JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Abstract

אחת השאלות החשובות באקולוגיה של חיידקים הוא "מי נמצא שם?" שאלה זו ניתן לענות באמצעות כלים שונים, אבל אחד מסטנדרטי זהב לטווח הארוך הוא רצף amplicons 16S RNA ריבוזומלי גן (rRNA) שנוצרה על ידי ברמת תחום PCR תגובות הגברה מהדנ"א הגנומי. באופן מסורתי, זה בוצע על ידי שיבוט וסנגרתי (אלקטרופורזה נימים) רצף של amplicons PCR. כניסתו של רצף של הדור הבא פישטה מאוד והגדילה את עומק הרצף לסידור של גני 16S rRNA. כניסתה של מרצפים המעבדתיים עכשיו מאפשרת מעבדות קטנות לבצע רצף rRNA 16S שלהם בבית בעניין של ימים. כאן, גישה לרצף amplicon גן 16S rRNA באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא מפורטת. DNA הסביבתי מוגבר לראשונה על ידי PCR באמצעות פריימרים המכילים מתאמי רצף וברקודים. אז הם מצמידים את חלקיקים כדוריים באמצעות תחליב PCR. החלקיקים הם loaded על שבב חד פעמי והשבב מותקן במכונת הרצף לאחר שהרצף מתבצע. רצפי תאוחזרנה בפורמט fastq, מסונן וברקודים משמשים להקמת חברות במדגם של הקורא. מסונן וזרק לפח כניסות לאחר מכן ניתח נוסף תוך שימוש בכלים זמינים בפומבי. ניתוח דוגמא שבה קורא סווגו עם אלגוריתם מציאת-טקסונומיה בתוך חבילת תוכנת Mothur הוא נתון. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה, זולה ופשוט, וצריכה לעזור למעבדות קטנות יותר כדי לנצל מהמהפכה הגנומי המתמשכת.

Introduction

רצף metagenomic הוא טכנולוגיה מאוד חזקה כפי שהוא מתמקד בשלמותו של המידע הגנטי הכלול במדגם סביבתי. יש טעמים שונים של רצף metagenomic, כוללים רצף רובה ציד, ספריות גדולות להוסיף ורצף amplicon. רצף Amplicon מציע את היתרון של להיות זול יחסית, מהיר ומסוגלים לייצר קורא מאזור הגנומי יחיד שיכול להיות מתואם בדרך כלל. בנוסף, זרימת העבודה ניתוח נתונים עבור סידור amplicon בעיקר טופל. עם זאת, מאחר שהוא מבוסס על PCR, יש לו את כל ההטיות הקשורים לייחוד שלם, כיסוי חלקי ופריימר מטה את 1,2, מה שהופך את הגישה זו חצי כמותית, במקרה הטוב. מספר אזורים הגנומי יכולים להיות ממוקדים עבור סידור amplicon כוללים גנים פונקציונליים, אבל האפשרויות הפופולריות ביותר הן להשתמש בגני סמן כגון גן 16S rRNA כדי ליצור פרופיל קהילה. באופן מסורתי, seque amplicon גן 16S rRNAncing בוצע תוך שימוש בטכניקות עבודה אינטנסיביות שכללו שיבוט בE. coli, קטיף מושבה והפקת פלסמיד ואחריו סנגר רצף על פלסמידים המבודדים, וכתוצאה מכך, רוב המחקרים ניתחו לדגימה פחות מ -100 שיבוטים. רצף של הדור הבא הביא שתי התקדמות גדולה: במקביל מסיבית של תגובות ברצף, והכי חשוב, הפרדה משובט של תבניות ללא הצורך להכניס שברי גנים במארח. זה פישט מאוד את הרצף של amplicons גן 16S rRNA, שנמצא עכשיו בחזרה כתכונה שגרתית של לימודי מיקרוביולוגיה הסביבתית רבים, וכתוצאה מכך "רנסנס" עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 3.

