Next-Generation-Sequenzierung der ribosomalen 16S-RNA Gene Amplikons

Zusammenfassung

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

Zusammenfassung

Eine der wichtigsten Fragen in der mikrobiellen Ökologie ist "Wer ist da?" Diese Frage kann mit verschiedenen Werkzeugen beantwortet werden, aber eines der lang anhaltende Gold-Standards ist es, 16S ribosomale RNA (rRNA)-Gen Amplikons von Domain-Level-PCR erzeugte Sequenz Reaktionen Verstärken von genomischer DNA. Traditionell wurde diese durch Klonierung und Sanger (Kapillarelektrophorese) Sequenzierung der PCR-Produkte durchgeführt. Das Aufkommen der nächsten Generation Sequenzierung hat sich enorm vereinfacht und erhöht die Sequenzierung Tiefe für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung. Die Einführung von Tisch Sequenzer ermöglicht jetzt kleinen Labors, ihre 16S-rRNA-Sequenzierung im Haus in einer Angelegenheit von Tagen durchzuführen. Hier wird ein Konzept für die 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon mit einer Tisch nächsten Generation Sequencer beschrieben. Die Umwelt-DNA wird zuerst durch PCR unter Verwendung von Primern, die Sequenzierung Adapter und Barcodes enthalten. Sie werden dann zu kugelförmigen Teilchen durch Emulsions-PCR verbunden. Die Teilchen loaded auf einem Einweg-Chip, und der Chip wird in der Maschine nach der Sequenzierung Die Sequenzierung durchgeführt wird eingefügt. Die Sequenzen sind in fastq Format abgerufen, filtriert, und die Strichcodes werden verwendet, um die Probe herzustellen Mitgliedschaft des liest. Das gefilterte und klassierte Lesevorgänge werden dann unter Verwendung öffentlich verfügbaren Tools analysiert. Ein Beispiel, wo die Analyse liest wurden mit einem Taxonomie-Suchalgorithmus innerhalb des Software-Pakets Mothur gegeben eingestuft. Die hier vorgestellte Methode ist einfach, preiswert und unkompliziert und sollte kleiner Labors helfen, die Vorteile aus dem laufenden genomische Revolution zu nehmen.

Einleitung

Metagenomische Sequenzierung ist eine sehr leistungsfähige Technologie, da sie die Gesamtheit der genetischen Information in einer Umweltprobe enthaltenen Ziele. Es gibt verschiedene Geschmacksrichtungen von metagenomische Sequenzierung, einschließlich Shotgun-Sequenzierung, Großeinsatz Bibliotheken und Amplikon-Sequenzierung. Amplicon-Sequenzierung bietet den Vorteil, dass sie relativ preiswert, schnell und in der Lage zu erzeugen liest aus einer genomischen Region, die im Allgemeinen ausgerichtet werden kann. Zusätzlich wird die Datenanalyseablauf für Amplikon-Sequenzierung meist genormt. Da es auf PCR-Basis, hat jedoch alle Vorspannungen unvollständiger Spezifität unvollständige Abdeckung und Primer bezogen vorspannt ^1,2, die diesen Ansatz semi-quantitative macht am besten. Mehrere genomischen Regionen für Amplikon-Sequenzierung auch funktionelle Gene gezielt werden, aber die beliebtesten Optionen sind Markergene wie das 16S rRNA-Gen verwenden, um ein Community-Profil zu erzeugen. Traditionell 16S rRNA-Gen-Amplikon sequeber bouncing wurde mit arbeitsintensive Techniken, Klonierung in E. enthalten geführt coli-Kolonie Kommissionierung und Plasmid-Extraktion, gefolgt von Sanger Sequenzierung der isolierten Plasmide, und folglich die meisten Studien analysiert weniger als 100 Klone pro Probe. Next-Generation-Sequencing brachte zwei große Fortschritte: massiven Parallelisierung der Sequenzierungsreaktionen und, am wichtigsten, klonalen Trennung der Vorlagen ohne die Notwendigkeit, Gen-Fragmente in einer Gast einfügen. Das hat enorm die Sequenzierung von 16S rRNA-Gen-Amplikons, die nun wieder als eine Routine Merkmal vieler Umweltmikrobiologie Studien ist, was zu einer "Renaissance" für 16S rRNA-Gen-Sequenzierung Amplikon ³ vereinfacht.

Seit dem Aufkommen der Roche 454-Sequenzierung im Jahr 2005 ^4, haben mehrere andere Next-Generation-Sequencing-Technologien auf dem Markt erschienen (zB Illumina, Festkörper, PacBio). In jüngerer Zeit die Einführung der Tisch Sequenzrs gebracht, um kleine Labore die Sequenzierung Kapazität einmal exklusiv für große Sequenzierungszentren. Fünf Tischmaschinen sind derzeit verfügbar: die 454 GS Junior, der Ion Torrent Personal Genome Machine (PGM) und Proton, und die Illumina MiSeq und NextSeq 500. Während alle diese Sequenzer bieten weniger liest pro Lauf und weniger Basen pro Dollar als die meisten Voll Maßstab Sequenzer, sind sie flexibler, schneller, und ihre niedrigen Anschaffungskosten und Lauf macht sie für kleine akademische Labors erschwinglich. Tisch Sequenzer sind besonders gut für Amplikon, kleines Genom und geringer Komplexität Metagenom-Sequenzierung in der Umweltmikrobiologie Studien geeignet, weil diese Art von Studien in der Regel nicht eine extreme Tiefe der Sequenzierung erfordern. Zum Beispiel ist es allgemein anerkannt, dass die 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung untersucht die Anzahl der Lesevorgänge pro Probe ist nicht entscheidend, wie ~ 1000 liest die gleichen Muster, wie Multi-Millionen Datensätze liest ⁵ zu erzeugen. Having said that, Tisch nächsten gene n Sequenzer noch große Mengen an Sequenzdaten mit maximaler Renditen generieren ~ 35 MBP (454 GS Junior), ~ 2 GBP (Ion Torrent PGM), ~ 10-15 GBP (Ion Torrent Proton), ~ 10 GBP (Illumina MiSeq) und ~ 100 GBP (Illumina Weiter Seq 500), die mehr als genug für die meisten Umweltmikrobiologie Studien ist.

Next-Generation-Sequenzierung des 16S-rRNA-Amplikons mit Tisch Sequenzer wurde vor kurzem in einer Vielzahl von Umgebungen angewendet. Zum Beispiel hat der Ion Torrent PGM für Gemeinschaft verwendet wurden Analysen von Uran-Mine Aufbereitungsrückstände, die besonders hohen pH-Wert und geringe Durchlässigkeit ⁶ hatte, der Rückführung von Aquakultursystemen ^7, der Kohlenwasserstoff-kontaminierten Böden der Arktis ^8,9, der Ölsandgewinnung betroffen Sedimenten und Biofilme aus dem Athabasca River ^10,11, der Rhizosphäre von Weiden in kontaminierten Böden ¹² gepflanzt, der menschlichen und tierischen Körpern ^13-16 und von Faul ^17.

jove_content "> In diesem Beitrag haben wir ausführlich unsere Herangehensweise an sequenzieren 16S rRNA-Gen-Amplikons im Haus mit Hilfe eines Tisch nächsten Generation Sequencer (der Ion Torrent PGM). Nach der DNA-Extraktion, 16S rRNA-Gene verstärkt mit Domain-Ebene bakterielle Primer, die enthalten Sequenzierung Adapter und einzigartig, probenspezifische Sequenzen (Barcodes). Die Amplifikate werden gereinigt, quantifiziert und vereinigt in einem äquimolaren Verhältnis. Die gepoolten Proben werden dann klonal in einer Emulsions-PCR amplifiziert und sequenziert. resultierenden Sequenzen werden unter Verwendung öffentlich erhältlicher Werkzeuge der Bioinformatik (analysiert zB Mothur).

Protokoll

1. 16S rRNA-Gen-Bibliothek Amplicon Vorbereitung der Fusion-Methode

1. Tauen die Primer (Vorwärts, F343-Iona-MIDXX: 5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 '; umzukehren, R533-IonP1: 5'-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AUF EINEN TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 '; fett: Ion Torrent spezifische Adapter, kursiv: Sequenztaste für die Kalibrierung von Signalintensität zu Beginn der Sequenzierung Lauf, regelmäßige Schrift: template-spezifischen Primer, X ... X: 10 bp Barcode, siehe Tabelle 1 für einige Barcode-Sequenzen), die 2x HotStartTaq Plus-Master-Mix und die Proben. Vor Gebrauch gründlich mischen, mit Ausnahme des Master-Mix, der sanft gemischt werden sollte.
2. Vorbereitung einer PCR-Mischung (20 ul-Reaktionen) mit 0,5 uM des Reverse-Primers, 0,4 mg / ml Rinderserumalbumin (BSA) und 1x HotStartTaq Plus Master Mix. Fügen 18,5 ul des Master-Mix auf Each PCR-Röhrchen.
3. Ein Forward-Primer (0,5 ul an 20 mM) mit einem anderen Strichcode für jede der Proben, die zusammen sequenziert werden. 1 ul Probe (1-10 ng / ul) auf die PCR-Röhrchen.
4. Die Röhrchen in einer PCR-Maschine und führen Sie das folgende Programm: initiale Denaturierung bei 95 ° C für 5 min; 25 Zyklen von 95 ° C für 30 sec, 55 ° C für 30 sec und 72 ° C für 45 sec; Schlussverlängerung bei 72 ° C für 10 min. PCR-Produkte können bei 4 ° CO gehalten werden / N oder gefroren bis zur Verwendung.

2. Amplicon Reinigung, Quantifizierung und Pooling

1. Bereiten Sie eine 2% Agarose-Gel mit die größten Kämme. Werden 5 ul 6x Gel-Beladungsfarbstoff zu dem Reaktions und Last auf dem Gel, die Trennung jeder Probe durch einen leeren gut. Führen Sie das Gel bei 70 V für 50 min.
2. Nehmen Sie ein Bild von dem Gel und schneiden die Bänder (erwarteten Größe ca. 250 bp: 190 bp-Produkt sowie 63 bp-Adapter und Barcodes) mit einem sauberen Skalpell.
3. Wiegen Sie die ausgeschnittenen Banden und fahren Sie mit dem Gel Extraktion und Reinigung der PCR-Produkte (mit zB QIAquick Gel Extraction Kit).
4. Quantifizierung jedes PCR-Produkt mit PicoGreen und machen Verdünnungen um eine Stammlösung bei 5 x 10 ⁹ Moleküle / ul (etwa 1 ng / ul) zu erhalten. Wenn einige Proben zeigen geringere Verstärkung, passen Sie die Verdünnungen auf eine niedrigere Konzentration, wenn man bedenkt, dass die niedrigste für die nachfolgende Verfahren Konzentration beträgt 1,57 x 10 ⁷ Moleküle / ul (26 Uhr).
5. Pool 10 ul der verdünnten PCR-Produkt zu einer äquimolaren Pool von Proben zu erhalten. Bereiten Sie eine separaten Pool für jede der geplanten Lauf Sequenzierung. Die gepoolten PCR-Produkte können in der Tiefkühltruhe aufbewahrt werden, bis sie verwendet.

3. Emulsions-PCR und Sequenzierung

1. Führen Emulsions-PCR:
   1. Verdünne die gepoolten PCR-Produkte auf 26 pM in einem Volumen von 25 ul. Tau-Reagenzien von einem Ion PGM-Vorlage-Kit.
   2. Bereiten Sie die Emulsions-PCR-Mix (Reagenzien im Kit enthalten) in einer PCR-Haube und die gepoolten PCR-Produkte und die Kugel-Teilchen (mitgeliefert) auf der Bank hinzuzufügen. Gründlich mischen und legen Sie die Mischung in eine Filterpatrone und vorsichtig von oben mit Öl-Emulsion (mitgeliefert).
   3. Langsam kehren die Filterpatrone und Last auf dem automatisierten Emulsion PCR-Gerät (zB Ion One Touch 2 Instrument). Wählen Sie das entsprechende Programm und starten Sie den Vorgang.
2. Nach der automatisierten Emulsions-PCR abgeschlossen ist, entfernen Sie den Überstand aus den Sammelrohren und rufen Sie die Kugel Teilchen am Boden der Rohre. Resuspendieren der Kugeln in 100 ul Waschlösung (im Kit enthalten) und einen 2,0-ul-Aliquot für Bibliotheks Quantifizierung.
3. Führen Sie die Bibliothek Quantifizierung.
   1. Mischungs 100 ul SSPE-Puffer (150 mM NaCl, 10 mM NaPO _4, 1 mM Na ₂ EDTA) mit 2 ul Adapter B'-Fam (5'-FAM -CTG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 ') und Sonde 2 ul Adapter A-Cy5 (5'-Cy5 -CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3')-Sonde. Fügen 52 ul dieser Mischung mit dem 2,0-ul-Aliquot in Schritt 3.2 aufgenommen und mit 2 ul Waschlösung (von der Vorlage Kit) mit den restlichen 52 ul als Rohling für die Quantifizierung.
   2. Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min. Übertragen Sie die Mischungen in 1,5-ml-Röhrchen.
   3. 1,0 ml TEX-Puffer (10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 8,0), Mischen und Zentrifugieren bei 15.500 × g für 3 min bei RT. Entfernen Sie den Überstand und lassen Sie 20 ul in jedes Röhrchen. Wiederholen Sie diesen Waschvorgang zwei Mal.
   4. Fügen Sie 180 ul von TEX-Puffer resuspendieren Die pelletierten Partikel und übertragen in 500 ul Qubit Röhren.
   5. Messen Fluoreszenz für FAM und Cy5 mit einem Qubit Gerät und berechnen das Verhältnis von positiven Kugeln mit Hilfe der auf der Website zur Verfügung Ion Gemeinschaft Rechner.
4. Bereichern den Rest der Form kugelförmiger Partikel für positive Kugeln (enthaltend amplifizierte DNA) unter Verwendung eines automatisierten Anreicherungssystem (zB Ionen One Touch Anreicherungssystem).
   1. Pipette Reagenzien in den Vertiefungen der vorgesehenen 8-Well-Streifen: Nun 1: Kugel Partikel aus Schritt 3.2; Nun 2: vorgewaschen MyOne Streptavidin C1-Perlen (13 ul); Gut 3, 4 und 5: Waschlösung (in der Vorlage Kit enthalten); Gut 6: leer; Gut 7: Schmelz-off-Lösung (125 mM NaOH, 0,1% Tween 20); Gut 8: leer.
   2. Installieren Sie eine Spitze auf dem Pipettieren Arm und ein 0,2-ml-Röhrchen für die Probenentnahme. Starten Sie das Gerät. Am Ende der Anreicherung werden 10 ul der Neutralisierungslösung (enthalten). Die angereicherten Kügelchen können eine 4 ° C für bis zu 15 Tage aufbewahrt werden.
5. Initialisieren der Sequenzierung Instruments:
   1. Eine Verbindung zum Instrument Sequenzierung und bereiten eine Sequenzierung Laufplan, der die Details der Sequenzierung Lauf.
   2. Installierenl der Waschlösung # 2 (in der Ionen-PGM-Sequenzierungs-Kit vorgesehen), die Waschlösung # 1 (350 ul 100 mM NaOH) und die Auto-pH-Pufferlösung (vorgesehen).
   3. Starten Sie die Initialisierung und wenn Sie dazu aufgefordert in ihren jeweiligen 50-ml-Röhrchen fügen Sie die dATP, dGTP dCTP und dTTP Nukleotide (mitgeliefert). Schrauben Sie die Rohre auf die Sequenzierung Maschine und setzen Sie die Initialisierung. Wenn die Initialisierung abgeschlossen ist, starten Sie den Vorgang sofort laufen.
6. Vorbereitung der Proben für die Sequenzierung und laden Sie die Chip:
   1. Sammle die angereicherten Bereiche aus Schritt 3.4 an der Unterseite des Rohres durch Zentrifugation bei 15.500 × g für 1,5 min. Entfernen Sie den Überstand verlassen genau 3 ul.
   2. Hinzufügen 3 ul Sequenzierprimer (in der Sequenzierungs-Kit zur Verfügung gestellt), gut mischen durch Pipettieren von oben und unten, um die Partikel zu suspendieren. Inkubieren bei 95 ° C für 2 min, dann bei 37 ° C für 2 min.
   3. 1 ul-Polymerase (im Lieferumfang enthalten), gut mischen und Incubaß bei RT für 5 min. Fahren Sie mit den Enzym-Kugelgemisch auf der Sequenzierung Chip innerhalb von 30 min zu laden.
   4. Während der Inkubation laden die Sequenzierung Chip auf dem Sequenzer und einen Chip Qualitätsprüfung durchzuführen. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus dem Chip durch Zentrifugation und laden Sie die Probe in der Chip durch langsames Pipettieren Sie die Enzym-Mix Kugel (7 ul) und der Vermeidung der Einführung von Blasen in den Chip.
   5. Zentrifugieren Sie die Chip dreimal für 1 min in einer Mikro. Ändern Sie die Ausrichtung des Chips an jeder Zentrifugation und mischen durch Pipettieren von oben und unten zwischen jedem Lauf.
   6. Laden Sie den Chip in dem Gerät und den Lauf starten.

4. Grundsequenzdatenanalyse

1. Eine Verbindung zum Server Sequenzierungsdaten und laden Sie die Datei fastq. Erstellen Sie eine durch Tabulatoren getrennte Datei "Oligos" der Grundierung und Barcode-Informationen (siehe Beispiel in Tabelle 1), die. Laden Sie die Greengenes Referenzdateien aus der Mothur Website ( http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ).
2. Starten Mothur und Durchführung von Analysen:
   1. Konvertieren Sie die Datei in ein fastq fasta und ein Qualitäts Datei mit dem folgenden Befehl: fastq.info (fastq = test.fastq)
   2. Bestimmen Sie die Gruppenzugehörigkeit jeder Sequenz und trimmen die Sequenzen mit dem folgenden Befehl: trim.seqs (fasta = test.fasta, Oligos = barcode.txt, QFile = test.qual, qwindowaverage = 20, qwindowsize = 50, minlength = 150, keepforward = T)
   3. Die verschiedenen Optionen können entsprechend der gewünschten Stringenz modifiziert werden
   4. Klassifizieren Sie die Sequenzen in der Greengenes Taxonomie mit dem folgenden Befehl: classify.seqs (fasta = test.trim.fasta, method = wang, Gruppe = test.groups, template = gg_99_otus.fasta, Taxonomie = gg_99_otus.tax, Cutoff = 50)

Ergebnisse

Nach der Reinigung auf einem Gel mit 25 Zyklen der PCR-Amplifikation werden die Amplifikationsprodukte der Regel in einer Konzentration von 0,2 bis 10,0 ng in 50 ul Wasser. Dies kann in Abhängigkeit von der Ausgangs-DNA-Konzentration, der Art der Probe und der Reinigungssatz variieren. Es wird empfohlen, die Anzahl der PCR-Zyklen auf den niedrigsten möglich zu halten, um Chimärenbildung zu vermeiden und zu verringern Verstärkung Vorurteile, wenn man bedenkt, dass alle Proben mit der gleichen Anzahl von Zyklen amplifiziert werden. Um die Anzahl der polyklonalen liest und leeren Bereichen zu minimieren und die Anzahl von Lesevorgängen sollte die Qubit-Verhältnis zwischen 0,1 und 0,3 und das FAM-Fluoreszenz oberhalb von 200 verwenden eine 314-Chip auf einem Ion Torrent PGM ist, ist um den mittleren Ausgangs 0,3-0,5 M gute Qualität liest nach der Filterung der Ergebnisse in Mothur. Tabelle 2 zeigt eine typische Aufteilung der Anzahl der liest nach jedem Schritt des Verfahrens für einen Lauf mit 36 Multiplex-Umweltpsychische Proben mit Primern gezielt den V3-4 Region der 16S und unter Verwendung Mothur amplifiziert. In Mothur, die trim.seqs Verfahren erzeugen eine Datei "* .trim.fasta", die die Sequenzen, die den Qualitätsfilter und ein "* .scrap.fasta", die die Sequenzen enthält, die nicht den Qualitätsfilter zusammen mit dem Grund bestanden haben bestanden für die Ablehnung in der Sequenz-Header. Wenn mit Barcodes in der Datei "Oligos" geliefert, wird dieser Befehl auch eine Datei erzeugen "* .Gruppen", die die Gruppenzugehörigkeit eines jeden Sequenz basierend auf der Barcode-Sequenz enthält. Die classify.seqs Verfahren erzeugt einen ".tax.summary", die in Excel geöffnet werden kann. Diese Datei enthält die Zusammenfassung der taxonomischen Zugehörigkeit (in Zeilen) für jede der Proben (Spalten). Diese Datei kann für nachgeschaltete statistische Analysen verwendet werden und die Gemeinschafts Zusammensetzung an verschiedenen taxonomischen Ebenen zu visualisieren. Die Datei ".taxonomy" enthält die detaillierte taxonomischeZugehörigkeit für jede Sequenz. Die durchschnittliche Zusammensetzung der Gemeinschaft an dem Stamm / Klassenstufe in allen 36 Proben ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1. Durchschnittliche Community Komposition an der Stamm / Klasse-Niveau in allen Proben.

vorwärts	TACGGRAGGCAGCAG
Strichcode	CTAAGGTAAC	Sample01
Strichcode	TAAGGAGAAC	Sample02
Strichcode	AAGAGGATTC	Sample03
Strichcode	TACCAAGATC	Sample04
Strichcode	CAGAAGGAAC	Beispiel05
Strichcode	CTGCAAGTTC	Beispiel06
Strichcode	TTCGTGATTC	Sample07
Strichcode	TTCCGATAAC	Sample08
Strichcode	TGAGCGGAAC	Sample09
Strichcode	CTGACCGAAC	Beispiel10

Tabelle 1. Beispiel-Datei "Oligos" für den Einsatz in Mothur.

	Anzahl liest	% Der vorherigen Schritt	Durchschnittl. pro Probe
Anzahl der Wells	1262519	-	35.070
Wells mit Perlen	1114108	88.20%	30.947
Perlen mit Vorlagen	1112746	99,90%	30.910
Monoklonale Perlen	826.805	74.30%	22.967
Gute Qualität liest (Ausgabe vom Sequenzer)	782.204	94.60%	21.728
Pass Mothur Filter (min. Durchschnittl. Qualitätsfaktor von 20 über einen 50 Basispunkte-Fenster, min. Länge von 150 bp)	372.168	47.60%	10.338
Klassifiziert am Stamm Ebene in Greengenes (50% Konfidenz-Schwelle)	342.171	91.90%	9.505
Eingestuft in der Ebene der Familien in Greengenes (50% Vertrauensgrenze)	316.512	92,50%	8.792
Eingestuft in der Gattungsebene in Greengenes (50% Vertrauensgrenze)	289.899	91.60%	8.053

Tabelle 2. Anzahl der Lesevorgänge von einem typischen Lauf für 36 Umweltproben auf einer Ion Torrent 314 Chip gemultiplext produziert.

Diskussion

Die hier vorgestellte Methode ist unkompliziert und preiswert, und sollte es vielen Labors, die Macht der metagenomische Sequenzierung zugreifen. Obwohl sie in Abhängigkeit von der Sequenzierung Plattform abhängig, wenn die Bibliotheken konstruiert wenig praktische Zeit erforderlich, wobei die meisten der Verfahren ist automatisierbar. Für die Sequenzierungsplattform verwendet hier (Ion Torrent PGM) kann das komplette Verfahren innerhalb von zwei Tagen Arbeit durchgeführt werden. Im Moment des Schreibens (September 2013), waren wie folgt die Reagenzienkosten auf das Beispiel oben beschrieben bezogen werden: PCR-Amplifikation von 36 Proben: $ 25, Gel-Reinigung und PicoGreen DNA-Quantifizierung von 36 Proben: $ 125, Emulsions-PCR für eine gepoolte Amplikon Probe : $ 150 und Sequenzierungsreagenzien: $ 250, für einen Gesamtbetrag von $ 550 oder $ 15 pro Probe oder $ 0,0015 pro-Qualität gefiltert Lese. Dieser Preis umfasst nicht Instrument Servicevertrag Instrument Abschreibungen, Techniker Gehalt und Laborraumnutzung.

Zelt "> Eine der wichtigsten Schritte ist es, alle Produkte in einem äquimolaren Verhältnis zu bündeln, um eine ähnliche Anzahl von Abrufen liest für jede der Proben. PicoGreen Quantifizierung wurde hier verwendet, aber andere Verfahren geeignet sein könnten, wenn auch weniger genau (zB UV-Quantifizierung, Gel-basierte Quantifizierung). Selbst, indem Sie die genaue Quantifizierung und Pooling, gibt es eine gewisse Variabilität in der Anzahl der Lesevorgänge pro Probe und in der typischen Lauf in Tabelle 2 aufgeführt, von 4.380 bis 32.750 reicht es liest, mit einem Durchschnitt von 10.338 liest. Wenn der Verarbeitung große Anzahl von Proben (mehr als 40-50), Einzel Spalte Gel Reinigung kann durch Gel-Reinigung in Platte oder Reinigung mit Perlen mit einer strengen Grenzgröße ersetzt werden (zB AMPure Perlen) .

Bis heute ist die am häufigsten verwendete nächsten Generation Sequenzierungstechnologie für die 16S rRNA-Gen 454. Das Ion Torrent-Sequenzierungstechnologie in diesem Protokoll verwendet wird, ist konzeptionell sehr ähnlich454 und beide Technologien sind anfällig für die gleiche Art von Sequenzierungsfehlern. Nicht überraschend, wurde gezeigt, dass Ion Torrent-Sequenzierung ergab Sequenzierungsergebnisse sehr ähnlich 454-Sequenzierung ^10. Kürzlich haben viele Forscher die Verwendung von Illumina Technologie für 16S-rRNA-Gen-Amplikons Sequenzierung ^18,19 sucht. In jedem Fall wäre es einfach, den aktuellen Protokoll für andere Tisch Sequenzer wie die Illumina MiSeq oder 454 GS Junior durch eine Änderung der Fusions Primer-Sequenzen, um die Adapter und Barcodes für diese Sequenzierungstechnologien benötigt einstimmt, wie in der kürzlich beschriebenen Verfahren anzupassen für die Illumina MiSeq ^19. Alternativ könnten die Forscher Schritte 1 und 2 des Protokolls detailliert hier und senden Sie die gepoolten Amplikons zu einer Sequenzierungszentrum, wo die Emulsion PCR und Sequenzierung durchgeführt werden würde.

Das 16S-rRNA-Gen liest wurden beschnitten und klassifiziert mit Mothur, aber viele andere Analysen können durchgeführt werden, auf16S rRNA-Gen-Amplikons. Beispielsweise können beta-Diversität durch Berechnen der Abstände zwischen jedem Unifrac Probenpaare unter Verwendung des Verfahrens beschrieben in ausgewertet http://unifrac.colorado.edu/ ^20. Alpha-Diversität-Indizes und der Anzahl der Betriebs taxonomische Einheiten von jeder Probe können mit Tools wie innerhalb QIIME AmpliconNoise ²¹ oder nach dem Verfahren von Huse et al. ²² und innerhalb Mothur skizziert berechnet werden.

Die hier verwendeten Primer der variablen Regionen 3 und 4 von der 16S-rRNA-Gen, aber viele andere Regionen ausgerichtet werden konnte. In dieser Studie wurden die 16S-rRNA-Gene von Pflanzenmaterial verstärkt und die Wahl der Primer wurde hergestellt, um eine Amplifikation der Chloroplast 16S rRNA-Gen ^23,24 vermeiden. Es gibt eine Vielzahl von anderen Primern, die in Laufzeit der Produktlänge, Leistung und Nützlichkeit taxonomischen ^25,26 variieren. Jedoch in allen Fällen 200-400 bp liest der 16S rRNA-Gen nicht zuverlässig auf Artenebene eingestuft werden, und Analysen, die zur Gattung und höhere taxonomische Ebenen beschränkt. Andere Gene könnte besser geeignet sein, wenn Spezies-Ebene Informationen benötigt werden, wie die cpn60 und rpoB Gene ^27,28. Zukunft drastische Tropfen in die Kosten der Sequenzierung und steigt in die Macht der Analyseinstrumente könnte es möglich, 16S rRNA-Gen-Sequenzierung durch Schrotflinte Metagenomik ersetzen, aber bis dahin 16S-rRNA-Gen-Sequenzierung bleibt der Goldstandard der Umweltmikrobiologie.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion 314 Chip Kit v2	Life Technologies	4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2	Life Technologies	4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit	Life Technologies	4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit	Qiagen	203646
Primers and probes	IDT	NA
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BSA 20 mg/ml	Roche	10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001