressemble plus étroitement à celle observée dans la progression tumorale humaine. Malheureusement, le calendrier de développement de la tumeur est variable dans ces modèles, ce qui rend difficile l'étude de thérapies expérimentales. En outre, le rétrocroisement de ces souris nécessite une quantité importante de temps et d'engagement financier, qui n'est pas toujours possible. Enfin, les modèles de xénogreffe de souris implantées PDA nécessitent du souris, qui ont modifié ou micro-environnements tumoraux absents immunodéprimés. Par conséquent, l'efficacité des thérapies expérimentales démontré dans plusieurs modèles précliniques sont souvent pas reproductible dans ^quatre essais cliniques humains.

Ce modèle de souris de hemisplenectomy utilise des cellules tumorales qui sont Panc02, une lignée cellulaire de tumeur hautement tumorigène induit par le méthylcholanthrène pancréatique provenant de souris C57BL / 6 ^{5, 6.} En outre, d'autres lignées cellulaires murines PDA dérivées de la micro KPCe peut être utilisé dans ce modèle. Schulick et al. Ont déjà mis au point une technique de hemisplenectomy et créé un modèle de souris syngéniques de métastases du cancer du côlon ^7. Ce modèle de hemisplenectomy (figure 1) offre inoculation de la tumeur cohérent et égal chez les souris immunocompétentes se prêtant à la recherche de nouveaux agents thérapeutiques ^7-10.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux étaient conformes aux lignes directrices du soin et l'utilisation des animaux Comité de l'Université Johns Hopkins, et les animaux ont été maintenus en conformité avec les directives de l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins de laboratoire (AAALAC). La procédure chirurgicale est effectuée dans des conditions stériles dans une salle d'opération qui est soumis à un minimum de quinze renouvellements d'air par heure. Tous les instruments sont stérilisés par autoclavage avant la procédure et à nouveau avec de l'éthanol à 70% entre chacune des souris au cours de la procédure. Toutes les souris qui ne devraient pas survivre à l'intervention chirurgicale sont euthanasiés sous CO ₂ pendant 3 min puis par dislocation cervicale tout en restant sous anesthésie.

1 Préparation des cellules

1. Remettre en suspension les cellules cultivées Panc02 dans un tampon phosphate salin à 2 x10 ⁷ cellules / ml, et garder sur la glace.

2 Préparation de la souris

1. Administrer la kétaminee (100 mg / kg) en mélange avec la xylazine (10 mg / kg) par voie intrapéritonéale à 8-12 semaines les souris C57BL / 6 de souris femelles en doses fractionnées.
2. Vérifiez que la pointe retrait de pincement réflexe est aboli afin de s'assurer que la souris est totalement anesthésié.
3. Administrer des doses supplémentaires de kétamine (100 mg / kg) en mélange avec xylazine (10 mg / kg) comme nécessaire pour anesthésier les souris complètement.
4. Appliquer Puralube Vet onguent pour les yeux des souris pour éviter le dessèchement tandis que les souris sont sous anesthésie.
5. Raser la région chirurgicale de la souris afin d'éviter la contamination de la plaie.
6. Prep la région sous-costale gauche de l'incision avec 70% d'éthanol et de l'iode.
7. Placez un drap chirurgical autour de l'abdomen pour maintenir la stérilité.

3. laparotomie

1. Faire une incision sous-costale gauche en ligne avec l'oreille gauche à travers la peau et à travers le péritoine à l'aide d'un scalpel.
2. Exprimez la rate à travers l'incision en appliquant p numérique simultanéeression long des aspects crânienne et caudale de l'incision.
3. Localiser les vaisseaux sanguins de la rate, à la fin inférieure de la rate.
4. Divisez la rate en plaçant deux Horizon taille moyenne clips ligature dans le centre de la rate en prenant soin de ne pas endommager les vaisseaux sanguins spléniques aux pôles de la rate.
5. Placer le pôle supérieur de la rate de nouveau dans le péritoine pour éviter la contamination.

4. tumorale par injection

1. Dresser 150 pi de tampon phosphate salin dans un 26 G x 5/8 "seringue.
2. Dresser 100 pi de Panc02 (2 x 10 ⁶ cellules) dans la même seringue en maintenant la seringue en position verticale pendant toute la durée de l'injection.
3. Tremper l'aiguille dans une solution d'éthanol à 70%. L'aiguille est immergée dans de l'éthanol à 70% pour assurer la stérilité.
4. Injecter les cellules lentement dans le hemispleen exposée étant que la seringue est maintenu en position verticale en tout temps. Le biseau de la Syringe doit être respecté en toutes circonstances par la capsule splénique pour éviter d'injecter les cellules dans la rate. Un blanchiment de la rate et les vaisseaux sanguins doit être observée lors de l'injection.
5. Élever la rate et d'appliquer un milieu Horizon pince sous la rate pour obturer les vaisseaux sanguins spléniques.
6. Appliquer une petite pince Horizon à l'aspect le plus distale du pancréas et vaisseaux spléniques.
7. Ligaturer le pancréas et les vaisseaux spléniques de la hemispleen en coupant au-dessus des clips Horizon.
8. Placez la souris sur son «côté, et irriguer l'incision avec de l'eau distillée.

5. abdominale fermeture et récupération de l'anesthésie

1. Fermez le péritoine avec un point 4-0 de course.
2. Appliquer deux à trois clips de la peau pour fermer l'incision de la peau.
3. Administrer 0,1 mg / kg de buprénorphine ou 5-10 mg / kg par voie sous cutanée Carprofen pour soulager la douleur post-opératoire.
4. Placez la souris sur un coussin chauffant pour recovery jusqu'à mobile et la souris montre les modes de respiration réguliers. Animaux ne sont retournés à la compagnie d'autres animaux après avoir récupéré complètement de l'intervention chirurgicale.

6 L'autopsie examen et récolte du foie

1. Entre 30 à 60 jours après l'opération, les souris vont commencer à montrer des symptômes cliniques de métastases et nécessiteront l'euthanasie. Les signes de la maladie métastatique nécessitant euthanasie comprennent abdomen élargie et le développement de l'ascite. Euthanasier les souris par inhalation de CO _2.
2. En cas d'inhalation, effectuer dislocation cervicale.
3. Après que l'animal a été déterminée comme étant non recevable, faire une incision à travers le péritoine d'exposer l'abdomen avec des ciseaux.
4. En utilisant des pinces et ciseaux, couper délicatement le foie de l'abdomen.
5. Placer le foie dans le composé PTOM, et le flash geler l'aide d'azote liquide. Conservez le foie à -80 ° C. Alternativement, le directr peut être fixé à 16% du formol tamponné neutre à la température ambiante pendant 24 heures et inclus en paraffine.

Résultats

Cellules tumorales Panc02 injectés dans le hemispleen (figure 1) des métastases hépatiques en forme 100% des souris, alors que pulmonaires et péritonéales métastases ne sont pas respectées, même si la technique est réalisée correctement. Cette technique a été effectuée sur plus d'une centaine de souris en utilisant des cellules Panc02 dans plusieurs expériences indépendantes, et reproductible, toutes les souris non traitées meurent de métastases hépatiques entre 30 et 60 jours apr?...

Discussion

Ce modèle murin préclinique de la métastase du cancer du pancréas dans le foie via une technique d'injection de hemispleen est le premier modèle qui reflète décrit un grand nombre de conditions cliniques et immunologiques de patients ayant une maladie métastatique au foie. Ce modèle offre plusieurs avantages par rapport à d'autres modèles murins. Tout d'abord, à la différence des modèles transgéniques de cancer du pancréas, dans lequel seulement 30% des souris développent des métastases ver...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line
Phosphate Buffered Saline	Gibco by Life Technologies	10010-023
15 ml centrifuge tubes	Corning	430052
Curved Operating Scissor	Roboz Surgical Store	RS-6835
Micro Dissecting Graefe Forceps	Roboz Surgical Store	RS-5130
Needle holder (regular)	World Precision Instruments, Inc
3-0 or 4-0 suture			courtesy of dept of surgery, Johns Hopkins
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, small, angled	Teleflex	137085
Weck Horizon Open Ligating Clip Applier, medium, angled	Teleflex	237115
Weck Horizon medium ligating clips	Teleflex	002200
Weck Horizon small ligating clips	Teleflex	001200
Syringe, 1 cc, tb syringe, 3/8" slip tip	Becton Dickinson	309625
Syringe, 1 cc, tb syringe, 5/8" slip tip	Becton Dickinson	309597
9 mm Autoclip Applier	Mikron	427630
9 mm Autoclip	Becton Dickinson	427631
Heating pad	Sunbeam	CAT93
70% Ethanol			sold by numerous vendors
Ketamine Hydrochloride	Hospira	22395DD
Xylazine hydrochloride	Sigma	X1251