מאז כניסתו של רצף רוש 454 ב2005 4, מספר טכנולוגיות רצף של הדור הבא אחרות הופיעו בשוק (למשל, Illumina, מוצק, PacBio). לאחרונה, את ההקדמה של רצף ספסל העליוןrs הובא למעבדות קטנות קיבולת הרצף פעם אחת בלעדית למרכזי רצף גדולים. חמש מכונות benchtop זמינות כעת: GS Junior 454, אישי הגנום מכונת יון Torrent (PGM) ופרוטון, ומיסק Illumina וNextSeq 500. בעוד שכל מרצפים אלה מציעים פחות קוראים לריצה ופחות בסיסים לדולר ממה שרוב המשרה מלאה מרצפי קנה מידה, הם יותר גמישים, מהירים, ועלויות הרכישה והפעלתם נמוכות הופכים אותם במחיר סביר עבור מעבדות אקדמיות קטנות. מרצפים המעבדתיים במיוחד מתאימים גם לamplicon, הגנום קטן ורצף metagenome נמוכות מורכבות בלימודי מיקרוביולוגיה סביבתיות, כי זה סוג של לימודים בדרך כלל אינו דורש עומק קיצוני של רצף. לדוגמא, אותו יש הסכמה כללית כי לסידור של גני 16S rRNA חוקר את מספר קורא לדגימה הוא לא בעל חשיבות עליונה, כ~ 1,000 קורא יכול ליצור את אותם דפוסים כמרובים מיליון קוראים מערכי נתונים 5. אחרי שאמר את זה, הבא generatio המעבדתיים n sequencers עדיין מייצר כמויות גדולות של נתונים ברצף, עם תשואות מקסימליים של ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (יון Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (יון Torrent פרוטון), ~ 10 Gbp (Illumina מיסק) ו~ 100 Gbp (Illumina הבא Seq 500), וזה יותר ממספיק עבור רוב מחקרי מיקרוביולוגיה הסביבתיים.

רצף של הדור הבא של amplicons 16S rRNA באמצעות מרצפים המעבדתיים הוחל לאחרונה למגוון רחב של סביבות. לדוגמא, יון Torrent PGM היה בשימוש כבר קהילת ניתוחים של שבבים מכרה אורניום שהיו גבוה במיוחד pH ונמוכים חדירות 6, הסירקולציה מחודשת מערכות חקלאות ימית 7, של קרקעות הארקטי מזוהם פחמימנים 8,9, של משקעים מושפעים כריית חולות נפט ו biofilms מנהר Athabasca 10,11, של rhizosphere של עצי ערבה ניטעו בקרקעות מזוהמות 12, של גופות אדם ובעלי חי 13-16 ושל מעכלים אנאירוביים 17.

jove_content "> בפירוט אנו תרומה זו הגישה שלנו לרצף amplicons גן 16S rRNA בתוך הבית באמצעות המעבדתיים ברצף של הדור הבא (יון Torrent PGM). לאחר מיצוי DNA, גני 16S rRNA הם מוגברים באמצעות פריימרים חיידקים ברמת תחום המכילים מתאמי רצף ורצפים ייחודיים, מדגם ספציפי (ברקודים). amplicons הם מטוהרים, לכמת ונקוו ביחס equimolar. אז הדגימות נקוו הם מוגברות clonally בתחליב PCR ורצף. רצפי כתוצאה מכך הם ניתחו באמצעות כלים ביואינפורמטיקה זמינים לציבור ( למשל, Mothur).

Protocol

.1 16S rRNA ג'ין Amplicon ספריית הכנה על ידי שיטת Fusion

  1. להפשיר פריימרים (קדימה, F343-Iona-MIDXX: 5'- CAT CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG T AC CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; הפוך, R533-IonP1: 5'- CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; נועזים: מתאמים ספציפיים יון Torrent; נטוי: מפתח לקביעת רצף לכיול עוצמת אות בתחילת ריצת הרצף; גופן רגיל: פריימרים ייחודיים לתבנית; X ... X: 10 רקוד נ"ב, ראה טבלה 1 לכמה רצפים ברקוד), תערובת מאסטר 2x HotStartTaq פלוס והדגימות. מערבבים היטב לפני השימוש, פרט לתערובת ההורים שצריכים להיות מעורבים בעדינות.
  2. להכין תערובת PCR (20 תגובות μl) עם 0.5 מיקרומטר של פריימר ההפוכה, 0.4 מ"ג / מ"ל ​​של סרום שור Albumine (BSA) ומיקס מאסטר 1x HotStartTaq פלוס. הוספת 18.5 μl של מיקס מאסטר לדוארצינור ACH PCR.
  3. הוסף פריימר קדימה (0.5 μl ב20 מ"מ) עם ברקוד שונה לכל אחת מהדגימות שיהיה רצף ביחד. הוסף 1 μl של מדגם (1-10 ng / μl) לצינור PCR.
  4. מניחים את הצינורות במכונה PCR ולהפעיל את התכנית הבאה: denaturation הראשוני ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 25 מחזורים של 95 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות ו72 מעלות צלזיוס למשך 45 שניות; התארכות סופית 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR על 4 מעלות CO / N או קפוא עד שימוש.

.2 Amplicon טיהור, כימות ואיגום

  1. הכן 2% agarose ג'ל באמצעות המסרקים הגדולים ביותר זמינים. הוסף 5 μl של טעינת צבע ג'ל 6x לתגובה ועומס על הג'ל, הפרדה כל דגימה על ידי ריק גם. הפעל את הג'ל על 70 V ל50 דקות.
  2. קח תמונה של ג'ל ולחתוך את הרצועות (גודל צפוי סביב 250 נ"ב: מוצר נ"ב 190 תוספת 63 מתאמים נ"ב ורקודים) באמצעות אזמל נקי.
  3. לשקול את הלהקות נכרתה ולהמשיך בחילוץ ג'ל וטיהור של מוצרי PCR (עם לדוגמא, ערכת Qiaquick חילוץ ג'ל).
  4. לכמת כל מוצר PCR עם PicoGreen ולעשות דילולים להשיג פתרון מניות ב5 x 10 9 מולקולות / μl (כ 1 ננוגרם / μl). אם כמה דוגמאות להראות הגברה נמוכה יותר, להתאים את דילולים לריכוז נמוך יותר, תוך התחשבות כי הריכוז הנמוך ביותר המתאימים לנהלים הבאים הוא 1.57 x 10 7 מולקולות / μl (26 PM).
  5. בריכת 10 μl של כל מוצר PCR מדולל כדי לקבל בריכת equimolar של דגימות. הכן בריכה נפרדת אחד עבור כל אחד מריצת הרצף המתוכננת. יכולים להיות כל הזמן מוצרי PCR נקוו במקפיא עד שימוש.

.3 אמולסיה PCR ורצף

  1. לבצע PCR תחליב:
    1. לדלל את מוצרי PCR ונקוו ל26 PM בנפח של 25 μl. ריאגנטים הפשרה מערכת תבנית יון PGM.
    2. מכין את תערובת תחליב PCR (ריאגנטים המסופקים בערכה) במנדף PCR ולהוסיף מוצרים ויקוו PCR וחלקיקי הכדור (בתנאי) על הספסל. מערבבים היטב ומכניס את התערובת במחסנית מסנן ולמעלה בזהירות עם שמן תחליב (בתנאי).
    3. לאט לאט להפוך את מחסנית המסנן ועומס על מנגנון התחליב האוטומטי PCR (למשל, Touch 2 מכשיר יון אחת). בחר את התכנית המתאימה ולהתחיל את ההליך.
  2. לאחר התחליב האוטומטי PCR השלים, להסיר את supernatant מצינורות האיסוף ואחזור חלקיקי הכדור בחלק התחתון של הצינורות. Resuspend התחומים של פתרון לשטוף (מסופק בערכה) 100 μl ולקחת aliquot 2.0 μl לכימות ספרייה.
  3. בצע כימות הספרייה.
    1. מערבבים של חיץ SSPE (150 mM NaCl, 10mm 4 Napo, 1 המ"מ Na 2 -EDTA) עם 2 μl של מתאם B'-Fam (5'- FAM -CT 100 μlG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') בדיקה ו2 μl של המתאם-Cy5 (5'- CAT Cy5 -CCA TCT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3') בדיקה. הוספת 52 μl של תערובת זו לaliquot 2.0 μl נלקח בשלב 3.2 ולהוסיף 2 μl של פתרון לשטוף (מערכת התבנית) ל52 μl שנותר כריק כדי לכמת.
    2. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות. העבר את תערובת בצינורות 1.5 מ"ל.
    3. הוספת 1.0 מ"ל של חיץ TEX (10 מ"מ טריס, 1 mM EDTA, 0.01% טריטון X-100, pH 8.0), לערבב וצנטריפוגות ב XG 15,500 עבור 3 דקות ב RT. הסר את supernatant ולהשאיר 20 μl בצינור אחד. חזור על תהליך זה הכביסה שתי פעמים.
    4. הוספת 180 μl של חיץ TEX, resuspend חלקיקי טבליות ולהעביר לתוך 500 צינורות קיוביט μl.
    5. למדוד הקרינה לFAM וCy5 באמצעות מנגנון קיוביט ולחשב את היחס של תחומים חיוביים באמצעות המחשבון ניתן למצוא באתר יון הקהילה.
  4. להעשיר את שארית חלקיקי הכדור לתחומים חיוביים (המכילים DNA המוגבר) באמצעות מערכת אוטומטית להעשרה (לדוגמא, מערכת העשרת Touch יון אחת).
    1. ריאגנטים Pipet בבארות המתאימות של רצועת 8 היטב סיפקה: ובכן 1: חלקיקי תחום משלב 3.2; ובכן 2: מראש שטף חרוזים MyOne streptavidin C1 (13 μl); ובכן 3, 4 ו -5: פתרון לשטוף (מסופק בערכת התבנית); ובכן 6: ריק; ובכן 7: להמס-off פתרון (125 מ"מ NaOH, 0.1% Tween 20); ובכן 8: ריק.
    2. התקן טיפ על זרוע pipetting וצינור 0.2 מ"ל לאיסוף דגימה. התחל המכשיר. בסופו של ההעשרה, להוסיף 10 μl לנטרל פתרון (בתנאי). יכולים להישמר חרוזים המועשר 4 ° C. עד 15 ימים.
  5. לאתחל את המכשיר לקביעת רצף:
    1. להתחבר למכשיר לקביעת רצף ולהכין תכנית ריצת רצף, המפרטים את הפרטים של ריצת הרצף.
    2. Install פתרון לשטוף # 2 (מסופק בערכת רצף יון PGM), פתרון לשטוף # 1 (350 μl 100 מ"מ NaOH) והפתרון האוטומטי pH החיץ (מסופק).
    3. התחל את הליך האתחול וכאשר תתבקש להוסיף dATP, dGTP dCTP ונוקלאוטידים dTTP (בתנאי) ב50 מ"ל צינורות המיוחסים להם. הברג את הצינורות על מכונת הרצף ולהמשיך את הליך האתחול. כאשר האתחול הושלם, להתחיל הליך הריצה באופן מיידי.
  6. הכן דגימות עבור סידור ולטעון את השבב:
    1. לאסוף את הכדורים מועשרים מצעד 3.4 בחלק התחתון של הצינור על ידי צנטריפוגה ב15,500 XG ל1.5 דקות. הסר את supernatant עוזב בדיוק 3 μl.
    2. הוסף 3 μl של פריימר רצף (מסופק בערכת הרצף), ומערבב היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה כדי resuspend החלקיקים. דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, לאחר מכן על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    3. הוסף 1 μl של פולימראז (בתנאי), מערבב היטב וincubאכלתי בRT במשך 5 דקות. המשך לטעון את תערובת אנזים-כדור על שבב הרצף בתוך 30 דקות.
    4. במהלך דגירה, לטעון את שבב הרצף ברצף ולבצע בדיקת איכות שבב. הסר את הנוזל מהשבב על ידי צנטריפוגה ולטעון את המדגם בשבב על ידי pipeting באיטיות במורד תערובת אנזים-הכדור (7 μl) והימנעות כניסתה של בועות בשבב.
    5. צנטריפוגה השבב שלוש פעמים דקות 1 בmicrocentrifuge. שנה את הכיוון של השבב בכל צנטריפוגה ומערבבים על ידי pipetting למעלה ולמטה בין כל ריצה.
    6. טען את השבב במכשיר ולהתחיל לרוץ.

ניתוח .4 יסוד רצף נתונים

  1. להתחבר לשרת נתונים הרצף ולהוריד את קובץ fastq. צור קובץ מופרד באמצעות טאבים "oligos" המכיל את מידע פריימר וברקוד (ראה דוגמא בטבלה 1). הורד את קבצי התייחסות Greengenes מהמוותאתר חור (http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline).
  2. הפעל Mothur ולבצע ניתוחים:
    1. להמיר את קובץ fastq לfasta וקובץ באיכות באמצעות הפקודה הבאה: fastq.info (fastq = test.fastq)
    2. לקבוע את החברות בקבוצה של כל רצף ולקצץ את הרצפים באמצעות הפקודה הבאה: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, qfile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, MINLENGTH = 150, keepforward = T)
    3. ניתן לשנות האפשרויות השונות בהתאם לחומרה הרצויה
    4. לסווג את הרצפים בטקסונומיה greengenes באמצעות הפקודה הבאה: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, שיטה = wang, קבוצה = test.groups, תבנית = gg_99_otus.fasta, טקסונומיה = gg_99_otus.tax, הפסקת = 50)

תוצאות

לאחר הטיהור בג'ל, עם 25 מחזורים של PCR הגברה, מוצרי ההגברה הם בדרך כלל בריכוז של .2-10.0 ng ב50 μl מים. זה עשוי להשתנות במידה רבה בהתאם לריכוז מתחיל DNA, הסוג של מדגם וערכת הטיהור משמשת. מומלץ לשמור את מספר מחזורי PCR לנמוך ביותר האפשרי כדי למנוע היווצרות הכימרה ולהקטין הטיות הגברה, תוך התחשבות כי כל הדגימות צריכה להיות מוגברות תוך שימוש באותו מספר המחזורים. כדי למזער את מספר polyclonal קוראת ותחומים ריקים ומקסם את מספר קורא, יחס קיוביט צריך להיות בין 0.1 ו0.3 וקרינת FAM צריכה להיות מעל 200. שימוש שבב 314 על יון Torrent PGM, התפוקה הממוצעת היא בסביבות 0.3-0.5 באיכות טובה M קוראת אחרי הסינון של התוצאות בMothur. טבלה 2 מראה התפלגות טיפוסית של מספר קורא אחרי כל צעד של ההליך לריצה המכילה 36 Environ המרובבדגימות נפשיות מוגברות עם פריימרים מיקוד אזור V3-4 של 16S ונותחו באמצעות Mothur. בMothur, הליך trim.seqs ליצור קובץ "* .trim.fasta" המכיל את הרצפים שעברו את מסנני איכות ו" * .scrap.fasta "המכיל את הרצפים שלא עברה את מסנני האיכות יחד עם הסיבה לדחייה בכותרת הרצף. כשהוא מוזן ברקודים בקובץ "oligos", בפקודה זו תהיה גם ליצור קובץ "* .groups" המכיל את החברות בקבוצתו של כל רצף המבוסס על הרצף ברקוד. Classify.seqs ההליך יוצר ".tax.summary" שניתן לפתוח בExcel. קובץ זה מכיל הסיכום של ההשתייכות הטקסונומית (בשורות) לכל אחת מהדגימות (בעמודות). קובץ זה יכול לשמש לניתוחים סטטיסטיים במורד הזרם וכדי להמחיש הרכב קהילה ברמות טקסונומיות שונות. קובץ ".taxonomy" מכיל הטקסונומית מפורטתהשתייכות לכל רצף. הרכב הקהילה הממוצע ברמת המיון הצמחי / כיתה בכל 36 הדגימות מוצג באיור 1.

figure-results-1678
איור 1 הרכב הקהילה ממוצע ברמת המיון הצמחי / המעמד מעבר לכל דוגמאות.

קדימה TACGGRAGGCAGCAG
ברקוד CTAAGGTAAC Sample01
ברקוד TAAGGAGAAC Sample02
ברקוד AAGAGGATTC Sample03
ברקוד TACCAAGATC Sample04
ברקוד CAGAAGGAAC Sample05
ברקוד CTGCAAGTTC Sample06
ברקוד TTCGTGATTC Sample07
ברקוד TTCCGATAAC Sample08
ברקוד TGAGCGGAAC Sample09
ברקוד CTGACCGAAC Sample10

דוגמא 1 "oligos" קובץ שולחן לשימוש בMothur.

# של קורא % משלב קודם ממוצע. לדגימה
מספר הבארות 1262519 - 35,070
ולס עם חרוזים 1114108 88.20% 30947
חרוזים עם תבניות 1112746 99.90% 30910
חרוזים חד שבטיים 826805 74.30% 22967
איכות טובה קוראת (יציאה מהרצף) 782204 94.60% 21728
Pass Mothur מסננים (דקות. ממוצע. ציון איכות של 20 מעל חלון -50 נקודתי בסיס, דקות. אורך של 150bp) 372168 47.60% 10,338
מסווג ברמת המיון הצמחית בGreenGenes (50% סף ביטחון) 342171 91.90% 9505
מסווג ברמת המשפחה בGreenGenes (50% סף ביטחון) 316512 92.50% 8,792
מסווג ברמת הסוג בGreenGenes (50% סף ביטחון) 289899 91.60% 8053

מספר 2 בטבלה של כניסות המופקים מריצה אופיינית ל36 דגימות סביבתיות multiplexed על אחד שבב יון Torrent 314.

Discussion

השיטה המוצגת כאן היא פשוטה ולא יקרה, וצריכה לאפשר מעבדות רבות כדי לגשת לכוחו של רצף metagenomic. למרות שזה משתנה בהתאם לפלטפורמת הרצף בשימוש, פעם אחת הספריות בנויות על ידיים מעט מאוד זמן נדרש, עם רוב של התהליך automatized. עבור פלטפורמת הרצף משמשת כאן (יון Torrent PGM), ההליך המלא ניתן לבצע בתוך שני ימי העבודה. ברגע הכתיבה (ספטמבר 2013), עלויות מגיב הקשורים לדוגמא המפורטת לעיל היו כדלקמן: הגברה של 36 דגימות PCR: $ 25, quantitation טיהור ג'ל וPicoGreen DNA של 36 דגימות: $ 125, תחליב PCR למדגם amplicon נקווה אחד : $ 150 וריאגנטים רצף: $ 250, עבור הסכום כולל של 550 $ או 15 $ למדגם או 0.0015 $ לקריאה מסונן באיכות. מחיר זה אינו כולל מכשיר חוזה שירות, פחת מכשיר, שכר טכנאי ושימוש בשטח מעבדה.

אוהל "> אחד הצעדים החשובים ביותר הוא לאגם את כל המוצרים ביחס equimolar, כדי לאחזר מספר דומה של קורא לכל אחת מהדגימות. כימות PicoGreen שימש כאן, אלא בשיטות אחרות עשויות להיות מתאימות, אם כי פחות מדויק (למשל, כימות UV, כימות מבוסס ג'ל). גם על ידי עושה כימות ואיגום מדויקים ביותר, יש כמה השתנות במספר קורא לדגימה, ובטווח האופייני המפורטים בטבלה 2, זה נע בין 4,380 ל 32,750 קורא, עם ממוצע של 10,338 קורא. אם עיבוד מספר גדול של דגימות (יותר מ 40-50), ניתן להחליף טיהור ג'ל עמודה אחת על ידי טיהור ג'ל בחרוזי צלחת או טיהור באמצעות עם הפסקת גודל מחמיר (למשל, חרוזים AMPure) .

נכון להיום, טכנולוגיית הריצוף של הדור הבא ביותר בשימוש לגן 16S rRNA היא 454. טכנולוגיית ריצוף יון Torrent שימוש בפרוטוקול זה באופן רעיוני דומה מאודל454 ושני הטכנולוגיות נוטות לאותו הסוג של טעויות רצף. באופן לא מפתיע, זה היה הראה כי רצף יון Torrent הביא תוצאות רצף דומות מאוד ל454 רצף 10. לאחרונה, חוקרים רבים בחנו את השימוש בטכנולוגית Illumina עבור סידור amplicon גן 16S rRNA 18,19. בכל מקרה, זה יהיה קל להתאים את הפרוטוקול הנוכחי למרצפים המעבדתיים אחרים כמו מיסק Illumina או 454 GS Junior על ידי שינוי רצפי פריימר ההיתוך כדי להתאים את המתאמים ורקודים דרושים לטכנולוגיות רצף אלה, כמו בשיטה שתואר לאחרונה לIllumina מיסק 19. לחלופין, חוקרים יכולים בצע את השלבים 1 ו -2 של הפרוטוקול המפורט כאן ולשלוח amplicons נקוותה למרכז רצף שבו התחליב PCR וסדר היה להתבצע.

גן 16S rRNA כניסות היו גזוז ומסווג באמצעות Mothur, אבל יכולים להתבצע על הרבה ניתוחים אחריםamplicons גן 16S rRNA. לדוגמא, גיוון בטא יכול להיות מוערך על ידי חישוב מרחקי Unifrac בין כל זוג מדגם באמצעות ההליך המתואר בhttp://unifrac.colorado.edu/ 20. מדדי גיוון אלפא ומספר יחידות מיון שונים מבצעיות של כל דגימה יכולים להיות מחושבים באמצעות כלים בתוך QIIME כמו AmpliconNoise 21 או באמצעות ההליך המתואר על ידי Huse et al. 22 וזמינים בתוך Mothur.

פריימרים משמשים כאן מוגברים האזורים משתנים 3 ו -4 מגן 16S rRNA, אבל יכולים להיות ממוקדים אזורים רבים אחרים. במחקר נוכחי, גני 16S rRNA היו מוגברים מחומר צמחי והבחירה של פריימר נעשתה כדי למנוע הגברה של הכלורופלסט 16S rRNA גן 23,24. יש מגוון רחב של צבעי יסוד זמינים אחרים המשתנים בטווח של אורך המוצר, כוח הטקסונומי ו25,26 תועלת. עם זאת, בכל המקרים 200-400 נ"ב קורא של גן 16S rRNA לא יכול להיות מסווג באופן אמין, ברמת המין, וניתוחים מוגבלים לסוג ורמות מיון השונים גבוהות יותר. גנים אחרים יכולים להיות מתאימים יותר אם יש צורך במידע ברמת מינים, כמו גני cpn60 וrpoB 27,28. טיפות דרסטית בעתיד בעלות של רצף ועלייה בכוחם של כלים אנליטיים עשויות לעשות את זה אפשרי להחליף לסידור של גני 16S rRNA על ידי metagenomics רובה, אבל עד אז סידור של גני 16S rRNA נשאר סטנדרטי למיקרוביולוגיה הסביבתית זהב.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ion 314 Chip Kit v2Life Technologies4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2Life Technologies4482006
Ion PGM Template OT2 200 KitLife Technologies4480974
HotStarTaq Plus Master Mix KitQiagen203646
Primers and probesIDTNA
Qiaquick Gel Extraction KitQiagen28704
BSA 20 mg/mlRoche10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001

References

  1. Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
  2. Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
  3. Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
  4. Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
  5. Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
  6. Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
  7. Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
  8. Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
  9. Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
  10. Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
  11. Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
  12. Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
  13. Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
  14. Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
  15. Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
  16. Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
  17. Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
  19. Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
  20. Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
  21. Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
  22. Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
  23. Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
  24. Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
  25. Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
  26. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
  27. Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
  28. Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

90metagenomics16S RNAAmplicon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved