Um protocolo para infectar<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Com<em&gt; Salmonella typhimurium</em

Resumo

C. elegans tem emergido como um novo modelo genético para estudar as interações patógeno-hospedeiro. Aqui nós descrevemos um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, juntamente com a técnica de interferência dupla vertente RNAi para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella.

Resumo

Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar interações entre hospedeiros e patógenos, incluindo a defesa do hospedeiro contra bactérias gram-negativas bactéria Salmonella typhimurium. Salmonella estabelece infecção persistente no intestino de C. elegans e resulta na morte prematura dos animais infectados. Um número de mecanismos de imunidade foram identificados em C. elegans para se defender contra infecções por Salmonella. Autophagy, uma via de degradação lisossomal evolutivamente conservadas, foi mostrado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e nos mamíferos. Aqui, é descrito um protocolo para infectar C. elegans com Salmonella typhimurium, em que os vermes são expostos a Salmonella por um tempo limitado, semelhante à infecção por Salmonella em humanos. infecção por Salmonella encurta significativamente o tempo de vida de C. elegans </ Em>. Usando o gene essencial autofagia bec-1 como exemplo, que combinado este método de infecção com C. elegans ARNi alimentação abordagem e mostraram que este protocolo pode ser utilizado para examinar a função de C. genes do hospedeiro elegans em defesa contra a infecção por Salmonella. Desde C. elegans genoma bibliotecas inteiras RNAi estão disponíveis, este protocolo torna possível para a tela de forma abrangente para C. elegans genes que protegem contra Salmonella e outros patógenos intestinais usando bibliotecas RNAi genômicos.

Introdução

O solo de vida livre Caenorhabditis elegans nematóide é um organismo modelo simples e geneticamente tratável usada para estudar muitas questões biológicas. C. elegans dominantemente existe como hermafroditas auto-fertilização. Os machos são gerados de forma espontânea por não-disjunção do cromossomo X durante a gametogênese ^1,2. Na presença de alimento abundante, C. elegans desenvolver continuamente através de quatro fases larval ao adulto. A temperatura também influencia C. desenvolvimento elegans; desenvolvimento mais rápido é observada a temperaturas mais elevadas. No laboratório, C. elegans é cultivada a uma temperatura normal de 20 ° C em placas de agar com semeado bactéria Escherichia coli (estirpe OP50) como alimento ^{de 1,2.}

Na última década, C. elegans tem emergido como um organismo de invertebrados para estudar as interações patógeno-hospedeiro ^3-5. Na natureza, C. elegans come bactérias como nutrient ^1,2 fonte. Sua comida laboratório bacteriana normal, OP50, pode ser facilmente substituído por outros agentes patogénicos para examinar as interações entre C. elegans e qualquer agente patogénico escolhido. Sob estas condições, o intestino é o principal local da infecção. De facto, uma grande variedade de agentes patogénicos bacterianos tem sido mostrado para infectar letalmente C. elegans ^3-5.

A bactéria Salmonella gram-negativo é um patógeno gastrointestinal que causa doenças de origem alimentar humana em todo o mundo ^6,7. C. elegans é um bom anfitrião modelo para Salmonella typhimurium como esta bactéria replica e apresenta infecções intestinais persistentes ^8-10. C. elegans foi utilizado para identificar novas e anteriormente conhecida virulência de Salmonella factores ^11. Curiosamente, a C. sistema imunitário elegans limita com sucesso a replicação de Salmonella. Foi relatado anteriormente que inibidoition de genes autofagia torna o aumento da replicação Salmonella em C. elegans, resultando em morte precoce de vermes infectados ^10. Macroautofagia (aqui referido como autofagia) é um processo dinâmico, que envolve o rearranjo de membranas intracelulares para sequestrar citoplasma e organelas para entrega do lisossoma para degradação ^12. Autophagy foi reportado para limitar a replicação de Salmonella em C. elegans e em mamíferos ^10,13.

O C. elegans genoma foi o primeiro genoma eucarionte multicelular seqüenciado; ele é sensível ao tratamento ^14-16 RNAi. Além disso, o RNAi pode ser administrado de forma eficaz, sujeitando vermes ingerir bactérias contendo o ARN de cadeia dupla do gene alvo, conhecido como RNAi alimentação ^16,17. Genoma bibliotecas inteiras de alimentação RNAi foram gerados por RNAi do genoma triagem ^16,18. Nisto, uma infecção pro Salmonellatocolo está acoplado com o RNAi alimentação para permitir o teste C. elegans genes de interesse para a sua capacidade de proteger contra infecção por Salmonella.

Protocolo

1. Placas XLD (xilose lisina desoxicolato) Agar

Ágar XLD é um meio de crescimento seletivo para Salmonella, que aparece como colônias pretas nas placas de ágar XLD. No entanto, se não existem preocupações de contaminação, uma placa LB regular pode ser substituído.

1. Pesar 5,5 g de ágar XLD e ressuspender em 5 ml de água deionizada.
2. Misture bem até que todo o agar é molhado. Adicionar 95 ml de água deionizada até que todos os pedaços se foram e o meio é completamente em suspensão.
3. Ferva o meio para dissolver completamente (não autoclave).
4. Arrefece-se o meio à temperatura ambiente e 50 ° C.
5. Verter 25 mL de agar em cada um 95 x 15 mm (diâmetro x altura) da placa (placas seladas com Parafilm pode ser armazenado a 4 ° C durante até 1 mês).

2. Nematode Crescimento Médio (NGM) RNAi Alimentando Plates

Preparação de C. elegans placas NGM foi descrito anteriormente ¹9. Aqui um procedimento é descrito resumidamente a adicionar o antibiótico ampicilina e a RNAi indutor químico isopropílico β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) para o meio de NGM para fazer as placas de alimentação de RNAi.

1. Dissolve-se 3 g de NaCl e 2,5 g de Bacto peptona em 1 L de água desionizada.
2. Adicione 17 g de ágar Bacto na mídia.
3. Autoclave a media durante 45 min e arrefecer a mídia para 50 ° C em um banho de água.
4. Adicionar as seguintes soluções: 1 ml de colesterol (5 mg / ml em etanol a 95%), 1 mL de 1 M de _CaCl2, 1 ml 1 M _MgSO4, e tampão de fosfato de potássio 25 ml 1 M (pH 6,0). Misture bem.
5. Adicionar 1 ml de 1 M de IPTG e 500 ul de ampicilina (100 mg / ml em água esterilizada).
6. Misturar a solução bem e despeje em 60 x 15 mm (diâmetro x altura) placas de Petri usando uma pipeta Aid e 25 ml de pipeta sorológica seguintes procedimentos estéreis. Encha cada placa com 12 ml de ágar. As placas podem ser armazenadas a 4 ° C durante até 1 mês.

3. Prepare tratados com RNAi Animais para a Infecção

O gene essencial autofagia bec-1 é utilizado como um exemplo para examinar a função de um gene hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. Os procedimentos experimentais são ilustradas na Figura 1 e Tabela 1. O protocolo para a preparação de animais tratados em RNAi para infecção segue, com o dia de cada passo experimental dado entre parênteses.

1. Inocular bec-1 RNAi alimentação e controlar o vector vazio L4440 RNAi bactérias alimentação pela colocação de um floco de -80 ° C bactérias congeladas em 2 ml de meio LB suplementado com 100 mg / ml de ampicilina (Dia 1). Repita este passo uma vez por semana, durante todo o experimento ter bactérias RNAi frescos. Armazenar a cultura no frigorífico a 4 ° C quando não usado.
2. Semente 100 ml de cultura bacteriana durante a noite RNAi em placas de RNAi. Prepare três bec-1 RNAi e três controle vazio vEctor placas de RNAi. Incubar as placas a 37 ° C durante a noite (dia 2).
3. Remova as placas de RNAi da 37 ° C incubadora e deixe esfriar até a temperatura ambiente no banco. Pegue bem alimentados L4 tipo selvagem hermafroditas N2 e transferi-los para bec-1 RNAi e controlar placas RNAi vetores vazios. Coloque três vermes por placa, em placas triplicadas. No mesmo dia, para preparar as placas de RNAi, como descrito no passo 3.2 (Dia 3).
4. Incubar as placas de RNAi com vermes na incubadora a 20 ° C durante 36-40 hr e de transferência de vermes para placas frescas de RNAi correspondentes preparados no passo 3.3. Depois de vermes são transferidos, incubar as placas no 20 ° C incubadora por 64 horas (dia 4).

4. Prepare Salmonella para a Infecção

1. Streak Salmonella -80 ° C lote congelado em 1 placa de ágar XLD e incubar a placa a 37 ° C durante a noite (dia 5 ).
2. Escolha bem isolado preto colónia de Salmonella e inocula-lo em 2 ml de meio LB a 37 ° C com agitação durante a noite (dia 6).
3. Semente de 80 ml ​​de cultura de uma noite de Salmonella em 1 de C. elegans 60 x 15 mm (diâmetro x altura) placa de ágar NGM e preparar 6 pratos no total. Incubar as placas à temperatura ambiente durante 6 horas. A cultura bacteriana deve secar e formar um relvado sobre a placa (dia 7).

5. Worms tratados com RNAi Infect com Salmonella

1. Transferir bec-1 e controle de vetores vazios tratados com RNAi hermafroditas L4 N2 (progênie de minhocas criadas no passo 3) para placas de Salmonella tratados com RNAi. Colocar 40 vermes por placa em 3 placas para cada grupo. Incubar as placas sem-fim, a 20 ° C durante 48 h (Dia 7).
2. Prepare um conjunto de placas de RNAi frescos como descrito nos passos 3.1 e 3.2 (dia 7 e Dia 8).
3. Após 48 horas de infecção, transferir vermes infectadas com Salmonella às placas correspondentes RNAi preparados na etapa 5.2 e incubar a 20 ° C (dia 9).

6. Ensaio de sobrevivência

1. Marque a sobrevivência dos vermes diária e transferir worms para frescas correspondentes placas de RNAi durante o tempo de postura. Preparar um conjunto de novas placas de RNAi, antes de cada transferência de sem-fim, tal como descrito nas etapas 3.1 e 3.2. Toque o corpo verme (cabeça, parte intermediária e cauda) delicadamente com um fio de platina achatado-end. Um worm é marcado como morto se nenhum movimento do corpo verme é observada.
2. Marque a sobrevivência dos vermes diárias ou em dias alternados, e transferir para vermes frescas correspondentes placas de RNAi duas vezes por semana depois de vermes parar de pôr ovos.
3. Depois de todos os vermes morrem, reunir os dados de sobrevivência de placas triplicadas como um conjunto de dados. Introduza os dados de sobrevivência de cada grupo em software estatístico adequado, como GraphPad PRISM para gerar curvas de sobrevivência e para realizar a análise de sobrevida de Kaplan-Meier. Toda a experiência foi repetida pelo menos uma vez para confirmar a conclusão.

Resultados

A 20 ° C, o tempo de vida médio de tipo selvagem vermes N2 de 17 dias (Figura 2A e Tabela 2). Infecção por Salmonella diminui significativamente o tempo de vida médio de vermes N2 a 10,5 dias (p = 0,0002, teste de log-rank) (Figura 2A ).

Se um C. elegans gene desempenha um papel importante na defesa contra a infecção por Salmonella, prevê-se que a sua inibição irá conferir susceptibilidade à infecção ...

Discussão

C. elegans é um simples organismo modelo genético que se alimenta de bactérias como fonte de nutrientes. Assim, é fácil de substituir a sua comida bacteriana normal com um patógeno intestinal para investigar as interações entre C. elegans e o agente patogénico escolhido. Nisto um protocolo é descrito combinar infecção por Salmonella e C. elegans RNAi alimentando tratamento para examinar o papel dos genes do hospedeiro na defesa contra a infecção por Salmonella. ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL