JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Аннотация

Одним из основных вопросов в микробной экологии является "кто там?" Этот вопрос может быть решен с помощью различных инструментов, но один из долговечных золотых стандартов является для секвенирования 16S рибосомальной РНК (рРНК) генные ампликоны генерируемых на уровне домена ПЦР реакции усилительные из геномной ДНК. Традиционно, это выполняется путем клонирования и Sanger (капиллярного электрофореза) секвенирования ПЦР ампликонов. Появление следующего поколения секвенирования была чрезвычайно упрощены и увеличил глубину секвенирования для 16S рРНК секвенирования генов. Введение настольных секвенсорами теперь позволяет небольших лабораторий для выполнения их 16S рРНК последовательности в доме в течение нескольких дней. Здесь подход к 16S рРНК гена ампликон секвенирования с использованием настольных следующего поколения секвенсор подробно. Окружающей ДНК первого амплифицировали с использованием праймеров, которые содержат секвенирования адаптеры и штрих-коды с помощью ПЦР. Затем они соединены с помощью сферических частиц эмульсии ПЦР. Частицы лтины на одноразовой чипа и чип вставляется в секвенирования машины, после чего выполняется последовательность. Последовательности извлекаются в fastq формате, фильтруют и штрих-коды используются для установления членства образец читает. Фильтровали и Binned считывает затем дополнительно анализируют с использованием публично доступных средств. Примером анализ, где читает были классифицированы с таксономии алгоритма поиска в рамках программного пакета Mothur дается. Метод описанный здесь является простой, недорогой и простой и должны помочь меньшие лаборатории воспользоваться от продолжающегося геномной революции.

Введение

Метагеномных секвенирование очень мощная технология, как это предназначается полноту генетической информации, содержащейся в окружающей образца. Существуют различные ароматы метагеномной секвенирования, включая дробовика секвенирования, большой-вставки библиотек и ампликон секвенирования. Ампликона последовательность имеет то преимущество, чтобы быть относительно недорогим, быстрым и способны производить считывает из одного геномной области, которые могут быть как правило, на одной линии. Кроме того, рабочий процесс анализа данных для ампликон секвенирования в основном стандартизированы. Однако, поскольку он основан на ПЦР, у него есть все предубеждения, связанные с неполной специфичностью, неполного охвата и грунтовки смещает 1,2, что делает этот подход полуколичественную в лучшем случае. Несколько геномные регионы могут быть направлены для ампликон секвенирования включая функциональных генов, но самые популярные варианты использования маркерных генов, таких как гена 16S рРНК генерировать профиль сообщества. Традиционно, 16S рРНК гена ампликон Sequencing проводили с использованием трудоемких методов, которые включены в E. клонирование палочка, колонии сбор и извлечение плазмиду затем Sanger последовательности на изолированных плазмид, и, следовательно, в большинстве исследований анализировали меньше, чем 100 клонов на образец. Секвенирование следующего поколения принесли две основные достижения: массивный распараллеливание реакций секвенирования и, самое главное, клональную разделение шаблонов без необходимости вставлять фрагменты генов в хозяине. Это упростило чрезвычайно секвенирование 16S рРНК генов ампликонов, который сейчас еще в рутинной особенность многих исследований экологической микробиологии, в результате чего «ренессанс» для 16S рРНК гена ампликон секвенирования 3.

С появлением Roche 454 секвенирования в 2005 4, несколько другие технологии следующего поколения секвенирования появились на рынке (например, Illumina, Solid, PacBio). Совсем недавно, введение последовательности настольногоRS принесла малому лабораторий потенциала секвенирования раз исключительно для крупных секвенирования центров. Пять настольные машины в настоящее время доступны: 454 GS Младший, Ion Torrent Личная Геном машина (PGM) и Протон, и Illumina MiSeq и NextSeq 500 В то время как все эти секвенсоры предлагают менее читает за перспективе и меньшим количеством баз за доллар, чем большинство Full- масштабные секвенсоры, они более гибкие, быстро, и их низкие приобретения и запуска расходы делают их доступными для малых академических лабораториях. Стационарные секвенсоры особенно хорошо подходят для ампликоне, небольшой геном и низкой сложностью метагенома секвенирования в исследованиях окружающей среды микробиологии, потому что этот тип исследований, как правило, не требует крайнюю глубину секвенирования. Например, это общее мнение, что для 16S рРНК секвенирование гена изучает количество просмотров за образец не первостепенное значение, как ~ 1000 читает может генерировать те же закономерности, как несколько миллионов читает наборов данных 5. Сказав, что, настольный следующего Generatio н секвенсоры еще генерировать большие объемы данных последовательности, с максимальных урожаев ~ 35 Мбит (454 GS Младший), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 фунтов стерлингов (Ion Torrent Протон), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) и ~ 100 GBP (Illumina Следующая Seq 500), что более чем достаточно для большинства экологических исследований микробиологических.

Следующего поколения последовательности 16S рРНК ампликонов с помощью настольных секвенсеры недавно был применен в самых разнообразных условиях. Например, Ion Torrent PGM был использован для сообщества анализы урановых хвостохранилищ, которые имели особенно высокий рН и низкую проницаемость 6, циркуляционного систем аквакультуры 7, углеводородных загрязненных арктических почвах 8,9, из нефтеносных песков горно пострадавших отложений и биопленки от реки Атабаска 10,11, из ризосферы ивы, посаженных в загрязненных почв 12, из органов человека и животных 13-16 и в анаэробных реакторов 17.

jove_content "> В этом вклад, который мы подробно наш подход к последовательности 16S рРНК генов ампликоны в доме с помощью настольной следующего поколения секвенсор (Ion Torrent PGM). После выделения ДНК, генов 16S рРНК усиливаются с помощью уровня домена бактериальных праймеров, которые содержат секвенирования адаптеры и уникальные, последовательности выборки конкретных (штрих). ампликонов очищают, количественно и объединяли в эквимолярном соотношении. Собранные пробы затем клонально усиливается в эмульсии ПЦР и последовательность. Полученные последовательности анализируются с помощью общедоступных средств биоинформатики ( например, Mothur).

протокол

1 16S рРНК генов Amplicon Библиотека Подготовка к Fusion Method

  1. Оттепель праймеров (вперед, F343-Иона-MIDXX: 5'CCA TCT CAT CCC ТГК GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; обратное, R533-IonP1: 5'ССТ СТС ТАТ GGG CAG TCG GTG НА TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; смелые: конкретные адаптеры Ion Torrent; курсив: ключ секвенирование для калибровки интенсивности сигнала в начале секвенирования перспективе; шрифтом: шаблон-специфических праймеров; X ... X: 10 б.п. штрих см таблицу 1 для некоторых штрих последовательностей), мастер микс 2x HotStartTaq Плюс и образцы. Тщательно перемешать перед использованием, для мастер-смеси, которые должны быть осторожно перемешивали исключением.
  2. Готовят смесь ПЦР (20 мкл реакции) с 0,5 мкМ обратного праймера, 0,4 мг / мл бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 1x HotStartTaq Plus Master Mix. Добавить 18,5 мкл из мастер-микс на адресACH ПЦР трубки.
  3. Добавить прямого праймера (0,5 мкл при 20 мм) с другим штрих-кода для каждого из образцов, которые будут секвенированы вместе. Добавить 1 мкл образца (1-10 нг / мкл) в ПЦР-пробирку.
  4. Место труб в машине ПЦР и выполните следующую программу: начальная денатурация при 95 ° С в течение 5 мин; 25 циклов 95 ° С в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 72 ° C в течение 45 сек; Окончательное удлинение при 72 ° С в течение 10 мин. ПЦР-продукты могут храниться при температуре 4 ° CO / N или заморожены до использования.

2 Amplicon Очистка, количественная оценка и Объединение

  1. Приготовьте 2% агарозном геле, используя крупнейшие расчески доступны. Добавить 5 мкл 6x гель загрузки красителя к реакции и нагрузки на геле, разделения каждого образца на пустой хорошо. Запустите гель при 70 V в течение 50 мин.
  2. Сфотографируйте геля и сократить полосы (ожидаемый размер около 250 б.п.: 190 б.п. продукт плюс 63 б.п. адаптеры и штрих-кодов), используя чистую скальпель.
    3. Взвесьте вырезанные полосы и приступить к добыче гель и очистки продуктов ПЦР (с, например, Qiaquick гель Добыча комплекте).
  3. Количественная каждый продукт ПЦР с PicoGreen и сделать разведения для получения исходного раствора на 5 х 10 9 молекул / мкл (примерно 1 нг / мкл). Если некоторые образцы показывают более низкую усиление, отрегулируйте разведения в более низкой концентрации, имея в виду, что низкая концентрация подходит для последующих процедур является 1,57 х 10 7 молекул / мкл (26 часов вечера).
  4. Бассейн 10 мкл каждого разбавленного продукта ПЦР, чтобы получить эквимолярного пул проб. Подготовьте отдельный бассейн для каждого из запланированных секвенирования перспективе. Объединенные продукты ПЦР можно хранить в морозильнике до использования.

3 Эмульсия ПЦР и секвенирование

  1. Выполните эмульсии ПЦР:
    1. Развести объединенных продуктов ПЦР в 26 вечера в объеме 25 мкл. Оттепель реагенты из матрицы комплекте Ion PGM.
    2. Подготовьте эмульсии ПЦР смеси (реагентов, полученных в комплекте) в капюшоном ПЦР и добавьте объединенных продуктов ПЦР и частицы сфера (прилагаются) на скамейке. Тщательно перемешать и вставьте смесь в картридже фильтра и тщательно началу эмульсионной нефти (прилагается).
    3. Медленно повернуть вспять картридж фильтра и нагрузку на автоматизированные эмульсии ПЦР аппарата (например, Ion One Touch 2 прибора). Выберите соответствующую программу и начать процедуру.
  2. После автоматизированной эмульсии ПЦР завершена, удалить супернатант из трубок сбора и извлечения частиц сфера в нижней части труб. Ресуспендируют сферы в 100 мкл промывочного раствора (при условии, в комплекте) и взять 2,0 мкл аликвоту для библиотеки количественного.
  3. Выполните библиотеки количественное.
    1. Смешать 100 мкл ГНПП буфера (150 мМ NaCl, 10 мМ NaPO 4, 1 мМ Na 2 -ЭДТА) с 2 мкл адаптер b'-Fam (5'FAM-ctG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') зонд и 2 мкл адаптер A-Cy5 (5'Cy5 -CCA TCT CAT CCC ТГК GTG TCT CCG ACT CAG-3') зонд. Добавить 52 мкл этой смеси в 2,0 мкл аликвоты, взятой в шаге 3.2 и добавить 2 мкл промывочного раствора (из комплекта шаблонов) для остальных 52 мкл как заготовки для количественного определения.
    2. Инкубируют при 95 ° С в течение 2 мин, а затем при 37 ° С в течение 2 мин. Перенесите смеси в 1,5 мл пробирки.
    3. Добавить 1,0 мл TEX буфера (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, 0,01% Triton X-100, рН 8,0), перемешивают и центрифугируют при 15500 х г в течение 3 мин при комнатной температуре. Удалить супернатант и оставить 20 мкл в каждую пробирку. Повторите эту процедуру промывки два раза.
    4. Добавить 180 мкл TEX буфера, ресуспендируйте гранулированные частицы и передать в 500 мкл кубита труб.
    5. Измерьте флуоресценции для FAM и Cy5 помощью кубита аппарат и вычислить отношение положительных сферах с помощью калькулятора, доступных на веб-сайте Ion Community.
  4. Пополните оставшуюся часть частиц сфере при положительной сферах (содержащие усиленный ДНК) с использованием автоматизированной системы обогащения (например, System Обогащение Ion One Touch).
    1. Внесите реагенты в соответствующие лунки предоставленной полосы 8-а: Ну 1: частицы сферы от этапа 3.2; Ну 2: предварительно промытой бусы MyOne Стрептавидин C1 (13 мкл); Ну 3, 4 и 5: промывочного раствора (в комплекте для шаблона); Ну 6: пусто; Хорошо 7: расплава от раствора (125 мМ NaOH, 0,1% Tween 20); Ну 8: пусто.
    2. Установите наконечник на пипетирующем руку и 0,2 мл трубку для отбора проб. Запустите инструмент. В конце обогащения, добавить 10 мкл нейтрализующего раствора (прилагается). Обогащенный бусины могут быть 4 ° C в течение 15 дней.
  5. Инициализировать секвенирования инструмент:
    1. Подключение к секвенирования инструмента и подготовить план последовательности выполнения, указав детали секвенирования перспективе.
    2. Instalл промывочного раствора # 2 (при условии, в комплекте секвенирования Ион PGM), промывочного раствора # 1 (350 мкл 100 мМ NaOH), и раствор буфера автоматического рН (при условии,).
    3. Начните процедуру инициализации и при появлении запроса добавить дАТФ, дГТФ дЦТФ и дТТФ нуклеотидов (входит в комплект) в своих 50 мл пробирок. Винт трубки на секвенирования машины и продолжить процедуру инициализации. Когда инициализация завершена, немедленно начать процедуру запуска.
  6. Подготовка проб для секвенирования и загрузить чип:
    1. Сбор обогащенные сферы с шага 3,4 на дне пробирки центрифугированием при 15500 х г в течение 1,5 мин. Удалить супернатант, оставляя ровно 3 мкл.
    2. Добавить 3 мкл секвенирующего праймера (при условии, в комплекте секвенирования), тщательно перемешать с помощью пипетки вверх и вниз, чтобы ресуспендировать частицы. Инкубируют при 95 ° С в течение 2 мин, а затем при 37 ° С в течение 2 мин.
    3. Добавить 1 мкл полимеразы (прилагается), хорошо перемешать и incubели в РТ в течение 5 мин. Продолжать загружать фермент-сферы смеси на чипе секвенирования в течение 30 мин.
    4. Во время инкубации, загрузить чип секвенирования на секвенсор и выполнить проверку качества чип. Удалить жидкость из чипа центрифугированием и загрузить образец в чипе, медленно вниз пипетировать смесь фермента-сферы (7 мкл) и избежать введение пузырьков в чипе.
    5. Центрифуга чип три раза в течение 1 мин в микроцентрифуге. Изменение ориентации чипа на каждом центрифугированием и перемешать с помощью пипетки вверх и вниз между каждым перспективе.
    6. Загрузите чип в приборе и начать работать.

Анализ 4 Basic Последовательность данных

  1. Подключитесь к серверу данных секвенирования и скачать файл fastq. Создание "олиго" файл с разделителями табуляции, содержащий информацию грунтовки и штрих-кода (смотрите пример в таблице 1). Скачать справочные файлы Greengenes от Motсайт Гур ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
  2. Запустите Mothur и выполнять анализы:
    1. Преобразуйте файл fastq к FASTA и файл качества с помощью следующей команды: fastq.info (fastq = test.fastq)
    2. Определите членство в группе каждой последовательности и отделка последовательности с помощью следующей команды: trim.seqs (FASTA = test.fasta, олиго = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T)
    3. Различные варианты могут быть изменены в соответствии с жесткостью желаемого
    4. Оцените последовательности в систематике greengenes с помощью следующей команды: classify.seqs (FASTA = test.trim.fasta, метод = Ван, группа = test.groups, шаблон = gg_99_otus.fasta, систематика = gg_99_otus.tax, отсечки = 50)

Результаты

После очистки на геле, с 25 циклов ПЦР-амплификации, продукты амплификации, как правило, при концентрации 0.2-10.0 нг в 50 мкл воды. Это может широко варьировать в зависимости от исходного концентрации ДНК, типа образца и набора для очистки используется. Рекомендуется, чтобы количество циклов ПЦР до минимально возможного, чтобы избежать образования химеры и уменьшить усиления предубеждений, имея в виду, что все образцы должны быть усилены с помощью того же количества циклов. Чтобы свести к минимуму количество поликлональных читает и пустые сферы и максимально увеличить количество операций чтения, отношение Кубит должно быть между 0,1 и 0,3 и флуоресценция FAM должна быть выше 200 человек, используя чип 314 на ионном Torrent PGM, средняя выработка составляет около 0,3-0,5 М хорошее качество читает после фильтрации результатов в Mothur. Таблица 2 показывает типичное распределение числа операций чтения после каждого этапа процедуры для бега, содержащей 36 мультиплексированную ENVIRONпсихические образцы усиливается с помощью праймеров ориентированных на V3-4 регион из 16S и проанализированы с помощью Mothur. В Mothur, процедура trim.seqs создать файл "* .trim.fasta", содержащий последовательности, которые прошли качественные фильтры и "* .scrap.fasta", которая содержит последовательности, которые не прошли качества фильтров с указанием причины для отказа в заголовке последовательности. При поставке с штрих-кодами в "олигонуклеотидов" файла, эта команда также генерирует "* .groups" файл, содержащий членство в группе любой последовательности на основе последовательности штрих. Процедура classify.seqs генерирует ".tax.summary", который можно открыть в Excel. Этот файл содержит краткую информацию о таксономии принадлежности (в линиях) для каждого из образцов (в столбцах). Этот файл может быть использован для последующих статистических анализов и визуализировать сообщества состав на различных таксономических уровнях. Файл ".taxonomy" содержит подробную таксономическиепринадлежностью для каждой последовательности. Состав средняя сообщество на уровне филюм / класса во всех 36 образцах показано на рисунке 1.

figure-results-2260
Рисунок 1. средний состав сообщества на уровне филюм / класса во всех образцах.

вперед TACGGRAGGCAGCAG
штрих-код CTAAGGTAAC Sample01
штрих-код TAAGGAGAAC Sample02
штрих-код AAGAGGATTC Sample03
штрих-код TACCAAGATC Sample04
штрих-код CAGAAGGAAC Sample05
штрих-код CTGCAAGTTC Sample06
штрих-код TTCGTGATTC Sample07
штрих-код TTCCGATAAC Sample08
штрих-код TGAGCGGAAC Sample09
штрих-код CTGACCGAAC Sample10

Таблица 1 Пример "олиго" файл для использования в Mothur.

Количество просмотров % От предыдущего шага Средняя. по образцу
Количество скважин 1262519 - 35070
Скважины с бисером 1114108 88.20% 30947
Бусы с шаблонами 1112746 99.90% 30910
Моноклональные бусины 826805 74.30% 22967
Хорошее качество читает (Выход из секвенсор) 782204 94.60% 21728
Pass Mothur фильтры (мин. Ср. Качества оценка от 20 над окном 50 б.п., мин. Длина 150 б.п.) 372168 47.60% 10338
Доска на уровне Тип в GreenGenes (50% доверительный порог) 342171 91.90% 9505
Доска на уровне семьи в GreenGenes (50% доверительный порог) 316512 92.50% 8792
Доска на уровне родов в GreenGenes (50% доверительный порог) 289899 91.60% 8053

Таблица 2 Количество читателей производится из типичного эксперимента для 36 проб окружающей среды, мультиплексированной на одном Ion Torrent 314 чипе.

Обсуждение

Метод, представленный здесь прост и недорог, и должны позволить многие лаборатории для доступа силу метагеномной секвенирования. Хотя это зависит от секвенирования платформы используется, когда библиотеки строятся очень маленькие практический времени требуется, при этом большая часть процесса, автоматизировать. Для секвенирования платформы используется здесь (Ion Torrent PGM), завершена процедура может быть выполнена в течение двух дней работы. На момент написания (сентябрь 2013), расходы реагентов, связанные с, например, подробно выше были следующие: ПЦР-амплификации 36 образцов: $ 25, очистка гель и PicoGreen ДНК количественное 36 образцов: $ 125, эмульсия ПЦР для одной объединенной пробы ампликон : $ 150 и секвенирования реагенты: $ 250, в общей сложности $ 550 или $ 15 за образец или $ 0,0015 за качеством фильтруют чтения. Эта цена не включает в себя контракт Прибор Сервис, амортизация инструмента, техник зарплату и использование лабораторных помещений.

палатки "> Одним из наиболее важных шагов, чтобы объединить все продукты в эквимол рном соотношении, с тем чтобы получить такое же количество просмотров для каждого из образцов. PicoGreen количественное был использован здесь, но другие методы могут быть пригодны, но менее точным (например, УФ-количественное, гель на основе количественного). Даже делая наиболее точную количественную и объединение, есть некоторые различия в количестве читает на образец, и в типичном перспективе, указанные в таблице 2, она колеблется от 4380 до 32750 читает, с в среднем 10 338 просмотров. Если обработки большого количества образцов (более 40-50), очистка гель один столбец можно заменить очисткой на геле в листах или очистки с помощью шариков с жесткими размера отсечки (например, бусины AMPure) .

На сегодняшний день, наиболее часто используемых технологий секвенирования следующего поколения для гена 16S рРНК является 454. Ion Torrent технология секвенирования использовали в этом протоколе концептуально очень похожидо 454, и обе технологии склонны к тому же типу ошибок последовательности. Не удивительно, что было показано, что ионная Торрент последовательности привело к результатам секвенирования, очень похожих на 454 последовательности 10. В последнее время многие исследователи исследовали использование технологии Illumina для 16S рРНК гена ампликон секвенирования 18,19. В любом случае, это было бы легко приспособить текущий протокол для других настольных секвенсорами как Illumina MiSeq или 454 GS Junior, путем изменения последовательности синтеза праймеров, чтобы соответствовать адаптеры и штрих-коды, необходимые для этих технологий секвенирования, как в методе недавно описал для Illumina MiSeq 19. Кроме того, исследователи могли выполните шаги 1 и 2 протокола подробно здесь и отправить Объединенные ампликоны к секвенирования центра, где будет выполнена эмульсия ПЦР и секвенирования.

Гена 16S рРНК чтения были обрезаны и классифицированы с помощью Mothur, но и многие другие анализы могут быть выполнены на16S рРНК генов ампликоны. Например, бета-разнообразие может быть оценена путем расчета расстояния Unifrac между каждой парой образца с использованием процедуры, описанной в http://unifrac.colorado.edu/ 20. Альфа индексы разнообразия и ряд оперативных таксономических единиц каждого образца можно рассчитать, используя инструменты в QIIME как AmpliconNoise 21 или с помощью процедуры, описанной на Huse и др. 22 и доступен в Mothur.

Праймеры, используемые здесь усиливается вариабельных областей 3 и 4 от гена 16S рРНК, но и многие другие регионы могли бы быть направлены. В настоящем исследовании, 16S рРНК генов амплифицировали из растительного материала и выбор праймера было сделано, чтобы избежать амплификации хлоропласт 16S рРНК гена 23,24. Есть множество других праймеров доступных, которые изменяются в перспективе длины продукта, таксономической власти и полезности 25,26. Тем не менее, во всех случаях 200-400 б.п. читает гена 16S рРНК не может быть надежно классифицировать на видовом уровне, и анализ ограничен к роду и высших таксономических уровнях. Другие гены могут быть более подходящим, если информация об уровне видов необходим, как cpn60 и гроВ генов 27,28. Будущие резкие перепады стоимости секвенирования и увеличивается в силе аналитических инструментов может сделать возможным заменить 16S рРНК гена секвенирование по дробовик Metagenomics, но до тех пор 16S рРНК секвенирование гена не остается золотым стандартом экологической микробиологии.

Раскрытие информации

The authors have nothing to disclose.

Благодарности

Development of the method presented here has been carried out with various sources of funding, including Genome Canada and Genome Quebec, Environment Canada STAGE program and internal NRC funds.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Ion 314 Chip Kit v2Life Technologies4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2Life Technologies4482006
Ion PGM Template OT2 200 KitLife Technologies4480974
HotStarTaq Plus Master Mix KitQiagen203646
Primers and probesIDTNA
Qiaquick Gel Extraction KitQiagen28704
BSA 20 mg/mlRoche10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1Life Technologies65001

Ссылки

  1. Sipos, R., et al. Addressing PCR biases in environmental microbiology studies. Methods Mol. Biol. 599, 37-58 (2010).
  2. Schloss, P. D., et al. Reducing the effects of PCR amplification and sequencing artifacts on 16S rRNA-based studies. PLoS ONE. 6, e27310 (2011).
  3. Tringe, S. G., Hugenholtz, P. A renaissance for the pioneering 16S rRNA gene. Curr. Opin. Microbiol. 11, 442-446 (2008).
  4. Margulies, M., et al. Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors. Nature. 437, 376-380 (2005).
  5. Kuczynski, J., et al. Microbial community resemblance methods differ in their ability to detect biologically relevant patterns. Nat. Methods. 7, 813-819 (2010).
  6. Bondici, V. F., et al. Microbial communities in low-permeability, high pH uranium mine tailings: characterization and potential effects. J. Appl. Microbiol. 113, 1671-1686 (2013).
  7. Auffret, M., et al. Impact of water quality on the bacterial populations and off-flavours in recirculating aquaculture systems. FEMS Microbiology Ecology. 84, 235-247 (2013).
  8. Bell, T. H., Yergeau, E., Juck, D., Whyte, L. G., Greer, C. W. Alteration of microbial community structure affects diesel biodegradation in an Arctic soil. FEMS Microbiol. Ecol. 85, 51-61 (2013).
  9. Bell, T. H., et al. Predictable bacterial composition and hydrocarbon degradation in Arctic soils following diesel and nutrient disturbance. ISME J. 7, 1200-1210 (2013).
  10. Yergeau, E., et al. Next-generation sequencing of microbial communities in the Athabasca River and its tributaries in relation to oil sands mining activities. Appl. Environ. Microbiol. 78, 7626-7637 (2012).
  11. Yergeau, E., et al. Aerobic biofilms grown from Athabasca watershed sediments are inhibited by increasing bituminous compounds concentrations. Appl. Environ. Microbiol. 79, 7398-7412 (2013).
  12. Yergeau, E., et al. Microbial expression profiles in the rhizosphere of willows depend on soil contamination. ISME J. 8, 344-358 (2013).
  13. Deagle, B. E., et al. Quantifying sequence proportions in a DNA-based diet study using Ion Torrent amplicon sequencing: which counts count. Mol. Ecol. Resour. 13, 620-633 (2013).
  14. Milani, C., et al. Assessing the fecal microbiota: an optimized Ion Torrent 16S rRNA gene-based analysis protocol. PLoS ONE. 8, e68739 (2013).
  15. Jünemann, S., Prior, P., Szczepanowski, R., Harks, I., Ehmke, B., Goesmann, A., Stoye, J., Dag Harmsen, . Bacterial community shift in treated periodontitis patients revealed by Ion Torrent 16S rRNA gene amplicon sequencing. PLoS ONE. 7, e41606 (2012).
  16. Petrof, E., et al. Stool substitute transplant therapy for the eradication of Clostridium difficile infection: 'RePOOPulating' the gut. Microbiome. 1, 3 (2013).
  17. Whiteley, A. S., et al. Microbial 16S rRNA Ion Tag and community metagenome sequencing using the Ion Torrent (PGM) Platform. J. Microbiol. Meth. 91, 80-88 (2012).
  18. Caporaso, J. G., et al. Ultra-high-throughput microbial community analysis on the Illumina HiSeq and MiSeq platforms. ISME J. 6, 1621-1624 (2012).
  19. Kozich, J. J., et al. Development of a dual-index sequencing strategy and curation pipeline for analyzing amplicon sequence data on the MiSeq Illumina sequencing platform. Appl. Environ. Microbiol. 79, 5112-5120 (2013).
  20. Hamady, M., et al. Fast UniFrac: facilitating high-throughput phylogenetic analyses of microbial communities including analysis of pyrosequencing and PhyloChip data. ISME J. 4, 17-27 (2010).
  21. Quince, C., et al. Removing noise from pyrosequenced amplicons. BMC Bioinformatics. 12, 38 (2011).
  22. Huse, S. M., et al. Ironing out the wrinkles in the rare biosphere through improved OTU clustering. Environ. Microbiol. 12, 1889-1898 (2010).
  23. Edwards, J. E., et al. Characterization of the dynamics of initial bacterial colonization of nonconserved forage in the bovine rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 62, 323-335 (2007).
  24. Rastogi, G., et al. A PCR-based toolbox for the culture-independent quantification of total bacterial abundances in plant environments. J. Microbiol. Methods. 83, 127-132 (2010).
  25. Baker, G. C., et al. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55, 541-555 (2003).
  26. Schloss, P. D. The effects of alignment quality, distance calculation method, sequence filtering, and region on the analysis of 16S rRNA gene-based studies. PLoS Comput. Biol. 6, e1000844 (2010).
  27. Links, M. G., et al. The chaperonin-60 universal target Is a barcode for bacteria that enables de novo assembly of metagenomic sequence data. PLoS ONE. 7, e49755 (2012).
  28. Vos, M., et al. Comparison of rpoB and 16S rRNA as markers in pyrosequencing studies of bacterial diversity. PLoS ONE. 7, e30600 (2012).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

90Metagenomics16SAmplicon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены