Bulaştırmak için bir protokol<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Ile<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Özet

C. elegans konak-patojen etkileşimleri çalışmak için yeni bir genetik model olarak ortaya çıkmıştır. Burada C bulaştırmak için bir protokol açıklar Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için çift iplikli RNAi girişim tekniği ile birleştiğinde Salmonella typhimurium ile elegans.

Özet

Son on yıl içinde, C. elegans gram-negatif bakteri Salmonella typhimurium karşı ev sahibi savunma da dahil olmak üzere, ana ve patojen arasındaki etkileşimleri incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Salmonella C bağırsakta inatçı enfeksiyon oluşturur elegans ve enfekte olmuş hayvanlar arasında erken ölüm ile sonuçlanır. Bağışıklık bir takım mekanizmalar C de tespit edilmiştir Salmonella enfeksiyonlarına karşı savunmak için elegans. Autophagy, evrimsel olarak muhafaza edilmiş lizozomal bozunma yolağı, C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için gösterilmiştir elegans ve memelilerde. Burada, protokol C bulaştırmak için açıklanan Solucanlar Salmonella, insanlarda enfeksiyona benzer bir süre için, Salmonella maruz edildiği Salmonella typhimurium ile elegans. Salmonella enfeksiyonu önemli C ömrü kısaltır elegans </ Em>. Bir örnek olarak temel autophagy geni bec-1 kullanarak, C ile bu enfeksiyon yöntemi Birleştirilen elegans RNAi yaklaşım besleme ve bu protokol C işlevini incelemek için kullanılabilir gösterdi Salmonella enfeksiyonu karşı savunmada elegans konak genler. Yana C. elegans tüm genom RNAi kütüphaneler kullanılabilir, bu protokol kapsamlı C taranması için mümkün kılan genom RNAi kütüphaneleri kullanılarak Salmonella ve diğer bağırsak patojenlere karşı korumak elegans genler.

Giriş

Serbest yaşayan toprak nematod Caenorhabditis elegans birçok biyolojik soruları incelemek için kullanılan basit ve genetik uysal bir model organizmadır. C. elegans egemen kendini gübreleme çift cinsiyetli olarak var. Erkekler kendiliğinden gametogenezi ^1,2 sırasında X kromozomu olmayan disjunction tarafından oluşturulur. Bol yiyecek, C varlığında elegans sürekli yetişkin Dört larva aşamalardan geçerek gelişir. Sıcaklık da C etkilemektedir elegans gelişimi; Daha hızlı gelişimi, daha yüksek sıcaklıklarda görülmektedir. Laboratuvarda, C. elegans gıda ^1,2 olarak tohumlanmış bakteri Escherichia coli (suş OP50) ile agar plakaları üzerinde 20 ° C'lik bir sabit bir sıcaklıkta kültürlenir.

Son on yıl içinde, C. elegans konak-patojen ^3-5 incelemek için bir omurgasız organizma olarak ortaya çıkmıştır. Doğada, C. elegans onun nutrien olarak bakteri yiyort kaynak ^1,2. Bu normal bakteri laboratuar gıda, OP50, kolayca C arasındaki etkileşimi incelemek için diğer patojenler ile ikame edilebilir elegans ve seçilen herhangi bir patojen. Bu koşullar altında, bağırsak enfeksiyonun birincil sitesidir. Gerçekten de, bakteriyel patojenlerin geniş bir yelpazede ölümcül C enfekte ettiği gösterilmiştir elegans ^3-5.

Gram-negatif bakteri Salmonella çapında ^6,7 insan gıda kaynaklı hastalığa neden olan bir gastrointestinal patojendir. C. Bu bakteri çoğaltır ve kalıcı bağırsak enfeksiyonları ^8-10 sergiler gibi elegans Salmonella typhimurium için iyi bir model ev sahipliği yapmaktadır. C. elegans roman hem tanımlamak için kullanılmıştır, ve daha önceden bilinen Salmonella hastalık oluşturma faktörleri ^11. İlginç bir şekilde, C. elegans bağışıklık sistemi başarıyla Salmonella çoğaltma sınırlar. O Inhib önce rapor edilmiştirautophagy genlerin enfraruj C'de artan Salmonella çoğaltma işler elegans, enfekte solucan ¹⁰ erken ölüm ile sonuçlanır. (Burada Otofaji olarak anılacaktır) Macroautophagy bozulması için ¹² lizozom teslimat için sitoplazma ve ayırmak için hücre içi organellere zarlarının yeniden düzenlenmesini içeren bir dinamik bir süreçtir. Autophagy C. Salmonella çoğaltma sınırlamak için bildirilmiştir elegans ve memeliler de ^10,13.

C. elegans genomu ilk çok hücreli ökaryot genom olduğu; Bu RNAi tedavi ^14-16 yanıt verici olmaktadır. Ayrıca, RNAi RNAi ^16,17 besleme olarak bilinen hedef genin, bir iki-şeritli RNA içeren bakteri yemek için solucan tabi tutulması ile etkili bir şekilde idare edilebilir. Tüm genom RNAi besleme kütüphaneler genom RNAi ^16,18 taranması için oluşturulan edilmiştir. Burada, bir Salmonella enfeksiyonu protocol RNAi test C'ye izin beslenme ile birleştiğinde Salmonella enfeksiyona karşı koruma kabiliyetleri için ilgi çekici elegans genler.

Protokol

1.. XLD (ksiloz Lizin desoksikolat) Agar Tabaklar

XLD agar XLD agar plakaları üzerinde siyah koloniler görünür Salmonella, bir seçimli büyüme ortamı kullanılarak bir. Kontaminasyon endişeler vardır, ancak normal bir LB plakası ikame edilebilir.

1. 5 ml iyonu giderilmiş su içinde 5.5 g XLD agar ve tekrar süspansiyon tartıldı.
2. Tüm ağar ıslak kadar iyice karıştırın. Topaklar gitti ve ortam tamamen yeniden süspansiyon haline gelinceye kadar deiyonize su 95 ml ilave edilir.
3. Tamamen (otoklavlamayın yok) eritmek için orta kaynatın.
4. 50 ° C oda sıcaklığında, ortam soğutun
5. Her biri 95 x 15 mm (çap x yükseklik) plaka (Parafilm ile sızdırmaz plakalar, 1 ay boyunca 4 ° C 'de muhafaza edilebilir) 25 ml agar dökün.

2.. Nematodu Büyüme Orta (NGM) RNAi Tabaklar Besleme

C. hazırlanması elegans NGM plakalar, daha önce tarif edilmiştir ¹9. Burada bir prosedür kısaca RNAi besleme plakaları yapmak için NGM ortamı içine antibiyotik ampisilin ve RNAi kimyasal indüktör izopropil β-D-1-tiogalaktopiranosid (IPTG) ekleyin tarif edilir.

1. 3 g NaCl ve 1 L iyonu giderilmiş su içinde 2.5 g Bacto pepton çözülür.
2. Ortam içine 17 gr Bacto ağar ekleyin.
3. 45 dakika boyunca ortam otoklav ve bir su banyosu içerisinde 50 ° C'ye kadar ortam soğutun.
4. 1 ml kolesterol (% 95 etanol içinde 5 mg / ml), 1 ml 1 M _CaCl2, 1 ml 1 M MgSO ₄ ve 25 ml 1 M potasyum fosfat tamponu (pH 6.0): aşağıdaki çözümleri ekleyin. İyice karıştırın.
5. 1 ml 1 M IPTG ve 500 ul ampisilin (steril su içinde 100 mg / ml) eklenir.
6. Iyi çözüm karıştırın ve Pipet yardımcısı kullanarak ve steril prosedürleri takip 25 mi serolojik pipet 60 x 15 mm (çap x yükseklik) petri tabak içine dökün. 12 ml agar ile her bir plak doldurun. Plakalar kadar 1 ay boyunca 4 ° C'de saklanabilir.

3 "jove_title". Enfeksiyon için RNAi ile tedavi edilen hayvanların hazırlanması

Temel autophagy geni bec-1 Salmonella enfeksiyonuna karşı savunma bir konak genin işlevini incelemek için bir örnek olarak kullanılmıştır. Deney prosedürleri, Şekil 1 ve Tablo 1 'de gösterilmiştir. Bulaşmasına RNAi ile muamele edilmiş hayvanların hazırlanması için protokol, parantez içinde verilmektedir, her deney aşamasının gün izler.

1. Bec-1 RNAi besleme inoküle ve 100 mg / ml ampisilin (Gün 1) ile desteklenmiş 2 ml LB ortam içine -80 ° C donmuş bakteri pul yerleştirilerek boş vektör L4440 RNAi bakteri besleme kontrolü. Taze RNAi bakteri olması tüm deney boyunca haftada bir kez bu adımı tekrarlayın. Kullanılmadığı zaman, 4 ° C buzdolabı içinde kültür saklayın.
2. RNAi tabakalarına RNAi bakteri kültürü gece boyunca 100 ml tohum. Üç bec-1 RNAi ve üç kontrol boş v hazırlayınRNAi plakaları ector. 37 ° C gece boyunca (Gün 2) de inkübe edin.
3. 37 ° C inkübatör RNAi plakaları kaldırmak ve onları bankta oda sıcaklığına kadar soğumasını bekleyin. Besili L4 vahşi tip N2 Hermafroditler Pick up ve onları RNAi-1 bec ve boş vektör RNAi plakaları kontrol transfer. , Üçlü plakalar üzerinde, plaka başına üç solucanlar yerleştirin. Aşama 3.2 (Gün 3) 'de anlatılan ile aynı günde, RNAi plakaları hazırlar.
4. Adım 3.3 'de hazırlanan taze gelen RNAi plakaları 36-40 saat ve transfer solucanlar için 20 ° C inkübatör solucanlar ile RNAi inkübe edin. Solucanlar aktarılır sonra 64 saat (Gün 4) için 20 ° C inkübatör içinde inkübe edin.

4. Enfeksiyon için Salmonella hazırlayın

1. Streak Salmonella -80 ° C dondurulmuş 1 XLD agar plaka üzerinde stok ve gece (5 Gün 37 ° C plaka inkübe ).
2. Bir iyi izole edilmiş siyah Salmonella koloni almak ve (Gün 6) bir karışımı çalkalanarak 37 ° C'de 2 ml LB ortamı içinde inoküle.
3. 1 C. Tohum 80 ml ​​Salmonella gecede kültür elegans 60 x 15 mm (çap x yükseklik) NGM agar plaka ve toplam 6 plakaları hazırlamak. 6 saat boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Bakteri kültürü plakasının (Gün 7) üzerine, bir çim kuru ve oluşturmalıdır.

Salmonella, 5. Infect RNAi ile muamele Worms

1. Transferi bec-1 RNAi tedavi ve Salmonella plakalarına boş vektör RNAi tedavi L4 N2 çift cinsiyetli (Adım 3 kurmak solucanlar döl) kontrol eder. Her bir grup için 3 levhaları üzerinde plaka başına 40 solucanlar yerleştirin. 48 saat (Gün 7) 20 ° C'de sonsuz inkübe edin.
2. Adım 3.1 ve 3.2 (Gün 7'de tarif edildiği gibi, taze RNAi plakaları bir takım hazırlanması ve Gün 8).
3. 48 saatlik enfeksiyondan sonra, aşama 5.2 'de hazırlanan karşılık gelen RNAi plakalara Salmonella ile enfekte olmuş solucan aktarın ve 20 ° C (gün 9) de inkübe edilir.

6.. Kurtuluş Testi

1. Günlük solucanlar hayatta Puan ve yumurtlama zamanında taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer. Adım 3.1 ve 3.2 'de tarif edildiği gibi önceki her sarmal transfer taze RNAi plakaları bir dizi hazırlayın. Yavaşça bir uçtan basık platin tel ile solucan vücudu (baş, orta kısım ve kuyruk) dokunun. Solucan gövdesinin hiçbir hareket görülmediği takdirde bir solucan ölü olarak puanlanır.
2. Günlük solucan veya her gün hayatta kalma Puan ve solucanlar yumurta döşeme durdurmak sonra iki kez bir hafta taze gelen RNAi plakaları solucanlar transfer.
3. Tüm solucanlar Öldükten sonra, bir veri kümesi olarak üçlü plakaları sağkalım verileri havuzu. GraphPad P olarak uygun istatistiksel yazılım içine her grubun girdi sağkalım verilerisağkalım eğrileri oluşturmak ve Kaplan-Meier sağkalım analizi yapmak Rism. Tüm deney sonucu teyit etmek için en az bir kez tekrarlanır.

Sonuçlar

20 ° C'de, vahşi tip N2 solucanlar medyan ömrü. Salmonella enfeksiyonu belirgin 10.5 gün N2 solucanlar medyan ömrünü azaltır 17 gün (Şekil 2A ve Tablo 2) (p = 0.0002, log-rank testi) (Şekil 2A .)

Bir C. elegans geninin Salmonella hastalıklara karşı önemli bir rol oynar, kendi inhibisyon Salmonella enfeksiyona karşı yatkınlığın vermek olacağı tahmin edilmektedir. Aslında, Sa...

Tartışmalar

C. elegans onun besin kaynağı olarak bakteri yiyor basit bir genetik model organizmadır. Böylece, C arasındaki etkileşimleri araştırmak için bir bağırsak patojen ile normal bakteriyel gıda yerine kolaydır elegans ve seçilen patojen. Burada bir protokol Salmonella enfeksiyonu ve C birleştirmek için açıklanan elegans RNAi Salmonella enfeksiyona karşı savunma konak genlerin rolünü incelemek için tedavi besleme. Önceki enfeksiyon protokol...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL