פרוטוקול להדביק<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; עם<em&gt; Typhimurium סלמונלה</em

Summary

סי אלגנס התפתחה כמודל גנטי חדש כדי לחקור אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן. כאן אנו מתארים פרוטוקול להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה בשילוב עם טכניקת התערבות RNAi גדיל פעמיים כדי לבחון את התפקיד של גנים מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה.

Abstract

בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין מארחים ופתוגנים, כולל ההגנה המארחת נגד סלמונלה typhimurium חיידק גראם שלילי. סלמונלה קובעת זיהום מתמשך במעי של ג elegans ותוצאות במוות המוקדם של בעלי חיים נגועים. מספר מנגנוני חסינות זוהה בג elegans כדי להתגונן מפני זיהומי סלמונלה. Autophagy, מסלול השפלה lysosomal אבולוציונית שימור, הוכח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans וביונקים. הנה, בפרוטוקול מתואר להדביק ג elegans עם typhimurium סלמונלה, שבו התולעים נחשפים לסלמונלה לזמן מוגבל, בדומה לזיהום סלמונלה בבני אדם. זיהום סלמונלה מקצר את תוחלת החיים של ג באופן משמעותי elegans </ Em>. שימוש בגן autophagy החיוני BEC-1 כדוגמא, אנחנו בשילוב שיטת זיהום זה עם ג elegans RNAi האכלת גישה והראה פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לבחון את תפקידו של ג גנים מארח elegans בהגנה מפני זיהום סלמונלה. מאז ג elegans ספריות RNAi הגנום כולו זמינות, פרוטוקול זה מאפשר למסך באופן מקיף לג גנים elegans כי להגן מפני סלמונלה ופתוגנים מעיים אחרים באמצעות ספריות RNAi הגנום כולו.

Introduction

נמטודות הקרקע המתגוררות ללא Caenorhabditis elegans היא אורגניזם מודל פשוט וגנטי צייתן שימוש ללמוד הרבה שאלות ביולוגיות. ג elegans דומיננטי קיים כהרמפרודיטים דישון עצמיים. זכרים שנוצרו באופן ספונטני על ידי אי - חוסר התאמה של כרומוזום X במהלך ^1,2 gametogenesis. בנוכחותו של מזון בשפע, ג elegans לפתח ברציפות בארבעה שלבי זחל למבוגרים. טמפרטורה גם משפיעה ג פיתוח elegans; פיתוח מהיר יותר היא נצפתה בטמפרטורות גבוהות יותר. במעבדה, ג elegans הוא תרבית בטמפרטורה סטנדרטית של C ° 20 על צלחות אגר עם coli Escherichia זרע החיידק (זן OP50) כמזון ^1,2.

בעשור האחרון, ג elegans התפתחה האורגניזם חסר חוליות ללמוד אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן ^3-5. בטבע, ג elegans אוכל חיידקים כnutrien^1,2 המקור לא. האוכל שלה נורמלי חיידקים במעבדה, OP50, ניתן להחליף בקלות עם פתוגנים אחרים כדי לבחון את יחסי הגומלין בין ג elegans וכל פתוגן שנבחר. בתנאים אלה, המעי הוא האתר העיקרי של הזיהום. אכן, מגוון רחב של חיידקים פתוגנים הוכח להדביק קטלני ג elegans ^3-5.

סלמונלה חיידק גראם שלילי היא הפתוגן במערכת העיכול שגורם למחלות שמקורן במזון לבני אדם ברחבי העולם ^6,7. ג elegans הוא מארח מודל טוב לסלמונלה typhimurium כחיידק הזה משכפל ותערוכות דלקות מעיים מתמשכות ^8-10. ג elegans נעשה שימוש כדי לזהות גם רומן וארסיות סלמונלה ידועה קודם לכן גורמי ^11. מעניין לציין, כי ג מערכת חיסונית elegans מגבילה הצלחת שכפול סלמונלה. זה כבר דווח בעבר כי inhibition של גנים autophagy הופך שכפול סלמונלה מוגבר בג elegans, וכתוצאה מכך למוות המוקדם של תולעים נגועים ^10. Macroautophagy (המכונה במסמך זה כלautophagy) הוא תהליך דינמי הכולל ארגון מחדש של קרומי subcellular לעקל ציטופלסמה ואברונים למסירה הליזוזום לפירוק ^12. Autophagy דווח להגביל את שכפול סלמונלה בג elegans ואצל יונקי ^10,13.

ג הגנום elegans היה הגנום תאיים אוקריוטים הראשון רצף; הוא מגיב לטיפול RNAi ^14-16. יתר על כן, יכול להיות מנוהל ביעילות על ידי חשיפת RNAi תולעים לבלוע חיידקים המכילים פעמיים תקועים RNA של גן המטרה, המכונה RNAi האכלת ^16,17. ספריות האכלת הגנום כולו RNAi כבר נוצרו עבור RNAi הגנום הקרנת ^16,18. בזאת, הפרו זיהום סלמונלהtocol בשילוב עם RNAi האכלה כדי לאפשר ג הבדיקה גנים elegans של עניין ביכולתם על מנת להגן מפני זיהום סלמונלה.

Protocol

1. צלחות XLD (קסילוז יזין Desoxycholate) אגר

אגר XLD הוא מדיום גידול סלקטיבי לסלמונלה, שמופיע כמושבות שחורות על צלחות אגר XLD. עם זאת, אם אין חשש לזיהום, ניתן להחליף צלחת LB רגילה.

1. לשקול את אגר XLD 5.5 g ו resuspend ב 5 מיליליטר מים deionized.
2. מערבבים היטב עד שכל אגר הוא רטוב. הוספת 95 מיליליטר מים deionized עד שכל הגושים נעלמים והבינוני הוא resuspended לחלוטין.
3. מרתיחים את המדיום כדי להמס לחלוטין (לא חיטוי).
4. מגניב הבינוני בטמפרטורת חדר כדי 50 ° C.
5. יוצקים 25 אגר מיליליטר בכל 95 x 15 מ"מ צלחת (גובה x קוטר) (צלחות חתומות עם Parafilm יכולות להיות מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס למשך עד חודש 1).

2. צמיחה נמטודות בינוני (NGM) RNAi האכלת צלחות

הכנת ג צלחות elegans NGM כבר תוארו בעבר ¹ 9. הנה הליך מתואר בקצרה להוסיף אמפיצילין האנטיביוטיקה ואיזופרופיל inducer הכימי RNAi β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתקשורת NGM לעשות צלחות האכלת RNAi.

1. להמס 3 גרם NaCl ו2.5 peptone גרם Bacto בליטר המים deionized 1.
2. הוספת 17 אגר Bacto גרם לכלי התקשורת.
3. החיטוי התקשורת 45 דקות ולקרר את התקשורת ל50 מעלות צלזיוס באמבט מים.
4. להוסיף את הפתרונות הבאים: כולסטרול מיליליטר 1 (5 מ"ג / מיליליטר ב95% אתנול), 1 מיליליטר 1 M CaCl _2, 1 מיליליטר 1 M MgSO _4, ו25 מיליליטר 1 M חיץ אשלגן זרחה (pH 6.0). מערבבים היטב.
5. הוסף 1 מיליליטר 1 M IPTG ו500 אמפיצילין μl (100 מ"ג / מיליליטר במים סטריליים).
6. מערבבים את הפתרון טוב ויוצקים לתוך 60 x 15 מ"מ (גובה x קוטר) צלחות פטרי באמצעות סיוע Pipet ו25 מיליליטר פיפטה סרולוגיות בעקבות הליכי סטרילי. ממלא כל צלחת עם אגר מיליליטר 12. ניתן לאחסן צלחות על 4 מעלות צלזיוס עד חודש 1.

"Jove_title"> 3. הכן את בעלי חיים שטופלו RNAi לזיהום

גן autophagy החיוני BEC-1 משמש כדוגמא כדי לבחון את תפקודו של גן מארח בהגנה מפני זיהום סלמונלה. הפרוצדורות הן באיור 1 ולוח 1. הפרוטוקול להכנת חיות שטופלו ב-RNAi לזיהום הבא, עם היום של כל שלב ניסיוני שניתן בסוגריים.

1. לחסן האכלת RNAi BEC-1 ובקרת וקטור הריק L4440 RNAi האכלת חיידקים על ידי הצבת פתית של -80 חיידקים קפואים מעלות צלזיוס ל -2 מיליליטר מדיום LB בתוספת 100 מ"ג / מיליליטר אמפיצילין (יום 1). חזור על פעולה זו פעם בשבוע במהלך כל הניסוי יש חיידקי RNAi טריים. אחסן את התרבות במקרר 4 ° C, כאשר אינו בשימוש.
2. זרעים של תרבות חיידקי RNAi לילה 100 מיליליטר על צלחות RNAi. הכן שלושה RNAi BEC-1 ושלוש השליטה v הריקEctor צלחות RNAi. דגירה הצלחות ב 37 ° C במשך לילה (יום 2).
3. הסר את צלחות RNAi מ37 מעלות צלזיוס החממה ולאפשר להם להתקרר לטמפרטורת חדר על הספסל. תרים הרמפרודיטים N2 סוג בר L4 ייזונו היטב, ולהעביר אותם ל-BEC 1 RNAi ולשלוט צלחות RNAi וקטור ריקות. הנח שלושה תולעים לכל צלחת, על צלחות בשלושה עותקים. באותו היום, להכין צלחות RNAi כמתואר בשלב 3.2 (יום 3).
4. דגירה צלחות RNAi עם תולעים בחממת 20 מעלות צלזיוס במשך 36-40 תולעי שעה ומעביר לצלחות RNAi מקבילה טריות מוכנות בשלב 3.3. אחרי התולעים מועברים, דגירה הצלחות בחממת C ° 20 ל64 שעה (יום 4).

4. הכן סלמונלה לזיהום

1. סלמונלה Streak -80 ° C מניות קפוא על צלחת אגר XLD 1 ו דגירה את הצלחת על 37 ° C במשך הלילה (יום 5 ).
2. פיק מושבה סלמונלה השחורה מבודדת היטב ולחסן אותו בכ -2 מיליליטר מדיום LB על 37 מעלות צלזיוס עם רעד הלילה (יום 6).
3. תרבות לילה זרע 80 מיליליטר סלמונלה על 1 ג elegans 60 x 15 מ"מ (גובה x קוטר) צלחת אגר NGM ולהכין 6 צלחות בסך הכל. דגירה הצלחות בטמפרטורת חדר למשך 6 שעות. תרבות החיידקים צריכה להתייבש ויוצרת דשא על הצלחת (יום 7).

5. תולעים שטופלו ב-RNAi להדביק עם סלמונלה

1. העבר את BEC-1 ולשלוט הרמפרודיטים ריקים וקטור טופלו RNAi L4 N2 (צאצאים של תולעים שהוקמו בשלב 3) לצלחות סלמונלה שטופלה RNAi. הנח 40 תולעים לכל צלחת על 3 צלחות עבור כל קבוצה. דגירה צלחות התולעת ב20 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות (יום 7).
2. הכן את הסט אחד של צלחות RNAi טריות כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2 (יום 7 ו יום 8).
3. לאחר 48 זיהום שעה, להעביר תולעים הנגועים בסלמונלה לצלחות RNAi המתאימות מוכנות בשלב 5.2 ולדגור על 20 ° C (יום 9).

6. הישרדות Assay

1. ציון ההישרדות של תולעים יומיים ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות בתקופת הטלת הביצים. להכין סט של צלחות RNAi טריות לפני כל העברת תולעת כמתואר בשלבי 3.1 ו3.2. לגעת בגוף התולעת (הראש, חלק וזנב באמצע) בעדינות עם חוט פלטינה שיטח סוף. תולעת הוא הבקיע כמת אם לא תנועה של גוף התולעת הוא ציינה.
2. ציון ההישרדות של תולעים ביום או בכל יום אחר, ולהעביר את תולעים לצלחות RNAi מתאימים טריות פעמיים בשבוע אחרי התולעים יפסיקו להטיל ביצים.
3. אחרי הכל התולעים למות, בריכת נתוני הישרדות מצלחות בשלושה עותקים כסט נתונים אחד. קלט נתוני ההישרדות של כל קבוצה לתוך תוכנה סטטיסטית מתאימה כגון GraphPad Prism ליצור עקומות הישרדות ולבצע ניתוח הישרדות Kaplan-Meier. כל הניסוי חוזר על עצמו לפחות פעם אחת כדי לאשר את המסקנה.

תוצאות

ב 20 ° C, תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 סוג בר היא 17 ימים (איור 2 א וטבלה 2). זיהום סלמונלה מקטין באופן משמעותי את תוחלת החיים הממוצעת של תולעי N2 ל10.5 ימים (p = 0.0002, בדיקת יומן דרגה) (איור 2A ).

אם ג גן elegans ממל...

Discussion

סי אלגנס הוא אורגניזם מודל גנטי פשוט שאוכלת חיידקים כמקור התזונתי שלה. לפיכך, קל להחליף החיידקים שבמזון הרגיל שלו עם הפתוגן מעיים כדי לחקור את יחסי הגומלין בין ג elegans ופתוגן שנבחר. במסמך פרוטוקול מתואר לשלב זיהום סלמונלה ו-C elegans RNAi האכלת טיפול כדי לבחון ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL