La nouvelle génération de séquençage de l'ARN ribosomal 16S gènes amplicons

Résumé

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Résumé

L'une des grandes questions de l'écologie microbienne est "qui est là?" Cette question peut être répondue en utilisant divers outils, mais l'une des règles d'or de longue durée est de séquencer amplicons 16S ARN ribosomique (ARNr) de gènes générées par PCR au niveau du domaine Les réactions d'amplification de l'ADN génomique. Traditionnellement, cela a été réalisé par clonage et Sanger (électrophorèse capillaire) séquençage des amplicons PCR. L'avènement de séquençage de nouvelle génération a énormément simplifié et une augmentation de la profondeur de séquençage pour le séquençage du gène de l'ARNr 16S. L'introduction de séquenceurs de paillasse permet maintenant de petits laboratoires à effectuer leur séquençage 16S de l'ARNr en interne dans une affaire de jours. Ici, une approche pour l'ARNr 16S séquençage de l'amplicon du gène en utilisant une paillasse de séquenceur de nouvelle génération est détaillé. L'ADN de l'environnement est d'abord amplifié par PCR en utilisant des amorces qui contiennent des adaptateurs de séquençage et des codes barres. Ils sont ensuite couplés à des particules sphériques émulsion via PCR. Les particules sont de loaded sur une puce jetable et la puce est insérée dans la machine de mise en séquence, après quoi le séquençage est effectué. Les séquences sont récupérés sous forme fastq, filtrées et les codes à barres sont utilisés pour déterminer la composition des échantillons du lit. Le filtré et mis en cellule lectures sont ensuite analysées en outre l'utilisation des outils accessibles au public. Une analyse de l'exemple où lectures ont été classés avec un algorithme de taxonomie trouver dans le logiciel mothur est donnée. La méthode décrite ici est simple, peu coûteux et simple et devrait aider les petits laboratoires de profiter de la révolution génomique en cours.

Introduction

Séquençage métagénomique est une technologie très puissante car il vise l'ensemble de l'information génétique contenue dans un échantillon environnemental. Il ya différentes saveurs de séquençage métagénomique, y compris le séquençage de fusil de chasse, les bibliothèques de grande insertion et le séquençage de l'amplicon. le séquençage de l'amplicon offre l'avantage d'être relativement peu coûteux, rapide et capable de produire des lectures d'une région génomique unique qui peut être généralement alignée. En outre, le flux de données pour l'analyse de séquençage de l'amplicon a été normalisé. Cependant, puisqu'il est basé sur la PCR, il a tous les biais liés à la spécificité incomplète, couverture incomplète et amorce sollicite ^1,2, ce qui rend cette approche semi-quantitative au mieux. Plusieurs régions génomiques peuvent être ciblés pour le séquençage de l'amplicon y compris les gènes fonctionnels, mais les options les plus populaires sont d'utiliser des gènes marqueurs tels que le gène de l'ARNr 16S pour générer un profil de communauté. Traditionnellement, l'ARNr 16S gène amplicon Sequencing a été réalisée en utilisant des techniques à forte intensité de main-d'œuvre qui comprenait le clonage dans E. coli, la cueillette et l'extraction des colonies de plasmide suivie d'un séquençage Sanger sur les plasmides isolés, et, par conséquent, la plupart des études analysé moins de 100 clones par échantillon. Séquençage de nouvelle génération a apporté deux avancées majeures: la parallélisation massive des réactions de séquençage et, surtout, la séparation clonale des modèles sans avoir besoin d'insérer des fragments de gènes dans un hôte. Cela a simplifié considérablement le séquençage d'amplicons du gène ADNr 16S, qui est maintenant de retour en tant que caractéristique courante de nombreuses études de microbiologie de l'environnement, résultant en une «renaissance» pour l'ARNr 16S amplicon du gène séquençage ^3.

Depuis l'avènement de Roche 454 séquençage en 2005 ^4, plusieurs autres technologies de séquençage de nouvelle génération sont apparus sur le marché (par exemple, Illumina, solide, PacBio). Plus récemment, l'introduction de la séquence de paillassers portées à petits laboratoires de la capacité de séquençage fois exclusif de grands centres de séquençage. Cinq machines stationnaires sont actuellement disponibles: la 454 GS Junior Ion Torrent Personal Genome automatique (PGM) et Proton, et l'Illumina MiSeq et NextSeq 500 Bien que toutes ces séquenceurs offrent moins de lectures par cycle et moins de bases pour chaque dollar que la plupart à temps plein séquenceurs d'échelle, ils sont plus souples, rapides, et leurs coûts d'acquisition et d'exploitation à basse rend abordable pour les petits laboratoires universitaires. Séquenceurs de paillasse sont particulièrement bien adaptés pour amplicon, petit génome et à faible complexité séquençage du métagénome dans les études de microbiologie de l'environnement, parce que ce type d'études ne nécessite généralement pas la profondeur extrême de séquençage. Par exemple, il est généralement admis que pour le séquençage du gène 16S ARNr étudie le nombre de lectures par échantillon n'est pas primordiale, comme ~ 1000 la lecture peut générer les mêmes schémas que plusieurs millions de lectures ensembles de données ^5. Cela dit, paillasse prochaine generatio n séquenceurs génèrent encore de grandes quantités de données de séquence, avec des rendements maximaux de ~ 35 Mbp (454 GS Junior), ~ 2 Gbp (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 Gbp (Ion Torrent Proton), ~ 10 Gbp (Illumina MiSeq) et ~ 100 GBP (Illumina Suivant Seq 500), ce qui est plus que suffisant pour la plupart des études de microbiologie de l'environnement.

Séquençage de nouvelle génération d'amplicons d'ARNr 16S à l'aide de séquenceurs de paillasse a été récemment appliquée à une grande variété d'environnements. Par exemple, la Ion Torrent PGM a été utilisé pour la communauté des analyses de résidus des mines d'uranium qui avaient particulièrement un pH élevé et une faible perméabilité ^6, de systèmes de recirculation de l'aquaculture ^7, de sols arctiques contaminés par des hydrocarbures ^8,9, de sables bitumineux miniers sédiments touchés et biofilms de la rivière Athabasca ^10,11, de la rhizosphère de saules plantés dans des sols contaminés ^12, des corps humains et animaux ^13-16 et de ¹⁷ des digesteurs anaérobies.

jove_content "> Dans cette contribution, nous détaillons notre approche de séquençage de l'ARNr 16S amplicons de gènes en interne à l'aide d'une paillasse séquenceur de nouvelle génération (la Ion Torrent PGM). Après extraction de l'ADN, les gènes ARNr 16S sont amplifiés en utilisant des amorces bactériennes au niveau du domaine qui contiennent adaptateurs de séquençage et des séquences uniques, spécifiques à l'échantillon (codes à barres). Les amplicons sont purifiés, quantifiées et regroupées dans un rapport équimolaire. Les échantillons mis en commun puis clonage amplifiés dans une émulsion PCR et séquencés. séquences qui en résultent sont analysés en utilisant la disposition du public des outils de bioinformatique ( par exemple, mothur).

Protocole

1. ARNr 16S Gene Amplicon Bibliothèque préparation par la méthode de fusion

1. Décongeler les amorces (à terme, F343-Iona-MIDXX: 5 'CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3', à l'inverse, R533-IonP1: 5'-CCT CCT TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA GCC CGG CTG CTG GC-3 '; gras: adaptateurs spécifiques Ion torrent; italique: clé de séquencement pour calibrer l'intensité du signal au début de la course au séquençage; police régulière: amorces spécifiques de modèle; X ... X: 10 pb code à barres, voir le tableau 1 pour certaines séquences de codes à barres), le master mix 2x HotStartTaq Plus et les échantillons. Bien mélanger avant utilisation, à l'exception du mélange maître qui doivent être mélangés doucement.
2. Préparer un mélange de PCR (20 ul de réaction) avec 0,5 uM de l'amorce inverse, 0,4 mg / ml de Sérum Albumine Bovine (BSA) et 1x HotStartTaq plus de mélange maître. Ajouter 18,5 ul du mélange maître à l'eTube ach PCR.
3. Ajouter une amorce directe (0,5 ul de 20 mM) avec un code à barres différent pour chacun des échantillons qui seront séquencés ensemble. Ajouter 1 ul d'échantillon (1-10 ng / ul) au tube PCR.
4. Placer les tubes dans une machine PCR et exécuter le programme suivant: dénaturation initiale à 95 ° C pendant 5 min; 25 cycles de 95 ° C pendant 30 sec, 55 ° C pendant 30 sec et 72 ° C pendant 45 s; allongement final à 72 ° C pendant 10 min. Les produits de PCR peuvent être conservés à 4 ° CO / N ou congelés jusqu'à leur utilisation.

2. Amplicon purification, la quantification et la mise en commun

1. Préparation d'un gel d'agarose à 2% à l'aide des plus grands peignes disponible. Ajouter 5 ul de gel de 6x colorant de charge à la réaction et de la charge sur le gel, en séparant chaque échantillon par un puits vide. Exécutez le gel à 70 V pendant 50 min.
2. Prenez une photo du gel et couper les bandes (taille attendue d'environ 250 pb: produit de pb 190, plus 63 cartes de pb et codes à barres) à l'aide d'un scalpel propre.
3. Peser les bandes excisées et procéder à l'extraction de gel et la purification des produits de PCR (avec, par exemple, un kit d'extraction de gel Qiaquick).
4. Quantifier chaque produit PCR avec PicoGreen et faire des dilutions pour obtenir une solution mère à 5 x 10 ⁹ molécules / ul (environ 1 ng / pl). Si certains échantillons montrent une amplification plus faible, ajustez les dilutions à une concentration plus faible, en gardant à l'esprit que la plus faible concentration appropriée pour les procédures ultérieures est de 1,57 x 10 ⁷ molécules / ul (26 heures).
5. Piscine 10 pi de chaque produit de PCR dilué pour obtenir une piscine équimolaire d'échantillons. Préparer un bassin séparé pour chacun de la course de séquençage prévu. Les produits de PCR peuvent être regroupées conservés au congélateur jusqu'à leur utilisation.

3 Emulsion PCR et séquençage

1. Faire la PCR en émulsion:
   1. Diluer les produits épreuve à 26 pM dans un volume de 25 pi. Réactifs dégel à partir d'un kit de modèle Ion PGM.
   2. Préparer le mélange PCR en émulsion (réactifs fournis dans le kit) dans une hotte PCR et ajouter les produits de PCR en gestion commune et les particules sphériques (fournies) sur le banc. Bien mélanger et insérez le mélange dans une cartouche filtrante et le haut soigneusement avec de l'huile d'émulsion (fourni).
   3. Inverser doucement la cartouche de filtre et de la charge sur l'appareil de PCR en émulsion automatisé (par exemple, une touche Ion instrument 2). Sélectionnez le programme approprié et lancer la procédure.
2. Après la PCR automatisé émulsion est terminée, enlever le surnageant des tubes de collecte et de récupérer les particules sphériques au fond des tubes. Remettre en suspension les sphères dans 100 pi de solution de lavage (fourni dans le kit) et prendre une aliquote de 2,0 pl pour la bibliothèque quantification.
3. Effectuer la bibliothèque quantification.
   1. Mélanger 100 pi de tampon SSPE (150 mM de NaCl, 10 mM NaPO _4, 1 mM Na ₂ EDTA) avec 2 pl de l'adaptateur B'-Fam (5'-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') sonde et 2 pi de la carte A-Cy5 (5'-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT GCC LOI CAG-3') sonde. Ajouter 52 ul de ce mélange à l'aliquote de 2,0 ul pris à l'étape 3.2 et ajouter 2 pi de solution de lavage (à partir du kit de modèle) pour les 52 pi restants comme un blanc pour la quantification.
   2. Incuber à 95 ° C pendant 2 min, puis à 37 ° C pendant 2 min. Transférer les mélanges en tubes de 1,5 ml.
   3. Ajouter 1,0 ml de tampon de TEX (Tris 10 mM, EDTA 1 mM, 0,01% de Triton X-100, pH 8,0), mélanger et centrifuger à 15 500 g pendant 3 min à température ambiante. Enlever le surnageant et laisser 20 pi dans chaque tube. Répéter ce procédé de lavage à deux reprises.
   4. Ajouter 180 ul de tampon de TEX, remettre en suspension les particules granulées et transférer dans 500 tubes ul Qubit.
   5. Mesurer la fluorescence de la FAM et Cy5 en utilisant un appareil de qubits, et calculer le rapport de sphères positifs en utilisant le calculateur disponible sur le site Ion Communauté.
4. Enrichir le reste des particules sphériques de sphères positives (contenant de l'ADN amplifié) en utilisant un système d'enrichissement automatisé (par exemple, un système d'enrichissement Ion Touch).
   1. Réactifs pipette dans les puits appropriés de la condition bande de 8 puits: Puits 1: particules sphériques de l'étape 3.2; Eh bien 2: pré-lavés perles MyOne streptavidine C1 (13 pi); Eh bien 3, 4 et 5: solution de lavage (fourni dans le kit de modèle); Eh bien 6: vide; Eh bien 7: fusion de solution (NaOH 125 mM, 0,1% de Tween 20); Eh bien 8: vide.
   2. Installez une astuce sur le bras de pipetage et un tube de 0,2 ml pour la collecte de l'échantillon. Lancer l'instrument. A la fin de l'enrichissement, ajouter 10 ul de solution (fourni) à neutraliser. Les perles enrichies peuvent être conservés à 4 ° C pendant jusqu'à 15 jours.
5. Initialiser l'instrument de séquençage:
   1. Connectez-vous à l'instrument de séquençage et de préparer un plan séquence de l'exécution, en précisant les détails de la course de séquençage.
   2. Installerl de la solution de lavage n ° 2 (fourni dans le kit de séquençage Ion PGM), la solution de lavage n ° 1 (350 ul de NaOH à 100 mM) et la solution tampon de pH automatique (fourni).
   3. Commencez la procédure d'initialisation et lorsque vous êtes invité ajouter le dATP, dCTP et dGTP nucléotides dTTP (fourni) dans leurs tubes de 50 ml respectifs. Visser les tubes sur la machine de séquençage et poursuivre la procédure d'initialisation. Lorsque l'initialisation est terminée, lancer la procédure d'exécution immédiatement.
6. Préparer les échantillons pour le séquençage et charger la puce:
   1. Recueillir les sphères enrichies provenant de l'étape 3.4 dans le bas du tube par centrifugation à 15 500 xg pendant 1,5 min. Eliminer le surnageant en laissant exactement 3 pl.
   2. Ajouter 3 pi de amorce de séquençage (fourni dans le kit de séquençage), bien mélanger par pipetage de haut en bas pour remettre en suspension les particules. Incuber à 95 ° C pendant 2 min, puis à 37 ° C pendant 2 min.
   3. Ajouter 1 pl de polymerase (fourni), bien mélanger et Incubmangé à température ambiante pendant 5 min. Procéder à charger le mélange enzyme-sphère sur la puce de séquençage dans les 30 min.
   4. Pendant l'incubation, charger la puce de séquençage sur le séquenceur et effectuer un contrôle de la qualité des copeaux. Retirer le liquide à partir de la puce par centrifugation et charger l'échantillon dans la puce par pipetage vers le bas lentement le mélange enzyme-sphère (7 pi) et d'éviter l'introduction de bulles dans la puce.
   5. Centrifuger la puce trois fois pendant 1 minute dans une microcentrifugeuse. Changez l'orientation de la puce à chaque centrifugation et mélanger par pipetage de haut en bas entre chaque course.
   6. Charger la puce dans l'appareil et commencer la course.

Analyse des données de séquence de base 4

1. Connectez-vous au serveur de données de séquençage et télécharger le fichier fastq. Créer un "oligos" fichier délimité par des tabulations contenant l'amorce et code à barres informations (voir l'exemple dans le tableau 1). Télécharger les fichiers de référence Greengenes du Motsite hur ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
2. Lancez mothur et effectuer des analyses:
   1. Convertir le fichier fastq à un fasta et un fichier de qualité en utilisant la commande suivante: fastq.info (fastq = test.fastq)
   2. Déterminer l'appartenance au groupe de chaque séquence et couper les séquences en utilisant la commande suivante: trim.seqs (fasta = test.fasta, oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T)
   3. Les différentes options peuvent être modifiées en fonction de la rigueur souhaitée
   4. Classer les séquences dans le greengenes taxonomie en utilisant la commande suivante: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, groupe = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, taxinomie = gg_99_otus.tax, coupure = 50)

Résultats

Après purification sur gel, avec 25 cycles d'amplification par PCR, les produits d'amplification sont en général à une concentration de 0,2 à 10,0 ng dans 50 ul d'eau. Cela peut varier largement en fonction de la concentration de l'ADN de départ, le type d'échantillon et le kit de purification utilisée. Il est recommandé de maintenir le nombre de cycles de PCR à la plus faible possible pour éviter la formation de chimère et de diminuer les biais d'amplification, en gardant à l'esprit que tous les échantillons doivent être amplifiés en utilisant le même nombre de cycles. Pour réduire le nombre d'anticorps polyclonaux les lectures et les sphères vides et maximiser le nombre de lectures, le rapport de qubits doit être comprise entre 0,1 et 0,3 et la fluorescence de la FAM doit être supérieure à 200 l'aide d'une puce 314 sur un Ion Torrent PGM, le rendement moyen est de l'ordre 0,3-0,5 M de bonne qualité lit après filtrage des résultats en mothur. tableau 2 présente la répartition typique du nombre de lectures après chaque étape de la procédure pour une course contenant 36 environ multiplexééchantillons mentale amplifiés avec des amorces ciblant la région V3-4 des 16S et analysées à l'aide mothur. Dans mothur, la procédure de trim.seqs générer un fichier "* de .trim.fasta" contenant les séquences qui ont passé les filtres de qualité et un "* .scrap.fasta" qui contient les séquences qui ne passe pas les filtres de qualité ainsi que la raison de rejet dans l'en-tête de séquence. Lorsque fourni avec des codes à barres dans le "oligos" fichier, cette commande génère également un fichier "* .Groupes" qui contient l'appartenance au groupe de chaque séquence basée sur la séquence de codes à barres. La procédure de classify.seqs génère un ".tax.summary" qui peut être ouvert dans Excel. Ce fichier contient le résumé de l'affiliation taxonomique (en lignes) pour chacun des échantillons (en colonnes). Ce fichier peut être utilisé pour les analyses statistiques en aval et de visualiser la composition de la communauté à différents niveaux taxonomiques. Le fichier ".taxonomy" contient la taxonomie détailléeaffiliation pour chaque séquence. La composition de la communauté moyenne au niveau phylum / classe dans tous les 36 échantillons est illustré à la figure 1.

Figure 1 composition de la communauté moyenne au niveau phylum / classe dans tous les échantillons.

avant	TACGGRAGGCAGCAG
code à barres	CTAAGGTAAC	Sample01
code à barres	TAAGGAGAAC	Sample02
code à barres	AAGAGGATTC	Sample03
code à barres	TACCAAGATC	Sample04
code à barres	CAGAAGGAAC	Leçon05
code à barres	CTGCAAGTTC	Sample06
code à barres	TTCGTGATTC	Leçon07
code à barres	TTCCGATAAC	Sample08
code à barres	TGAGCGGAAC	Sample09
code à barres	CTGACCGAAC	Leçon10

Tableau 1 Exemple "oligos" fichier pour une utilisation dans mothur.

	Nombre de lit	% De l'étape précédente	Moy. Par exemple
Nombre de puits	1262519	-	35070
Wells avec des perles	1114108	88.20%	30947
Perles avec des modèles	1112746	99,90%	30910
Perles monoclonaux	826805	74.30%	22967
Bonne qualité lit (sortie du séquenceur)	782204	94.60%	21728
Passe mothur filtres (min. Moy. Score de qualité de 20 sur une fenêtre de 50 points de base, min. Longueur de 150 points de base)	372168	47.60%	10338
Classé au niveau de l'embranchement en GreenGenes (50% seuil de confiance)	342171	91.90%	9505
Classé au niveau de la famille dans GreenGenes (50% seuil de confiance)	316512	92.50%	8792
Classé au niveau du genre dans GreenGenes (50% seuil de confiance)	289899	91.60%	8053

Tableau 2 Nombre de lectures produites à partir d'un essai typique pour 36 échantillons environnementaux multiplexés sur une puce Ion Torrent 314.

Discussion

La méthode présentée ici est simple et peu coûteux, et devrait permettre à de nombreux laboratoires d'accéder à la puissance de séquençage métagénomique. Bien qu'il varie en fonction de la plate-forme de séquençage utilisée, une fois que les bibliothèques sont construites sont nécessaires très peu de mains sur le temps, avec la plupart des processus étant automatisés. Pour la plate-forme de séquençage utilisée ici (Ion Torrent PGM), la procédure complète peut être effectuée dans les deux jours de travail. Au moment de l'écriture (Septembre 2013), les coûts des réactifs liés à l'exemple détaillé ci-dessus ont été les suivantes: amplification par PCR de 36 échantillons: 25 $, la purification sur gel et PicoGreen ADN quantification de 36 échantillons: 125 $, émulsion PCR pour un échantillon d'amplicon groupé : 150 $ et réactifs de séquençage: 250 $, pour un total de 550 $ ou 15 $ par échantillon ou $ 0,0015 par lecture de qualité filtré. Ce prix ne comprend pas de contrat instrument de service, l'amortissement de l'instrument, technicien salaire et utilisation de l'espace de laboratoire.

tente "> Une des étapes les plus importantes est de mettre en commun tous les produits dans un rapport équimolaire, afin de récupérer le même nombre de lectures pour chacun des échantillons. PicoGreen quantification a été utilisé ici, mais d'autres méthodes pourrait être approprié, bien que moins précise (par exemple, la quantification UV, la quantification à base de gel). Même en faisant la quantification plus précise et la mise en commun, il ya une certaine variabilité dans le nombre de lectures par exemple, et à l'approche typique détaillées au tableau 2, il varie de 4380 à 32750 lit, avec une moyenne de 10 338 lit. Si le traitement grand nombre d'échantillons (plus de 40-50), la purification de gel unique de la colonne peut être remplacée par une purification sur gel en plaque ou de purification en utilisant des billes avec une coupure de taille strictes (par exemple, des perles AMPure) .

À ce jour, la technologie de séquençage le plus utilisé de la prochaine génération pour le gène de l'ARNr 16S est 454. Le Ion Torrent technologie de séquençage utilisée dans ce protocole est conceptuellement très similaireà 454 et les deux techniques sont sujettes à la même type d'erreurs de séquençage. Sans surprise, il a été montré que le séquençage Ion Torrent a abouti à des résultats de séquençage très similaires à 454 séquençage ^10. Récemment, de nombreux chercheurs ont exploré l'utilisation de la technologie Illumina pour l'ARNr 16S amplicon du gène séquençage ^18,19. En tout cas, il serait facile d'adapter le protocole en vigueur pour d'autres séquenceurs de paillasse comme le Illumina MiSeq ou la 454 GS junior en changeant les séquences de fusion des amorces de faire correspondre les cartes et les codes à barres nécessaires à ces technologies de séquençage, comme dans le procédé décrit récemment pour la Illumina MiSeq ^19. Alternativement, les chercheurs ont pu suivre les étapes 1 et 2 du protocole détaillé ici et envoyer les amplicons communs à un centre de séquençage où l'émulsion PCR et séquençage seraient effectuées.

Le gène de l'ARNr 16S lectures ont été coupé et classé à l'aide mothur, mais beaucoup d'autres analyses peuvent être effectuées surAmplicons du gène ADNr 16S. Par exemple, la diversité bêta peut être évaluée en calculant les distances entre chaque paire Unifrac de l'échantillon à l'aide de la procédure décrite à http://unifrac.colorado.edu/ ^20. Alpha indices de diversité et le nombre d'unités taxonomiques opérationnelles de chaque échantillon peuvent être calculées à l'aide des outils dans QIIME comme AmpliconNoise ²¹ ou en utilisant la procédure décrite par Huse et al. ²² et disponible dans mothur.

Les amorces utilisées ici amplifiés les régions variables 3 et 4 du gène de l'ARNr 16S, mais beaucoup d'autres régions pourraient être ciblés. Dans cette étude, les gènes de l'ARNr 16S ont été amplifiés à partir de la matière végétale et le choix de l'amorce ont été faits pour éviter l'amplification du gène de l'ARNr 16S du chloroplaste ^23,24. Il existe une grande variété d'autres amorces disponibles qui varient selon la durée de la longueur du produit, la puissance et l'utilité taxonomique ^25,26. Cependant, dans tous les cas 200-400 pb lit du gène ARNr 16S ne peut pas être fiable classés au niveau de l'espèce, et les analyses sont limitées au genre et les niveaux taxonomiques plus élevés. D'autres gènes pourraient être plus approprié si l'information au niveau des espèces est nécessaire, comme les cpn60 et rpoB gènes ^27,28. Une chute brutale à venir dans le coût du séquençage et l'augmentation de la puissance des outils d'analyse pourrait rendre possible de remplacer le séquençage du gène 16S ARNr par métagénomique fusil de chasse, mais en attendant, le séquençage du gène 16S ARNr reste la norme de microbiologie environnementale de l'or.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion 314 Chip Kit v2	Life Technologies	4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2	Life Technologies	4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit	Life Technologies	4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit	Qiagen	203646
Primers and probes	IDT	NA
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BSA 20 mg/ml	Roche	10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001