感染するためのプロトコル<em&gt;線虫（Caenorhabditis elegans）</em&gt;と<em&gt;ネズミチフス菌</em

要約

線虫は、宿主-病原体相互作用を研究するための新しい遺伝モデルとして登場しました。ここでは、 温度を感染させるためのプロトコルを記述サルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の役割を調べるために二重鎖のRNAi干渉法と結合ネズミチフス菌とエレガンス 。

要約

過去10年間で、C.虫は、グラム陰性菌、ネズミチフス菌に対する宿主防御を含め、ホストと病原体との相互作用を研究する無脊椎生物として浮上している。サルモネラはCの腸内で持続感染を確立虫や感染した動物の早期死亡をもたらす。免疫機構の数はCで同定されているサルモネラ感染に対して防御する虫 。オートファジー、進化的に保存されたリソソーム分解経路は、C.におけるサルモネラの複製を制限することが示されている虫と哺乳類における。ここで、プロトコルは、C.に感染することが記載されているヒトにおけるサルモネラ感染と同様のワームが、限られた時間のサルモネラに暴露されたネズミチフス菌 、 線虫と、 サルモネラ感染が著しくC.の寿命を短くする虫</ EM>。一例として、必須の自食作用遺伝子ベック-1を使用して、我々はC.、この感染法を組み合わせたRNAiは、 線虫のアプローチを供給し、このプロトコルはC.の機能を調べるために使用することができる示しサルモネラ感染に対する防御において宿主遺伝子エレガンス 。 C.以来虫全ゲノムのRNAiライブラリが利用可能であり、このプロトコルは、包括的で物をスクリーニングすることが可能になるサルモネラおよびゲノムワイドのRNAiライブラリを使用して、他の腸内の病原体から守る遺伝子エレガンス 。

概要

自由生活土壌線虫線虫（Caenorhabditis elegans）は、多くの生物学的な質問を研究するために使用されるシンプルかつ遺伝的に扱いやすいモデル生物である。C.虫が支配的自己施肥雌雄同体として存在する。雄配偶子形成を自発的に^1,2の間にX染色体の非論理和によって生成される。豊富な食べ物、Cの存在下で虫は継続的に、成人に4幼虫の段階を経て発達する。温度も影響を与えるC.虫の開発;迅速な開発は、より高い温度で観察される。研究室では、C.エレガンスは、食品^1,2播種し、細菌大腸菌 （菌株OP50）を含む寒天プレート上で20℃の標準温度で培養する。

過去10年間で、C.虫は宿主-病原体相互作用^3-5を研究する無脊椎生物として浮上している。自然界では、C.虫は nutrienなどの細菌を食べるトン源^1,2。その通常の細菌の実験室フード、OP50は、容易C.間の相互作用を調べるために他の病原体で置換することができる虫や任意の選択された病原体。これらの条件下で、腸の感染の主要部位である。実際に、細菌性病原体の広い範囲が致死的にC.に感染することが示されている虫 ^3-5。

グラム陰性菌のサルモネラは、世界中の^6,7人の食中毒の原因となる胃腸病原体である。C.この細菌は、複製し、持続的な腸の感染症^8月10日を示すもの虫はネズミチフス菌のための優れたモデルホストです。 でエレガンスは、新規の両方を識別するために使用されていると以前から知られているサルモネラ病原性は^、11因子 。興味深いことに、C.虫の免疫系は正常にサルモネラの複製が制限されます。それはそのInhibが以前に報告されているオートファジー遺伝子のitionはCで増加サルモネラの複製をレンダリング虫 、感染したワーム¹⁰の早い死に至る。マクロオートファジーは、（本明細書オートファジーと呼ばれる^）12分解のためにリソソームへの送達のための細胞質および細胞小器官を隔離する細胞内膜の転位を伴う動的プロセスである。オートファジーは、C.においてサルモネラの複製を制限することが報告されている虫や哺乳類^10,13中。

C.虫のゲノムを配列決定し最初の多細胞真核生物ゲノムた。それは、RNAi治療^14〜16に応答する。また、RNAiは、RNAiが^16,17に供給として知られている標的遺伝子の二本鎖RNAを含む細菌を摂取するワームを施すことにより効果的に投与することができる。全ゲノムのRNAi送りライブラリは、ゲノムワイドなRNAiは^16,18をスクリーニングするために生成されている。ここでは、 サルモネラ感染症のプロトコールは、RNAiがC.をテストできるように、給紙に結合されているサルモネラ感染に対して防御する能力について、目的の遺伝子エレガンス 。

プロトコル

1。XLD（キシロースリジンデソキシコール）寒天プレート

XLD寒天はXLD寒天プレート上で黒色コロニーとして現れるサルモネラ、のための選択的成長培地である。汚染の心配がない場合は、正規のLBプレートは、置換されていてもよい。

1. 5ミリリットルの脱イオン水に5.5グラムのXLD寒天再懸濁を量る。
2. すべての寒天が濡れてまでよく混ぜる。すべての塊がなくなっているとメディアが完全に再懸濁されるまで脱イオン水を95ミリリットルを追加します。
3. （オートクレーブしないでください）​​、完全に溶解する媒体が沸騰。
4. 50℃の室温で培地を冷却
5. 各95×15ミリメートル（直径×高さ）プレート（パラフィルムでシールしたプレートを1ヶ月まで4℃で保存することができる）中の25mlの寒天を注ぐ。

2。線虫増殖培地（NGM）RNAiは、プレートの餌付け

Cの準備エレガンス NGMプレートは、以前に記載されている¹9ここでの手順を簡単にするRNAi送り板を作るためにNGM培地に抗生物質アンピシリンおよびRNAi化学誘導物質イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を添加することが記載されている。

1. 3グラムのNaClおよび1 Lの脱イオン水に2.5グラムバクトペプトンを溶かす。
2. メディアへの17グラムバクト寒天を追加します。
3. 45分間オートクレーブし、メディアを水浴中で50℃に媒体を冷却する。
4. を1mlのコレステロール（95％エタノール中5 mg / ml）を1 mlの1 MのCaCl _2、1 mlの1 MのMgSO _4、および25 mlの1 Mリン酸カリウム緩衝液（pH6.0）：以下の溶液を加える。よく混ぜる。
5. 1ミリリットルの1M IPTGおよび500μlのアンピシリン（滅菌水に100ミリグラム/ ml）を追加します。
6. よく溶液を混合し、滅菌手順に従ってピペットで援助と25ミリリットルの血清学的ピペットを用いて60×15ミリメートル（直径×高さ）ペトリ皿に注ぐ。 12ミリリットル寒天で各プレートを埋める。プレートを、1ヶ月まで4℃で保存することができる。

3 "jove_title」。感染のRNAiの処置動物を準備します

ベック-1オートファジー必須遺伝子はサルモネラ感染に対する防御における宿主遺伝子の機能を調べるために例として使用される。実験手順は、 図1および表1に示されている。感染についてのRNAi処理動物を調製するためのプロトコルは、括弧内に与えられた各実験手順の日に、続く。

1. BEC-1のRNAi摂食に接種し、100 mg / mlのアンピシリン（1日目 ）を補足した2ミリリットルのLB培地には-80℃で凍結した細菌フレークを配置することによって、空のベクターL4440のRNAi摂食細菌を制御します。新鮮なRNAiの細菌を持っている全体の実験中に週一回、この手順を繰り返します。使用しない場合は4℃の冷蔵庫に文化を保存してください。
2. RNAiのプレート上で一晩のRNAi細菌培養の100ミリリットルをシード。 3 BEC-1 RNAiおよび3コントロールの空のVを準備RNAiのプレートをエクター。 37℃で一晩（2日目 ）でプレートをインキュベートする。
3. 37℃のインキュベーターからのRNAiプレートを取り外し、それらをベンチに室温まで冷却する。よく葉L4野生型N2雌雄同体をピックアップし、RNAiを1にBECと空ベクターのRNAiプレートを制御するためにそれらを転送します。三連のプレートに、プレート当たり3ワームを配置します。ステップ3.2（3日目 ）に記載したのと同じ日に、RNAiのプレートを準備します。
4. 36〜40時間、20℃のインキュベーター内のワームとのRNAiプレートをインキュベートし、ステップ3.3で作成新鮮対応のRNAiプレートにワームを転送します。ワームが転送された後、64時間（4日目 ）、20℃のインキュベーター中でプレートをインキュベートする。

4。感染のサルモネラを準備

1. ストリークサルモネラ -80℃で凍結した1 XLD寒天プレート上の在庫と一晩（5日目 、37℃でプレートをインキュベート）。
2. よく孤立黒サルモネラコロニーを採取し、（6日目 ）で一晩振とうしながら37℃で2 mlのLB培地中で、それを接種。
3. 1 Cの種子80ミリリットルサルモネラ一晩培養虫 60×15ミリメートル（直径×高さ）NGM寒天プレート、計6枚を準備。 6時間室温で培養する。細菌培養プレート（7日目 ）に芝生を乾燥させ、形成すべきである。

5。 サルモネラとのRNAi治療ワームに感染

1. BEC-1のRNAi処理を移し、 サルモネラプレートに空のベクターのRNAi治療L4のN2雌雄同体（ステップ3で設定したワームの子孫）を制御する。各グループの3プレートにプレート当たり40ワームを配置します。 48時（7日目 ）、20℃でワームのプレートをインキュベートする。
2. ステップ3.1および3.2（7日目で説明したように、新鮮なRNAiプレートの1セットを準備し、 8日目）。
3. 48時間の感染後、ステップ5.2で作成、対応するRNAiプレートにサルモネラ菌に感染したワームを転送し、20℃（9日目 ）でインキュベートする。

6。生存アッセイ

1. 日々のワームの生存をスコアと産卵期間中に新鮮な対応のRNAiプレートにワームを転送します。ステップ3.1および3.2で説明したように前に各ワーム転送に新鮮なRNAiプレートのセットを準備します。エンド平坦化白金線で軽くワーム本体（頭部、中間部と尾）をタッチします。ワームの体の動きが全く観察されない場合にワームが死んだとして採点される。
2. 日々のワームの生存または一日おきのスコア、およびワームが産卵を停止した後に週二回、新鮮対応するRNAiプレートにワームを転送します。
3. すべてのワームが死んだ後、1​​データセットとして三重プレートからの生存データをプールする。例えば、グラフパッドPなどの適切な統計ソフトウェアへの入力の各群の生存データを生存曲線を生成し、Kaplan-Meier生存分析を実行するRISM。全実験は結論を確認するために、少なくとも1回繰り返される。

結果

20℃では、野生型N2ワームの中央値は寿命が17日間（ 図2Aおよび表2）である。 サルモネラ感染が有意に10.5日（P = 0.0002、log-rank検定）にN2ワームの中央値の寿命を低下させる（ 図2（a） ）。

C.もし線虫遺伝子はサルモネラ感染に対する防御において重要な役割を果たし、それはその阻害はサルモネラ?...

ディスカッション

線虫は、栄養源としてバクテリアを食べて、単純な遺伝的モデル生物である。従って、C.間の相互作用を調査するために、腸病原体にその正常細菌食品を代用することは容易である虫および選択した病原体。本明細書プロトコルは、 サルモネラ感染およびC.を組み合わせることが記載されているRNAiは、 サルモネラ感染に対する防御における宿?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
LB Broth	Fisher	BP9723-500
XLD agar	EMD Chemicals	1.05287.0500
Bacto Agar	Fisher	DF0140-01-0
Peptone	Fisher	BP1420-500
Sodium Chloride	Fisher	S671-500
Calcium Chloride	Fisher	C69-500
Magnesium Sulfate	Fisher	M65-500
IPTG	Gold Biotechnology	12481C50
Cholesterol	Sigma	C8667-25G
Ampicillin	Fisher	BP1760-25
Salmonella typhimurium	ATCC	ATCC14028
Petri Dish 95 x 15 mm	Fisher	FB0875714G
Petri Dish 60 x 15 mm	Fisher	08-757-13A
Falcon Serological pipet	Fisher	13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid	Fisher	13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator	Thermo Scientific	SHKE6000-7
Incubator	Percival	I-36DL