16SリボソームRNA遺伝子アンプリコンの次世代シーケンシング

要約

Characterizing microbial community has been a longstanding goal in environmental microbiology. Next-generation sequencing methods now allow for the characterization of microbial communities at an unprecedented depth with minimal cost and labor. We detail here our approach to sequence bacterial 16S ribosomal RNA genes using a benchtop sequencer.

要約

微生物生態学の主要な問題の一つは、「そこには誰？」この質問は、さまざまなツールを使用して答えることができますが、長期的な金の規格の一つは、ドメインレベルのPCRによって生成された16SリボソームRNA（rRNAの）遺伝子アンプリコンを配列決定することですゲノムDNAから増幅する反応。伝統的に、これはクローニングおよびサンガー（キャピラリー電気泳動）PCRアンプリコンの配列決定によって行った。次世代シークエンシングの出現は、途方もなく簡略化し、16S rRNA遺伝子配列決定配列決定の深さを増加している。ベンチトップ·シーケンサーの導入は今、小さなラボ数日で、社内で自分の16S rRNAの塩基配列決定を行うことができます。ここでは、ベンチトップ型の次世代シーケンサーを用いた16S rRNA遺伝子アンプリコン配列決定のためのアプローチが詳述されている。環境DNAは、最初の配列決定アダプターとバーコードが含まれているプラ​​イマーを用いてPCRによって増幅される。次いで、それらを、エマルジョンPCRを介して球状粒子に結合されている。粒子がlである使い捨てチップ上oaded及びチップは、シークエンシングが行われた後、配列決定装置に挿入される。配列はFASTQ形式で取得し、ろ過し、バーコードは読み取るのサンプル·メンバーシップを確立するために使用されているされている。濾過し、ビニングされ、その後、さらに公的に利用可能なツールを用いて分析する読み取ります。読み込み例分析はMothurが指定されているソフトウェアパッケージ内の分類探知アルゴリズムで分類された。ここに概説された方法は、簡単な、安価で簡単であり、継続的なゲノム革命から利用するようにより小さなラボを助けるべきである。

概要

それは、環境試料中に含まれる遺伝情報の全体を対象としてメタゲノム配列決定は、非常に強力な技術です。ショットガン配列決定、大インサートライブラリおよびアンプリコンシークエンシングを含むメタゲノムシーケンシングのさまざまなフレーバーがあります。アンプリコンシークエンシングは、比較的、安価で高速で生成することができるという利点は、一般的に整列させることができる、単一のゲノム領域から読み取り提供しています。また、アンプリコンの配列決定のためのデータ分析のワークフローは、ほとんど標準化されている。それはPCRに基づいているので、それはせいぜい、このアプローチは、半定量的になり、不完全特異性、不完全な被覆およびプライマー^1,2を付勢する、に関連するすべてのバイアスを有している。いくつかのゲノム領域は、機能的遺伝子を含むアンプリコン配列決定のために標的とすることができるが、最も人気のあるオプションは、コミュニティプロファイルを生成するために、そのような16S rRNA遺伝子などのマーカー遺伝子を使用することである。伝統的に、16S rRNA遺伝子アンプリコンsequencingを大腸菌でクローニングを含め、労働集約的な技術を用いて実施した大腸菌 、コロニーピッキングと孤立プラスミド上サンガー配列決定に続いてプラスミド抽出し、、結果的に、ほとんどの研究は、サンプルあたり100未満のクローンを分析した。大規模な配列決定反応の並列化と、最も重要なのは、宿主内で遺伝子断片を挿入しなくても、テンプレートのクローンを分離：次世代シーケンシングは、2つの主要な進歩をもたらした。これは途方もなく、16S rRNAの遺伝子アンプリコンシークエンシング³のための「ルネサンス」で、その結果、すぐに戻って多くの環境微生物学研究のルーチン機能としてある16S rRNA遺伝子アンプリコンのシーケンシングを簡素化している。

2005 ⁴ロシュ454シークエンシングの登場以来、いくつかの他の次世代シーケンシング技術が市場に登場している（ 例えば、イルミナ、ソリッド、PacBio）。より最近では、ベンチトップ配列の導入RSは、小さなラボに大シーケンシングセンターに一回の排他的シーケンシング能力をもたらした。ファイブ卓上マシンは現在入手可能である：454 GSジュニア、イオントレント個人ゲノムマシン（PGM）とプロトン、およびイルミナMiSeqとNextSeq 500これらすべてのシーケンサーはあまり提供していますが、ほとんどのフルよりも実行し、ドル当たり少ない拠点ごとに読み込むスケールのシーケンサは、彼らは迅速な、より柔軟であり、その低買収し、実行コストは小さな大学の研究室のために彼らは手頃な価格になります。研究のこのタイプは一般的に、配列決定の極端な深さを必要としないため、ベンチトップ·シーケンサーは、環境微生物学研究における小さなゲノムおよび低複雑メタゲノムシーケンシングアンプリコンに特に適している。例えば、それは一般的に、16S rRNA遺伝子配列決定研究のための数は、サンプルごとに読み取ることが合意されている〜1,000百万がデータセット^5を読み込むのと同じパターンを生成することができます読み取るように、最優先事項ではありません。と言われたので、ベンチトップ次世代generatio nはシーケンサはまだ〜10のGBP（イルミナMiSeq）〜10月15日のGBP（イオントレントプロトン）、〜2のGBP（イオントレントPGM）、〜35 Mbpの（454 GSジュニア）の最大収率で、シーケンス·大量のデータを生成するほとんどの環境微生物学研究のために十分以上のものですと〜100のGBP（イルミナNEXT SEQ 500）。

ベンチトップ型シーケンサーを用いて16S rRNAのアンプリコンの次世代シークエンシングは、近年、さまざまな環境に適用されている。例えば、イオン·トレントPGMは、コミュニティのために使用されているオイルサンドの炭化水素で汚染された北極土壌^8,9の養殖システム^7は 、再循環により、特に高いpH及び低い透過^6を持っていたウラン鉱山尾鉱、採掘の影響を受ける堆積物の分析と汚染された土壌¹²に植え柳の根圏の、ヒトおよび動物の体の^13〜16と嫌気性消化槽¹⁷のアサバスカ川^10,11からバイオフィルム、。

この貢献私たちの具体的jove_content ">ベンチトップ次世代シーケンサー（イオントレントPGM）を使用して、社内で16S rRNA遺伝子アンプリコンを配列決定するために私たちのアプローチ。DNA抽出後、16S rRNA遺伝子が含まれているドメインレベルの細菌のプライマーを用いて増幅しているシークエンシングアダプターとユニークな、試料特異的配列（バーコード）。アンプリコンを精製し、等モル比で定量し、プールした。プールされたサンプルは、その後クローン的エマルジョンPCRで増幅され、配列決定されているが、得られた配列は、公的に利用可能なバイオインフォマティクスツールを用いて分析している（ たとえば、Mothur）。

プロトコル

フュージョン法による1の16SrRNA遺伝子アンプリコンライブラリの準備

1. プライマー（フォワード、F343-IONA-MIDXX解凍：5'-CCA TCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG AC T CAG XXX XXX XXX XTA CGG RAG GCA GCA G-3 ';、R533-IonP1リバース：5'-CCT CTC TAT GGG CAG TCG GTG AT A TTA CCG CGG CTG CTG GC-3 ';ボールド：イオントレント特定のアダプター;斜体：シーケンシングの実行の開始時に信号強度を較正するためのキーであり、正規のフォント：鋳型特異的なプライマーであり、X ... X：10 bpのバーコード、いくつかのバーコード配列については表1を参照）、2倍HotStartTaqプラスマスターミックスとサンプル。穏やかに混合されるべきであるマスターミックスを除いて、使用前に十分に混合します。
2. リバースプライマー0.5μM、0.4ウシ血清アルブミン（BSA）のmg / mlのおよび1×HotStartTaqプラスマスターミックスをPCRミックス（20μlの反応）を準備します。 Eにマスターミックス18.5μl添加ACH PCRチューブ。
3. 一緒に配列決定されるサンプルごとに異なる​​バーコードがフォワードプライマー（20mMの0.5μl）を追加します。 PCRチューブにサンプルを1μl（1-10 ngの/μl）を添加。
4. PCR装置にチューブを配置し、次のプログラムを実行します。95℃で5分間初期変性; 45秒間、30秒、72℃30秒、55℃、95℃の25サイクル; 10分間72℃で最終伸長。 PCR産物を4℃に保っCO / Nまたは使用するまで凍結することができる。

2アンプリコン精製、定量およびプーリング

1. 利用可能な最大の櫛を使用して、2％アガロースゲルを準備します。よく空の各試料を分離、ゲル上での反応や負荷に6×ゲルローディング色素5を添加する。 50分間70 Vでゲルを実行します。
2. ゲルの写真を撮るとバンド（250bpの周りが期待サイズ：190 bpの産物を加えた63塩基対のアダプターおよびバーコード）を切断清潔なメスを使用しています。
3. は切除したバンドを計量し（ たとえばと、キアクイックゲル抽出キット）PCR産物のゲル抽出および精製を進める。
4. ピコグリーンで各PCR産物を定量化し、5×10 ⁹分子/μL（約1 ngの/μL）での保存溶液を得るために、希釈液を作る。いくつかのサンプルがより低い増幅を示された場合は、以降の操作に適した最低濃度は1.57×10 ⁷分子/μL（26 PM）であることを念頭に置いて、より低い濃度に希釈液を調整します。
5. 希釈した各PCR産物のプール10μlのサンプルを、等モルのプールを得た。計画されたシーケンシングの実行ごとに1つの別のプールを準備します。使用するまで、プールされたPCR産物は、冷凍庫に保つことができる。

3エマルジョンPCRおよびシーケンシング

1. エマルジョンPCR法を実行します。
   1. 25μlの容量で26 PMにプールされたPCR産物を希釈する。イオンPGMテンプレートキットからの試薬を解凍する。
   2. エマルジョンPCRミックスを調製する（キットに提供される試薬）をPCRフード内やベンチにプールされたPCR産物と球粒子（提供）を追加します。完全に混合し、フィルターカートリッジに混合物を挿入し、慎重に乳化油（付属）でトップ。
   3. ゆっくりと自動化されたエマルジ ​​ョンPCR装置（ 例えば、イオンワンタッチ2計器）上のフィルターカートリッジと負荷が逆になります。適切なプログラムを選択し、手順を開始する。
2. PCRが完了した自動化されたエマルションの後、採血管からの上清を除去し、チューブの底に球粒子を取り出す。 （キットに付属）洗浄溶液100μl中球を再懸濁し、ライブラリ定量化のための2.0μlのアリコートを取る。
3. 図書館定量化を実行します。
   1. アダプターB'-ファム2μlの（5'-FAM -CTでSSPEバッファー（150mMのNaCl、10mMののNaPO _4、1mMの_硫酸ナトリウム-EDTA）100μlをミックスG AGA CTG CCA AGG CAC ACA GGG GAT AGG-3 '）プローブとアダプターA-Cy5を2μlの（5'-Cy5の -CCAのTCT CAT CCC TGC GTG TCT CCG ACT CAG-3'）プローブ。ステップ3.2で撮影2.0μlのアリコートにこの混合物の52μLを加え、定量化のためのブランクとして残り52μlに（テンプレートキットから）の洗浄溶液2μlを加える。
   2. 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。 1.5ミリリットルチューブ内での混合物を転送します。
   3. RTで3分間15,500×gでTEX緩衝液（10mMのTris、1mMのEDTA、0.01％トリトンX-100、pH8.0）を1.0mlのは、ミックス遠心分離して下さい。上清を除去し、各チューブに20μlのままにしておきます。この洗浄操作を2回繰り返します。
   4. 、TEXバッファー180μl添加し、ペレット化した粒子を再懸濁し、500μlの量子ビットチューブに移す。
   5. 量子ビット装置を用いて、FAMと​​Cy5用の蛍光を測定し、イオンコミュニティウェブサイトで利用可能な計算機を使用して、正球の割合を算出。
4. 自動化された濃縮システム（ 例えば、イオンワンタッチエンリッチメント·システム）を使用して（増幅されたDNAを含む）は、正球について球粒子の残りを豊かにする。
   1. 提供さ8ウェルストリップの適切なウェルにおけるピペットで試薬：まあ1：ステップ3.2から球体粒子;さて2：予め洗浄のMyOneストレプトアビジンC1ビーズ（13μl）を;さて図3、図4および5：洗浄溶液（テンプレートキットで提供される）; 6さて：空;さて7：溶融オフ溶液（125 mMのNaOHを、0.1％のTween 20）;さて8：空。
   2. ピペッティングアームの先端と試料採取用の0.2ミリリットルチューブを取り付けます。楽器を起動します。濃縮の終了時に、溶液（提供）を中和する10μlのを追加します。濃縮されたビーズは、最大15日間4℃に保つことができる。
5. シークエンシング装置を初期化します。
   1. シーケンシングの実行の詳細を指定して、シークエンシング機器に接続し、シーケンシングの実行計画を準備します。
   2. Installの洗浄溶液＃2（イオンPGM配列決定キットで提供される）、洗浄溶液＃1（350μlの100mMのNaOH）で、自動pH緩衝液（付属）。
   3. 初期化手順を開始して、それぞれの50mlチューブでのdATP、dGTPをdCTP及びdTTPのヌクレオチド（提供）を追加メッセージが表示されたら。配列決定装置上にチューブをねじ込み、初期化手順を続行します。初期化が完了すると、すぐに実行手順を開始する。
6. 配列決定のためのサンプルを準備し、チップをロードします。
   1. 1.5分間15,500×gで遠心分離することにより、チューブの底にステップ3.4から濃縮球を収集します。正確に3μLを残して上清を取り除きます。
   2. （配列決定キットで提供される）の配列決定プライマーの3μl加え、粒子を再懸濁させ、上下にピペッティングすることによって十分に混合して。 2分間、次いで37℃で、2分間95℃でインキュベートする。
   3. ポリメラーゼ1μlの（付属）を追加し、よく混ぜincub5分間RTで食べた。 30分以内にシークエンシングチップ上の酵素球の混合物をロードするために進んでください。
   4. インキュベーションの間、シーケンサー上でシーケンシングチップをロードして、チップの品質チェックを行う。遠心分離することにより、チップから液体を取り出し、ゆっくりと酵素球ミックス（7μl）をダウンピペッティングとチップ内の気泡の導入を回避することにより、チップ内のサンプルをロードします。
   5. マイクロ遠心、1分間のチップを3回遠心します。各遠心分離、チップの向きを変更し、各実行間に上下にピペッティングして混ぜる。
   6. 機器内のチップをロードし、実行を開始します。

4。基本シーケンスデータ解析

1. 配列データ·サーバに接続し、FASTQファイルをダウンロードします。 （ 表1の例を参照）プライマーおよびバーコード情報を含むタブ区切りの「オリゴ」ファイルを作成します。名言からGreengenes参照ファイルをダウンロードホ·ウェブサイト（ http://www.mothur.org/wiki/Taxonomy_outline ）。
2. Mothurを起動して、分析を実行します。
   1. 次のコマンドを使用して、FASTA及び品質ファイルにFASTQファイルを変換しますfastq.info（FASTQ = test.fastq）
   2. 、trim.seqs（FASTA = test.fasta、オリゴ= barcode.txt、qfileにより= test.qual、qwindowaverage = 20、qwindowsize = 50、minlength = 150：各シーケンスのグループメンバーシップを決定し、次のコマンドを用いて配列をトリミングkeepforward = T）
   3. さまざまなオプションが所望のストリンジェンシーに応じて変更することができる
   4. 次のコマンドを使用してgreengenes分類法における配列の分類：classify.seqs（FASTA = test.trim.fasta、方法=王、グループ= test.groups、テンプレート= gg_99_otus.fasta、分類学= gg_99_otus.tax、カットオフ= 50）

結果

シリカゲル上での精製後、PCR増幅の25サイクルで、増幅産物を水50μl中に0.2〜10.0 ngの濃度で通常である。これは出発DNA濃度、サンプルの種類、使用する精製キットによって大きく異なる場合があります。これは、全てのサンプルが同じサイクル数を用いて増幅されるべきであることを念頭に置いて、キメラ形成を回避し、増幅偏りを減少させるために可能な限り最低にPCRサイクルの数を維持することが推奨される。ポリクローナルの数が読み込み最小限に抑え、空の球と読み込みの数を最大にするために、量子ビットの比は0.1と0.3の間であるべきであるとFAM蛍光がイオントレントPGM上の314チップを使用した200を超えるべきである、平均出力は約ある0.3〜0.5 Mは良い品質はMothurの結果のフィルタリングの後に読み込まれます。 表2は、36の多重化は、environを含む実行の手順の各ステップの後に読み込むの数の典型的な内訳を示し精神的サンプルは16SのV3-4領域を標的とするプライマーを用いて増幅し、Mothurを用いて分析した。 Mothurでは、trim.seqs手順は品質フィルターと理由と共に品質のフィルターを通過しなかった配列を含む「* .scrap.fasta」を渡された配列を含む「* .trim.fasta」ファイルを生成するシーケンスヘッダにおける拒絶反応のために。 「オリゴ」ファイルにバーコードが供給されると、このコマンドは、バーコード配列に基づいて、すべての系列のグループメンバーシップを含む「* .groups」ファイルが生成されます。 classify.seqs手順は、Excelで開くことができる「.tax.summary」を生成する。このファイルには、（列のように）サンプルのそれぞれについて、分類学的所属（行数）の要約が含まれています。このファイルは、下流の統計分析のために使用することができ、さまざまな分類学的レベルでのコミュニティの組成物を視覚化する。 「.taxonomy」ファイルは、詳細な分類学的が含まれています各シーケンスのために所属。すべての36の試料にわたる門/クラスレベルで平均コミュニティ組成物は、 図1に示されている。

すべてのサンプル間で門/クラスレベルで1の平均群集組成図。

フォワード	TACGGRAGGCAGCAG
バーコード	CTAAGGTAAC	Sample01
バーコード	TAAGGAGAAC	Sample02
バーコード	AAGAGGATTC	Sample03
バーコード	TACCAAGATC	Sample04
バーコード	CAGAAGGAAC	Sample05
バーコード	CTGCAAGTTC	Sample06
バーコード	TTCGTGATTC	Sample07
バーコード	TTCCGATAAC	Sample08
バーコード	TGAGCGGAAC	Sample09
バーコード	CTGACCGAAC	サンプル10

Mothurで使用するため、表1の例」オリゴ」ファイル 。

	＃の読み込み	前のステップの％	平均。サンプル当たり
井戸の数	1262519	-	35070
ビーズとウェルズ	1114108	88.20パーセント	30947
テンプレートとビーズ	1112746	99.90パーセント	30910
モノクローナルビーズ	826805	74.30パーセント	22967
良質の読み取り（シーケンサからの出力）	782204	94.60パーセント	21728
峠Mothurフィルター（最小平均50bpのウィンドウ上の20の品質スコア、最小150bpの長さ）	372168	47.60パーセント	10338
GreenGenesにおける門のレベルで分類された（50％信頼閾値）	342171	91。90％	9505
GreenGenes家族レベルで分類された（50％信頼閾値）	316512	92.50パーセント	8792
GreenGenes属レベル（50％信頼閾値）で分類	289899	91.60パーセント	8053

1イオントレント314のチップ上に多重化さ36環境試料のための典型的な実験から生成された読み取りの表2数。

ディスカッション

ここで紹介する方法は、簡単で安価であり、多くの研究室が、メタゲノムシーケンシングの力にアクセスすることを可能にする必要があります。それが使用されるシーケンシングプラットフォームに応じて異なるが、一回のライブラリは、プロセスの大部分が自動化されていると非常に少ないハンズオン時間は、必要とされる構成されている。ここで使用されるシーケンシングプラットフォーム（イオントレントPGM）のために、完全な手順は、作業の2日以内に行うことができます。 36サンプルのPCR増幅：25ドル、ゲル精製および36サンプルのピコグリーンDNA定量：125ドルを、エマルジョンPCRは、1プールされたアンプリコン試料について、以下のように（2013年9月）を書いている時点では、上記の詳細な例に関連する試薬の費用であった：550ドルまたはサンプルあたり15ドルまたは品質フィルタリング読み取りあたり0.0015ドル、合計250ドル、$ 150と配列決定試薬。この価格は、機器、サービス契約、機器の減価償却費、技術者の給与および実験室スペースの使用は含まれていません。

10トン ">最も重要なステップの一つは、ピコグリーン定量化は、ここで使用された。試料のそれぞれのために読み込みますが、他の方法が適しているかもしれません、しかしあまり正確で同様の数を取得するために、等モル比ですべての製品をプールすることである（ 例えば、UV定量、ゲルベースの定量化）。どんなに正確な定量とプーリングを行うことによって、ある程度の変動は、サンプル当たりの読取りの数が存在し、 表2に詳細に典型的な実験では、4,380から32,750の範囲であるサンプル（40〜50以上）の多数を処理した場合、10338の平均読み出すとともに、単一列のゲル精製、厳しいサイズカットオフ（ 例えば、AMPureビーズ）を有するビーズを用いてプレートまたは精製ゲル精製によって置き換えることができる読み取り。

現在までに、16S rRNA遺伝子のために最も使用される次世代シークエンシング技術は、このプロトコルで使用される454ザ·イオン·トレントシークエンシング技術は、概念的に非常に似てい454へと両方の技術は、配列決定エラーの同じタイプの傾向がある。当然のことながら、それはイオントレントシーケンシングは、454 ¹⁰に非常に類似の配列決定の結果をもたらしたことが示された。最近では、多くの研究者は、16S rRNA遺伝子アンプリコンシークエンシング^18,19のためのイルミナ技術の使用を検討している。いずれの場合も、この方法で最近記載のように、これらの配列決定技術のために必要なアダプタとバーコードと一致するように融合プライマー配列を変更することにより、イルミナMiSeqまたは454 GSジュニアのような他のベンチトップのシーケンサーのための現在のプロトコルを適合させることが容易であるイルミナMiSeq ^19。代わりに、研究者は、手順1と、ここで詳細なプロトコルの2に従い、エマルジョンPCRおよび配列決定が実行されるであろうシーケンシングセンターにプールされたアンプリコンを送信することができます。

16S rRNA遺伝子をトリミングし、分類されたMothurを使用して、他の多くの分析が上に行うことができますし、読み取り16S rRNA遺伝子アンプリコン。例えば、ベータ多様性で概説した手順を用いて、各サンプルペア間Unifrac距離を計算することによって評価することができるhttp://unifrac.colorado.edu/ ^20。アルファ多様性指数と、各サンプルの操作分類学的単位の数はAmpliconNoise ²¹のようQIIME内のツールを使用して、またはHuse らによって概説された手順を用いて算出することができる^。22とMothur内で利用できる。

ここで使用したプライマーは、16S rRNA遺伝子の可変領域3及び4を増幅したが、他の多くの領域が標的化され得る。本研究では、16S rRNA遺伝子は、植物材料から増幅し、プライマーの選択は、葉緑体16S rRNA遺伝子^23,24の増幅を避けるために行われた。製品の長さ、分類学上のパワーと有用性^25,26の任期が異なる利用可能な他のプライマー、多種多様があります。しかし、すべての場合において200-400 bpが確実に種レベルで分類することができない16S rRNA遺伝子の読み取り、および分析は、属、より高い分類学的レベルに制限されています。種レベル情報がCpn60ととのrpoB遺伝子^27,28のように、必要な場合に他の遺伝子は、より適切である可能性があります。分析ツールのパワーシーケンシングおよび増加するコストの今後の大幅な滴が散弾銃のメタゲノミクスにより16S rRNA遺伝子シーケンシングを交換することが可能になるかもしれないが、それまでの16S rRNA遺伝子配列決定は、環境微生物学のゴールドスタンダードのまま。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ion 314 Chip Kit v2	Life Technologies	4482261
Ion PGM Sequencing 200 Kit v2	Life Technologies	4482006
Ion PGM Template OT2 200 Kit	Life Technologies	4480974
HotStarTaq Plus Master Mix Kit	Qiagen	203646
Primers and probes	IDT	NA
Qiaquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
BSA 20 mg/ml	Roche	10,711,454,001
Dynabeads MyOne Streptavidin C1	Life Technologies	65001