הקלטות ארוכות טווח בו זמנית בשני שלבים עצביים עיבוד במתנהגים דבורי דבש

Summary

הקלטות ארוכות טווח תאיים בו זמנית משני neuropiles המוח שונה או שני קטעים אנטומיים שונים הוקמו בדבורי דבש. הקלטות אלה מאפשרות החקירה של היבטים זמניים של עיבוד עצבי על פני אזורים שונים במוח בנוירון הבודד, כמו גם ברמת ההרכב בבעלי חיים מתנהגים.

Abstract

בשני יונקים וחרקים מידע עצבי מעובד במרכזים במוח מסדר גבוה יותר ונמוך יותר שונים. מרכזים אלה הם מצמידים באמצעות מתכנסים וקשרים אנטומיים מסתעף כולל הזנה קדימה וחיווט משוב. יתר על כן, מידע מאותו המוצא נשלח באופן חלקי דרך שבילים מקבילים לשונה ולפעמים לאותם אזורים במוח. כדי להבין את היתרונות אבולוציוניים, כמו גם את היתרונות חישוביים של אסטרטגיות החיווט הללו ובמיוחד התלות הזמנית שלהם אחד על השני, זה הכרחי כדי לקבל גישה בו זמנית לנוירונים בודדים של שטחים או neuropiles שונים באותה ההכנה ברזולוציה גבוהה זמנית. כאן אנו להתרכז בדבורי דבש על ידי הוכחת גישה לטווח ארוך תאית ייחודית להקליט פעילות יחידה רבת בשתי neuropiles הבא ^1, באונה המחושים (AL), השלב הראשון חוש הריח העיבוד וגוף הפטרייה (MB), invo מרכז אינטגרציה מסדר גבוה יותרlved בלמידה וביצירת זיכרון, או שני קטעים עצביים במקביל ² חיבור AL עם מגה בייט. האחרון נבחר כדוגמה ויהיה מתואר במלואו. בסרטון התמיכה בבנייה וההחדרה קבועה של אלקטרודות חוט רבת ערוצים גמישים באו לידי ביטוי. הגברה ההפרש Pairwise של ערוצי אלקטרודה חוט מיקרו באופן דרסטי מפחיתה את הרעש ומוודאת כי המקור של האות קשור קשר הדוק למצב של הקצה האלקטרודה. הגמישות מכאנית של אלקטרודות החוט משמשים מאפשרת הקלטות ארוכות טווח פולשנית יציבה לאורך שעות רבות עד ימים, וזה יתרון ברור בהשוואה לטכניקות הקלטה קונבנציונליות נוספות ותאיות בגוף חי.

Introduction

דבורי דבש, כמו גם רוב חרקים אחרים להסתמך בכבדות על חוש ריח. בין השאר הם משתמשים ברמזי חוש הריח להתמצאות, הזדווגות, תקשורת עם בני מין, וחיפוש אחר מזון. מערכת חוש הריח פירט גם תורמת לרפרטואר עשיר של התנהגויות למידה הקשורות לגירויי ריח פרחוניים. ניתן ללמוד התנהגויות אלה בקלות בתנאי מעבדה מבוקרת (לסקירה ראתה ^{3 - 5).} "המוח של המיני" שלהם (cp. ⁶⁾ עם המספרים הקטנים יחסית של נוירונים עושה דבורת דבש אורגניזם מודל מתאים גם ללימוד קידוד חוש הריח והלמידה במהלך הניטור של פעילות עצבית.

מערכת חוש הריח בחרקים, כמו גם ביונקים מציגה ארגון מקביל במידה רבה (לסקירה ראה ^7,8). בדבורי דבש כ -80,000 קולט נוירונים ⁹ ממוקמים בsensillae לאורך האנטנות ^10,11 לתרגם את גירוי הריח הסביבתי לneurאות onal. האקסונים מתאי עצב קולטני ריח מעצבבים את אונת המחושים (AL), שבה יש ארגון גלומרולרי דומה לנורת חוש הריח החוליות. AL מהווה כ 164 glomeruli מחובר אחד עם השני על ידי כ -4,000 interneurons המקומי (LN) (לסקירה ראה ^12). במיוחד בדבורת הדבש זה הוכח לאחרונה כי LNs לספק קישוריות לרוחב אחידה ושאוכלוסיות שונות בעלי תכונות הרחה יסודות וconfigural קידוד ^13,14. AL הוצג להיות מחולקים לאונת הגחון וחמים הגבי והוליד המדיאלי והדרכים לרוחב מחושים אונה (m-ו-L-ALT; לשעבר כינה מ-ו-L-APT להמדיאלי וprotocerebral אונת מחושים לרוחב מערכת ^15-17). הנה מינוח בדרכי חדש הוצג על ידי מאמץ האחרון למינוח אחיד של מוח החרק ישמש ^18. שני alts (l-ו-M-ALT) לשלב גם 410 proje uniglomerular (l-ALT) או 510 (m-ALT)נוירונים ction (PN), בהתאמה ^15,16,19. לאחרונה PNS של שני קטעים הוכחו ריחות קוד ^ב2 מקבילים (לסקירה ראה ^17,20), ושני קטעי synaptically ליצור קשרים מסועפים עם תאי קניון (KC), גוף הפטרייה (MB) נוירונים עיקריים. כל MB מכיל כ 172,000 KCS ^21-23. מ"ב ידועים להיות מעורב בשילוב גירוי, למידה, ויצירת זיכרון. דנדריטים axo של KCS להקים peduncle (הגזע של הפטרייה), שבו יש שני אזורי פלט עיקריים: vertica או אלפא אונה ^ו22,24 אופקיים או בטא אונה. הפלט של MB מתכנס רק על 400 נוירונים חיצוניים (EN) ^24. ENS אחראי על עיבוד מידע הרחה בעיקר מעצבב את היבט הגחון של האונה האנכית ^22. לאחרונה, זה כבר הראה כי ENS נרשם באזור זה לקודד את עמותת הפרס ריח ^25.

זמני כמוpects בתוך מערכת חוש הריח של חרקים, כמו גם בעלי חוליות הפכו היבט חשוב ומשמעותי כעיקרון קידוד פוטנציאל ^26-29. כדי להיות מסוגל להקליט בו זמנית מספר רב של נוירונים מאתרים שונים ברזולוציה גבוהה זמנית, הקמנו טכניקות הקלטת יחידה כפולות רב באמצעות אלקטרודות תיל ערוץ מותאמות אישית רב הציגו לאזורי יעד שונים במערכת ההרחה של הדבורה. גישה זו מאפשרת לנו לנתח ולהשוות בין עיבוד זמני במערכת ההרחה דבורת הדבש ברמה של תאי עצב ואוכלוסיות של תאי עצב או בין מסלולי הרחה מקבילים, המסלול הכפול ההרחה ² או בין neuropils שלאחר מכן שונה ¹ אחד. לאחרונה עם גישה ניסויית דומה במערכת ההרחה ארבה ³⁰ שימוש בתצורה של אלקטרודות שונה היו מסוגלים לנתח את מנגנון קידוד spatiotemporal להכרה ריח רקע בלתי משתנה ^{ביום 31.} האותנו, את ההקלטות כפולים הוקמו מאפשרות איסוף מידע מרחבי על פרופילים של פעילות עצביות בו זמנית.

בהשוואה לדגימה מרחבית הרחבה יותר המתקבלת מהדמית סידן בשיטה זו מאפשרת הקלטה משתי נקודות בלבד. עם זאת, היתרון בהשוואה לשיטות הדמיה סידן הוא הדיוק הגבוה הזמני של הקלטות פוטנציאל פעולה, אשר אינו יכול להיות מסופקות על ידי או הדמיה CCD קונבנציונלית או רכישת הדמיה 2 פוטונים. אלקטרודות תאי שתוארו כאן באופן קבוע מושתלות וקבוע ביחס למוח וכמוסת ראש הימנעות נדידת האלקטרודה. זהו יתרון ברור בהשוואה לשימוש באלקטרודות תאית חדה. יתרון נוסף בהשוואה להקלטות תאית והדמיה סידן הוא זמן תצפית עצבית המורחב החל משעות רבות עד ימים. זה תנאי חשוב לחקור וקושרת עצבית של היווצרות למידה וזיכרון. יתרונות נוספים של רבהקלטות יחידה מתוארות נוסף בסעיף הדיון.

בסקירה מתודולוגית זה הליך הייצור של אלקטרודות תיל עיצוב המותאם אישית תוכלו לראות, שהותאם ^מ32,33 ומתאים להקלטות יחידה רבת לטווח ארוך במוח דבורת הדבש. בנוסף, דוגמא כיצד סוגים אלה של האלקטרודות מושתלים באופן קבוע בשני אתרי הקלטה שונים בתוך מערכת ההרחה דבורת הדבש כדי להקליט בו זמנית l-וה-M-ALT על פני תקופות זמן כדי לאפשר לפרוטוקולי גירוי רבים ארוכות מוצגת ^2. לצורך אימות עמדות הקלטת דוגמא ופרוטוקול להדמיה מכתים והודעת הקלטה של ​​אתרי ההקלטה מסופקת.

Protocol

1. אלקטרודה בנייה (איור 1)

1. ייצור של מתאם אלקטרודה שמתאים את האלקטרודה ממשק הלוח של ^1,2,25 מערכות מגבר רב ערוצים מסחריים.
   1. השתמש בצלחת פלסטיק קטנה דבוקה לבסיס מחבר 18 פין.
   2. חבר את הבסיס עם 3 קטעים קצרים של תיל מבודד ל3 זיזי הלחמה נפרדים מוברגים לצלחת הפלסטיק (איור 1 A1-A3).
   3. הכנס חריץ לתוך צלחת הפלסטיק שבו נימי זכוכית יכולות בקלות לעבור ולהיות מוחזקות במקום על ידי בורג (איור B1 1).
   4. להאריך את נימי זכוכית על 5 מ"מ באמצעות סיכת minutien.
   5. צרף את חוטי האלקטרודה מיקרו לאורך סיכת minutien ונימי הזכוכית כדי להבטיח ייצוב ותמיכה.
2. ייצור חוטי מייקר רב ערוצית (שאומץ מRyuichy אוקאדה ^32,33)
   1. תוחלת 3 חוטי מיקרו (חוטי נחושת פוליאוריטן מצופים, 15קוטר מיקרומטר), באופן שהם ממוקמים אחד ליד שני (איור B2 1).
   2. שימוש במחט הלחמת 12 V להפיץ שכבה דקה של שעוות שיניים התכה נמוכה (C ° 50) באופן חלקי לאורך החוטים כדי להדביקם (קצה האלקטרודה) (איור 1 B3). השאר כמה סנטימטרים unglued (סוף אלקטרודה) כסעיף זה ישמש מאוחר יותר לחבר את חוטי מיקרו עם מתאם האלקטרודה.
3. חבר את כבל מיקרו הרב ערוצים למתאם אלקטרודה
   1. הסר את נימי זכוכית מהמחזיק ולצרף אותו עם סיכת minutien לקצה האלקטרודה. להביא אותו לעמדה מקבילה למייקרו אלקטרודה (B3 Figure1).
   2. מדביקים את הקצה האלקטרודה לפין minutien באמצעות שעוות שיניים התכה נמוכה ולחתוך את האלקטרודה מיקרו בקצה, בולט 2-3 סנטימטר מפיני minutien ובסוף האלקטרודה (חיצים קטנים איור B3 1).
   3. Slip sl הנימיםightly בחזרה לתוך מתאם האלקטרודה. השתמש בבורג כדי לתקן את זה (איור B4 1).
   4. הלחם את הקצוות החופשיים של שלושה חוטים לזיזי הלחמה באמצעות אקדח הלחמה עם טמפרטורה של כ 360 ° C כדי להבטיח היתוך של הבידוד (איור B4 1). לאחר הלחמה, להבטיח כי יש קשר נאות חשמלי (~ 300 kOhm).
   5. הר אחד של אלקטרודות (אב) לאלקטרודה ממשק הלוח של headstage ולתקן את האלקטרודה האחר רב ערוצים (עבדים) במתאם נפרד. חבר את הערוצים של העבד להאלקטרודה השנייה (איור 1 C1). בנוסף, לרתך את ההתייחסות, כמו גם אלקטרודות שרירים לבסיס האלקטרודה השנייה (איור 1 C2).

2. Bee הכנה (איור 2)

בניסויים שתוארו אלה, דבורת הדבש (Apis mellifera), אשר הוא בעלי חיים חסרי חוליותולכן אינו דורש אישורים אתיים ספציפיים לשימוש, הוא בשימוש.

1. לתפוס מלקטי מזון דבורת דבש (mellifera א) בכניסה הכוורת בבוקר, כפי שמוצג על ידי אחרים ^34,35.
2. צ'יל הדבורים על קרח כתוש עד חוסר תנועה (5-10 דקות) ולתקן אחד בבעל פרספקס סטנדרטי או צינור מתכת בצורה שהראש חשוף (איור 2). לצמצום תנועות הראש להשתמש בשעוות שיניים התכה נמוכה (~ 50 מעלות צלזיוס) ולתקן את הראש בזהירות לבעל סביב הבסיס של העיניים מורכבות והצוואר.
3. השתמש בשעוות התכה נמוכה לקבע scapi של האנטנות על הקפסולה הראש (איור 2 ב ') בלי לגעת שבוטון. השוטון של האנטנה צריך להיות הצביע קדימה. ודא שהדבורה יכולה להזיז חוטם שלה באופן חופשי.
4. לגלח את ראש הקפסולה כדי להבטיח נוף וגישה לחלק העליון של הראש באין מפריע.
5. להאכיל את הדבורים בתמיסת סוכרוז 30% עד saturatiעל מנת להבטיח הרטבה מספקת של רקמת המוח ויכולת קיום טוב של בעל החיים (איור 2 C).
6. לעשות חתכים זהירים אנכי לאורך הגבולות של העיניים מורכבות ואופקיים מעל בסיסי מחושים כמו גם מתחת לocelli ולהסיר את החתיכה הרופפת של ציפורן (איור 2 ד ').
7. להגדיר בזהירות בצד בלוטות hypopharyngeal ולהסיר את קנה הנשימה כדי להבטיח נוף וגישה למוח לפני אלקטרודה הכנסה (2E דמויות, 2F) ברורים.

3. אלקטרודה קלטי

במקרה הדוגמא באיור 2, אלקטרודה אחת ממוקמת מכוון l-ALT, והשני מכוון על M-ALT ^2. באמצעות ציוני דרך מסוימות, אזורי יעד אחרים אפשריים, כמו גם, לדוגמא אזורי הפלט אל על וMB ^1.

1. מקם את האלקטרודות באמצעות micromanipulators באזור של עניין ( איור 2G ו 3 א). כדי למקד את המקום מ '-ALT האלקטרודה בין AL ומדיאלית מהאונה האנכית של מגה בייט. ודא להיות מעל נקודת PNS ALT mediolateral הסתעפות אתר ההכנסה. בולט אלקטרודה למוח עם עומק של כ -180 (2E איור) מיקרומטר. למקום הקלטת l-ALT PN האלקטרודה מתחת protocerebrum לרוחב (LH) באמצע קו דמיוני בין הצד לרוחב של אונה אנכית ואמצע AL. הכנס את האלקטרודה עם עומק של כ -300 מיקרומטר (איור 2E)
2. הכנס את ההתייחסות (חוט כסף, על 25 מיקרומטר קוטר) לעין המורכבת ipsilateral דרך חתך קטן בציפורן. הכנס חוט כסף נוסף לאזור הקרנת שרירים מתחת לocelli לרוחב. הערה: אם יש צורך בהתנהגות של דבורי הלמידה יכולה להיות במעקב עם דיוק גבוה זמני על ידי הקלטת השרירים M17, שהוא מעורב in תגובת הארכה חוטם (PER) של הדבורה ³⁶ כפי שמתוארת ^ב25.
3. לעגן באופן יציב אלקטרודות בתוך המוח ואת הקפסולה הראש, מכסה את החלל כולו מעל המוח עם שני סיליקון הרכיב (איור 2H), אשר ימנע את המוח מהתייבשות. הערה: ההקלטות יכולות להימשך שעות עד ימים, והוא יכול למשל להיות מוקלטים הדבורים במהלך הליך קלאסי אוויר (איור 2H) או מגורה עם פנל גדול של ריחות שונים.

4. רכישת נתונים ועיבוד מקדים

1. השתמש בתוכנת רכישה ראויה שעונה על הדרישות הבאות: קצב דגימה של kHz דקות 25; אנלוגי ^1,25 או בידול צלב ² דיגיטלי בין ערוצי האלקטרודה; להקה לעבור סינון מ300 הרץ עד 8,000 Hz לחלץ אירועי ספייק.
2. השתמש בתוכנת ספייק מיון זמינה כדי לחלץ את פעילות יחידה אחת, למשל templאכל טכניקות התאמה כפי שנכלל בתוכנת Spike2 (איור 3).
3. לניתוח נוסף להשתמש בבולים של יחידות חילוץ בזמן כדי לחשב יחידה אחת בממוצע תגובות ריח (איור 4) או לחשב וקטורי אוכלוסייה לקרן רכיב ניתוח (PCA) (איור 5) באמצעות תוכנה זמינה באופן מסחרי. כדי לנתח יחידה אחת וחביון תגובת אוכלוסייה נוסף אנא להשוות פרסומים אחרונים ^1,2,25.

5. ויזואליזציה של עמדת אלקטרודה יחסית (איור 4)

1. טובלים את הטיפים אלקטרודות לתוך תמיסה של 5% או Alexa hydrazide 568 או 5% Alexa hydrazide 488 אשר מומסים ב0.5 כלוריד פתרון M אשלגן לפני ניסויי ההקלטה.
2. הסר את האלקטרודות וסיליקון הכיסוי בקפידה לאחר הניסויים, יש לשטוף את המוח עם פתרון Ringer הדבורה, להסיר את הבלוטות ואת קנה הנשימה ולהכניס גבישים זעירים של tetramethylrhodamin dextran או להכניס פתרון 5% פתר ב1.0 אצטט M אשלגן לתוך AL לתייג alts anterogradely. בצע את השלבים הבאים בחושך.
3. לאפשר לצבע שיש לנקוט ומועבר על ידי נוירונים ההקרנה לאורך שטחי אקסון (30-45 דקות) (איור 4 א), לפני שטיפת המוח עם פתרון Ringer דבורים שלוש פעמים לעוד דקות 30-45.
4. צ'יל הדבורה על קרח עד חוסר תנועה ולהסיר בזהירות את המוח מכמוסת הראש. לקבע את המוח על ידי שטיפתו בתמיסת 0.1 M PBS המכיל פורמלין 4% ולשמור אותו לילה בשעה 4 ° C.
5. לחכות שעה לפחות 12 לפני שטיפת המוח פי שניים ב0.1 M PBS (10 דקות כל אחד).
6. שטוף את המוח 3x עבור 20 דקות ב0.2% טריטון X-100 מדוללים ב0.1 M PBS לפני התייבשותו בסדרת אלכוהול עולה (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% אתנול, 20 דקות כל שלב).
7. שבץ המוח מיובש בMethylsalicylate בשקופית מיקרוסקופ ויםeal אותו עם כיסוי שקופיות.
8. השתמש במיקרוסקופ לייזר confocal סריקה ולסרוק את המוח, כמו חלקים אופטיים כל מיקרומטר 2-5 באמצעות תרכובת הרמונית מטרת התכנית Apochromat (10X טבילה 0.4 NA). להלהיב את הרקמות באמצעות אורך גל 568 ננומטר לdextran tetramethylrhodamin ואורך גל של 488 ננומטר לתפקיד האלקטרודה.
9. לשחזר את המבנים המוכתמים המוח ונתיבי האלקטרודה מערימות התמונה ב-3D ​​עם תוכנת שחזור (למשל. עמירה או פיג'י) (איור 4).

תוצאות

"הפרוטוקול הנוכחי מאפשר הקלטות בו זמנית בשני שלבי עיבוד שונים בתוך דבורים בודדים ובנוסף מאפשר לבחון את המנגנון בסיסי של למידה וזיכרון באמצעות דוגמא., PER האוויר בתוך דבורי דבש מאופקים". זהו תנאי הכרחי לניתוח היבטים זמניים של עיבוד עצבי. השיטה היא להתאמה בקלות לגישות מדעיות שונות לפענח את הרשת העצבית של מערכת חוש הריח של הדבורה. לדוגמא שיטה זו משמשת (i) כדי לנתח עיבוד זמני של PNS בתוך מסלול ההרחה הכפול של דבורת הדבש, l-ו-M-ALT PNS (איור 5). באיור 5A דוגמא אחת PN l-ALT נרשם בו זמנית עם PN של m-ALT ניתן כעשר ממוצע משפט וממחישה את כוחם התגובה והשהיה בגין חמישה ריכוזי ריח שונים כמו עלילת חום בקודי צבע. בממוצע של שבעה דבורים עם 11 l-ו13 mALT PNS (5B דמויות, 5C) ממחיש כי גם כוח התגובה, כמו גם ההשהיה התגובה, במידה מסוימת, משקף את ריכוז odorant. כך PNS בדוגמא זו להגדיל את כוח התגובה שלהם בזמן עם ריכוז odorant הגדלת חביון התגובה שלהם ירד (5B דמויות, 5C). תוצאה זו היא מוגבלת למדי ותקפה רק לodorant ניתח, אבל הוא עדיין עולה בקנה אחד עם מודלים חישוביים האחרונים של ³⁷ AL. אם קידוד ריכוז הריח בAL של הדבורה בבסיס חישובים לא ליניארי או בבסיס מאפייני קידוד אחרים עדיין צריך להיות מנותחים בעתיד. יתר על כן השיטה יכולה לשמש (ii) כדי להשוות היבטים זמניים בפעילות האוכלוסייה בשני שלבים שלאחר מכן עיבוד, AL-וMB-הפלט (איור 6). ניתוח עיקרי רכיב (PCA) ממחיש כי חישוב ריח הוא ממושך ולשרוד את מצגת הריח כולו ברמת PN ואילו בENזה רק הריח לסירוגין סט היו מיוצג בפעילות האוכלוסייה (איור 6). וכך אוכלוסיית EN הגיעה הפעילות המקסימלי שלהם כבר בנקודת זמן שבו פעילות PN עדיין מתפתחת (סרט cp. 1).

.. איור 1 ייצור אלקטרודות מיקרו חוט שלושת ערוצי A1) הסיומות של שלושה חוטים מולחמות לפיני IC בפוזיציות 11, 13 ו16 A2) ארבעה זיזי הלחמה דפוקים על צלחת בסיס פלסטיק פרספקס.; סיכת minutien מוכנסת לתוך הקצה של נימי זכוכית אשר מחוברת אז לצלחת הפלסטיק. A3) צלחת הפלסטיק מודבקת על גבי פיני IC ואת הקצה החופשי של כל חוט הוא מולחם לאחד מההלחמה העליונה זיזים. B1) כדי לצייד את בעל אלקטרודה עם חוטי נחושת הדקים, הנימים יש לקחת החוצה. B2 פעם נוסף) הבסיס של קרס ואז קבועים במנהג עשה יישור מכשיר. שלושה חוטי מייקר נחושת מיושרים לאורך החריץ וקבוע עם דבק בכל קצה B3) חוטי המייקר המקבילים מודבקים יחד עם שעוות שיניים והנימים היא להחזיר במקום (חיצים ארוכים).; אז חוטי מיקרו דבוקים מצורפים לנימים בשעוות שיניים וקצותיו מנותקים (חיצים קצרים). B4) שלושה הקצוות החופשיים של חוטי הנחושת מולחמים לשלושה זיזי ההלחמה העליונים ובכך להביא אותם למגע חשמלי עם ניתן לחבר שתי אלקטרודות פיני IC. C1) התאספו באופן מלא לכל אחד אחר לשימוש עם headstage אחת. C2) לצורך כך את הסיכות של אלקטרודה אחת (משמאל, עבדים) מחוברות באמצעות חוטים מבודדים לאלקטרודה אחרת (מימין, תורןER), אשר מחובר לבמה את הראש; האלקטרודה headstage מחוברת יכולה גם לאסוף קלט משריר (M17) ואלקטרודה השוואתית (נ"צ).

איור 2. הכנה והחדרת אלקטרודה קבועה למוח הדבורה.) דבורה מוכנסת לתוך בעל פרספקס לאחר קיבוע על קרח. אנטנות עם השוטון (פלורידה) וScapus (SC) מצוינים. ב ') את הראש ואנטנות קבועות באמצעות שעוות שיניים. C) הקפסולה הראש מגולחת והדבורים מוזנים במי סוכר. ד') את הראש הקפסולה נפתחה. E) לאחר הסרת בלוטות וקנה נשימה מהחלק העליון של המוח, יכולים בקלות להיות מכובדת neuropiles שונה וציוני הדרך העיקרית. המסלולים של alts מסומנים יחד עםסימן שבו האלקטרודות מוכנסות. (MB: גוף פטריות, אל על: אונת מחושים, OL: אונה אופטית, α: אונת אלפא או באונה אנכית, ALT: מערכת אונת מחושים, E1: צד החדרת אלקטרודה להקלטות מ-ALT, E2: צד החדרת אלקטרודה לl-ALT הקלטות). F) הפניה (REF) ואלקטרודות שריר (M17) מוכנסות לתוך הקפסולה הראש דרך חורים קטנים בציפורן או עין המורכבת. G) אלקטרודות החוט מוכנסות לתוך המוח באתרים המתאימים. H) לאחר תיקון אלקטרודות במקום באמצעות שני סיליקון רכיב, הדבורה עדיין מראה PER ויכולה להיות מותנית (למשל., שימוש במי סוכר).

הקלטת איור 3. תאי בשני שטחים עצביים והפקה אחת יחידה (מיון ספייק). ) ציור סכמטי של הגדרת הניסוי. הדבורה היא מקובעת בבעל פרספקס. גירוי ריח מסופק באמצעות שפופרת זכוכית. שני אנקס אלקטרודה מקליט ממוח הדבורה החשוף. ב ') הקלטות בו זמנית מl-ו-M-ALT PNS (ירוק ועקבות סגולות) מראה תגובות מעוררות בשני קטעים לגירוי 500 ריח אלפיות של דבש בפתרון מים בריכוז של 1:100 ב33 ° C. כל שורה זממה מייצגת את הערוצים מובחנים כתווית בצבעים מזיזי הלחמת אלקטרודה בבר א:. 50 μV ג) לאחר הליכי מיון ספייק פוטנציאל פעולה בודד מסודרים וקודי צבע. היסטוגרמה מרווח כיסוי של היחידות ממוינות ממחיש את ההפרדה של צורות הגל. ד) ספייק מציינת את איכות הפרדת היחידות ממוינות כהוכחה למיון ספייק הולם. שים לב שאין ספייק בתוך התקופה עקשן של היחידה. ה) שתי תצוגות (E1, E2) מאשכולות 3D של יחידת המיון עם ניתוח מרכיבים ראשי המציין את המרחק של היחידות ממוינות אחד לשני. עיגולים מציינים את מרחק מלנוביס פי 2.5 אשר דומה SD בחלל ומציין בידול משמעותי של האשכולות בF מרחב המרכיב העיקרי יחידות) צבע מקודד מתארות את פוטנציאל הפעולה גלוי בהגדלה של שלושה ערוצים מהקלטת מערכת אחת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4. הדמיה לאחר הקלטה ו3D-שחזור של עמדת ההקלטה. א) השקפת הקרנה של Ortho-פרוסות לאורך Z-הצירים עם יישור עוצמה מקסימלית של Anteroולמלא את המשבצות מדרדר של נוירונים הקרנת uniglomerular מקרינים מAL לMB ו-LH. נותב תאיים Microruby (dextran tetramethylrhodamin) היה מוכנס לתוך AL לאחר ניסויי ההקלטה. glomeruli המוכתם בתוך תצוגת הקרנת AL מכתים הוכחה נכונה PN. ב) לפרוסות Ortho לאורך Z-הצירים עם יישור עוצמה מקסימלית מהכתמה של שתי אלקטרודות עם אלקסה hydrazide 488 מציין את מיקום האלקטרודה למ-ALT (E1, החץ ) ו-L-ALT (E2, חץ). נותב Alexa Hydrazide 488 נודד לרקמות המקיפות את האלקטרודה ומכתים את אתר החדרת אלקטרודה. שים לב, הצביעה הבולטת בAL היא artefact שטחי. C) 3D שחזורים של התאים המוכתמים היעד (PNS) ואתר הכנסת האלקטרודה מA, B (בצד ימין) יחד עם סקירה סכמטית של מערכת חוש הריח דבורת הדבש (משמאל צד) עם הציון של מסלולי l-ו-M-ALT. שים לב, רק uniglomerשטחי התואר בלבד PN מוצגים. : עצב מחושים, אל על: אונת מחושים, LH: קרן לרוחב, MB: גוף פטרייה, E1, E2: אתרי החדרה אלקטרודה, מ-ALT: מערכת אונת מחושים המדיאלי, L-ALT: מערכת אונת מחושים לרוחב, ג: הזנב, r: מקורי, מ ': המדיאלי, l:. לרוחב אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. דוגמא לקידוד ריכוז ריח במסלול הריח הכפול.) חלקות חום להמחיש את התגובה של l-ALT בודד (ירוקה) ו-M-ALT אחד PN (סגול) רכש בו זמנית מדבורת דבש בודדת בתגובה לodorant hexanal בהגדלת ריכוזי ריח (מ 1: 10 ^-6 ל1:100). כל שורה היא ממוצע של עשרה סטים משפטulation. שיעור הירי מוצג כשינוי עוצמה יחסי המהווה את קצב הירי ביחס לפעילות הספונטנית מופחת. ב ') חביון תגובת אוכלוסיית 11 l-ו13 מ-ALT PNS מ7 דבורים רשמו. בכל אחד דבורת PNS משני חלקות נרשמו בו זמנית. חביון תגובת אוכלוסיית תערוכות השהיה יורדת עם הגדלת ריכוז ריח בPNS משני קטעים. תחילת תגובת ריח במחושים ב99 אלפיות שניים נרשמה באמצעות electroantennograms ונגרעה משיהוי תגובת PN. שים לב כי בריכוזים הנמוכים ביותר תגובות חלשות מדי למדידות השהיה, ולכן לא נכללו בתגובת אוכלוסייה. C) ירי שיעור מאותה PNS כמו בב 'עם ריכוז ריח הגדלת כוח התגובה הולך וגדל. L-ALT מציג חוזק תגובה חזק יותר. בB, ניתנים C הממוצע ו-SD.

איור 6. השוואת פעילות אוכלוסייה בשני שלבי עיבוד שלאחר מכן לאורך מסלול חוש הריח של דבורת הדבש. נתונים נרשמו ב20 בעלי חיים אשר היו מגורה עם 1-hexanol ו2-octanone.) כל שורה מייצגת צבע השווא מקודד קצב ירי ממוצע של היטל אחד נוירון (PN) מחושב על פני 10 חזרות ריח של 1-hexanol. מצגת ריח מתחילה בזמן 0 ונמשכה שלוש שניות. ב ') מציג את אותו הדבר כמו ב) אבל לנוירונים חיצוניים גוף פטרייה (EN). המטריצה ​​שמוצגת ב) ניתן לראות כוקטור אוכלוסיית PN במהלך גירוי ריח עם 1-hexanol. חישבנו את אותו סוג של וקטור אוכלוסייה במהלך גירוי ריח עם 2-octanone והשתמשנו בשני הווקטורים בניתוח מרכיבים עיקריים (PCA) שמירה הזמני ממד. C) שלושת המרכיבים העיקריים הראשונים (PC1, 2 ו -3) היוזמם נגד אחד את השני כדי להמחיש את הפרדת הריח בפעילות הרכב PN במוצא אונת המחושים. הזמן לפני הופעת ריח מסומן בשחור. פעילות במהלך שלוש שניות של גירוי עם 1-hexanol מוצגת בכחול. הפעילות במהלך גירוי עם 2-octanol מוצגת באדום. יתר על כן, אנו מראים 1.5 שניות (הודעה) של הפעילות לאחר הריח של סט של 1-hexanol (כחול אור) ו -2 octanonen (ורוד). שים לב כי ברמת הרכב PN, שני הריחות מעוררי מסלולים שונים מאוד להתיישב ב" נקודה קבועה ", שמאריכה ימים אחרי כל תקופת גירוי ריח. רק אחרי הריח לקזז את המסלולים לחזור לפעילות הבסיסית ללא גירוי ריח. ד ') אותו הניתוח נעשה ברמת הרכב EN המייצגת את הפעילות במוצא גוף פטרייה. בהשוואה לפעילות PN ריחות לעורר מסלול פחות מובחן. יתר על כן "נקודה קבועה" אינה נצפות. בתחילה המסלולים מושרה ריח Intermingle עם פעילות בסיסית למרות שהריח הוא עדיין קיים. רק הריח לקזז עורר מסלול נוסף.

. סרט 1 זמן נפתר הערכה של מסלול ריח מושרה לאחר ניתוח מרכיבים ראשי של וקטור PN-אוכלוסייה (משמאל) ווקטור EN אוכלוסייה. (מימין;. Cp איור 6) החלקים העליונים כוללים שלושה מרכיבים העיקריים הראשונים (PC1, 2 ו -3) זממו אחד נגד השני. הלוחות הנמוכים להמחיש את ההערכה של PC1, 2 ו -3 לאורך זמן. גירוי ריח מסומן בפס האפור. כל הלוחות היו מסונכרנים. שים לב שפעילות אוכלוסיית EN מתחילה מעט לפני פעילות אוכלוסיית PN, תופעה אשר נראתה כי contraintuitive אבל יכולה להיות מוסברת על ידי הקישוריות ומאפיינים של השכבות מעורבות, אשר דנו קודם לכן ^1.

Discussion

מאמר זה מדגים את הייצור ושימוש בחוט אלקטרודות מיקרו רב ערוצים מותאמים אישית שתוכננה. אלקטרודות שתוארו מתאימות להקלטה שניהם יחידה אחת ופעילות אוכלוסייה אשר היא שימושי במיוחד עבור מדידות חביון ומאפייני תגובה זמניות אחרים של נוירונים שונים וneuropils שונה בתוך דגימה אחת (לפרטים ראו ^1,2,25). בנוסף יש לנו לראות כיצד ליישם באופן קבוע את האלקטרודות חוט מיקרו כדי לאפשר הקלטות יציבים לטווח ארוך במתנהגים דבורי דבש להימשך שעות עד ימים.

הקלטות רבת יחידה תאית הפכו לכלי נוח כדי להשיג רזולוציה גבוהה זמנית בשילוב עם מידע מרחבי. במקרה שלנו, אלה הם שני קטעים מקבילים עצביים ² או שתיים neuropils שונה ^1. ניתן להקליט נוירונים מרובים ונותחו ברמת תא העצב הבודד במקביל וברזולוציה גבוהה זמנית. שיא Multi-יחידהings יושמו לראשונה ביונקי ³⁸ ומאוחר יותר גם בחרקים ^39-41. התקדמות משמעותית הושגה עם הפיתוח והשיפור של טכניקות הקלטת רב ערוצית תאיים ^42,43. זה, למשל, כולל את הפיתוח של אלקטרודות חדשות ⁴⁴ או אלגוריתמי מיון וקיבוץ באשכול של ספייק רומן ^45. שיטות כלליות של טכניקות הקלטה רבת יחידה תאית מתוארות היטב ^46-48. אלקטרודות העצמית שנבנה שמוצגים בסרטון הזה בנוסף ניתן להתאים על ידי הוספה יותר microwires לאלקטרודה או יכולים להיות מעוות חוטי מיקרו כדי לזכות במרחקים קבועים למדידה בין הטיפים. שני ההליכים היו, עם זאת, להביא לירידה בגמישות והגדלת עובי של האלקטרודה.

בהשוואה לבדיקות סיליקון המשמשות בדרך כלל להקלטות תאי בחרקים הרבה יותר גדולים כמו עש נץ, ארבה והמקק ^{40,49 - 51} חוט אלקטרודות מיקרו תיארה הם קטנים יותר, גמישות ויכולה להתמודד בקלות עם תנועות מוח פוטנציאליות, ולכן ניתן להשתמש בו באופן מהימן בחרקים חברתיים קטנים כמו דבורים ונמלים המציגים רפרטואר התנהגותי רחב הרבה יותר. רוב בדיקות סיליקון שוק חד כמו מבני חיתוך האקסונים ורקמה עצבית לאורך ערוץ הכנסתם, ואילו חוטי מיקרו תיארו הם עגולים, גמישים וקטנים יותר ולכן הם פחות מזיקים לרקמה הסובבת וזה יתרון ברור אם המטרה היא ללמוד עוד פלסטיות טווח בבעלי חיים בשלמותה ומתנהגים. יתרון נוסף של אלקטרודות חוט מיקרו הוא הייצור שלהם בעלות הנמוכה והטיפול קל. במקום לנקות בדיקה סיליקון יקרה בזהירות את חוטי האלקטרודה הם טריים חתוכים לקראת כניסה המוח, ולכן בעיות חוסר הגודש. כמו כן ניתן להשתמש באלקטרודה חוט מיקרו יותר מפעם אחת באותו ההכנה הוכנסה גם בneuropiles שונה ¹ oשטחי r ² כפי שאנו מראים כאן. גישה זו היא חיובית במיוחד כדי לנתח ולהשוות היבטים זמניים כמו שיהוי תגובה ואינטראקציות ברמות עיבוד עצביים שונות.

אנו מודעים לעובדה שאות נרשמה תאית אינה משקפת את פעילות תא בודדת כשלעצמו. זה תמיד תרכובת של פעילות מתח סביב הקצה האלקטרודה. כדי לאתר את מקור אות ההבדל של שני ערוצי חוט מייקר שכנים בתוך אלקטרודה אחת תמיד מחושב. כך המקור לאותות ספייק משמשים כדי לחלץ את פעילות יחידה אחת תמיד היה קרוב מאוד לאחד או ערוץ האלקטרודה האחר וכתוצאה מכך גל ספייק להבחין בקלות. אותות ממקום מרוחק יותר, כמו פעילות שרירים או פעילות של neuropils השכן, יגיעו שני אלקטרודות באותו הזמן מעורר צורות ואמפליטודות דומות וייפסלו על ידי הליך זה. באמצעות טכניקת התאמת תבנית של Spike2,אנחנו בטוחים מאוד כדי להשיג פעילות יחידה אחת, שזה לא אותו הדבר, אבל קרובים מאוד לפעילות תא עצב יחידה. עם זאת, סוגיית מיון ספייק יכולה להימנע על ידי שימוש בטכניקות הקלטה תאית.

הקלטות תא בודדות עם שני אלקטרודות חדות או טפטפות תיקון תאפשר ידע מעמיק על מאפיינים פיסיולוגיים של נוירון בודד. עם זאת, בשל גודלו הקטן של נוירונים חרקים וneurites (לדוגמא., מיקרומטר פחות מ 1 לדבורת הדבש PNS ⁵²⁾ הקלטות קצר טווח הן לניהול. יתר על כן, הקלטות סלולריות התוך עשויות להיות פולשנית ועלולה לפגוע בתא שבו הוא אולי סיבה נוספת למגבלות זמן. בvivo הקלטות תאית בחרקים נדירים לשרוד שעה אחת. חלון זמן שהיה מספיק לעבודתו החלוצית של מרטין האמר ⁵³ שנרשמו תאיים מתא עצב אחד מזוהה, תא עצב maxilar # הגחון מזווג 1 (VUMmx1). הוא יכול lדיו את פעילותה באופן ישיר למסלול הגמול. יוליאנה Mauelshagen ⁵⁴ רשום intracellularly הפעילות של נוירון החיצוני מזוהה פטריות גוף, pedunculus נוירון החיצוני # 1 (PE1) בהתניה קלאסית. אותו תא העצב היה במוקד של מנזל ומנז ⁵⁵ כאשר הם מצאו LTP לאחר גירוי חשמלי של תאי קניון. עם זאת, אוקאדה ועמיתי ⁵⁶ יכולים להשתמש בדפוס intracellularly המאופיין היטב spiking (קוצים כפולים ומשולשים) לזיהוי PE1 במהלך הקלטות תאיים. אחרי הכל שילוב של שני השיטות, הקלטות תאיים מתא עצב מזוהה והקלטות ארוכות טווח תאיים עשויות להיות כלי רב עוצמה לחקירות עתידיות.

עם זאת, באמצעות אלקטרודות חדות להקליט תאים מרובים (יחידות) בו זמנית ברמות עיבוד שונות על פני שעות רבות עד ימים כדי לנתח את מערכות היחסים שלהם זמני תגובה ו / או אפילו שינויי פלסטיק iזה כמעט בלתי אפשרי.

עם ההדמיה סידן הראשונה מתקרבת ^ב57,58 דבורת הדבש באמצעות צבעי סידן רגיש לניתוח דפוסים מרחביים של תגובות ריח היה נגיש ^59-62. עם זאת, במקרים רבים הצבעים הרגישים סידן צריכה להיות הציגו לרקמת המוח באמצעות מניפולציות פולשנית ששוב להגביל את תוחלת החיים של הדבורה ותכונות פנימיות של התאים נותחו. בעיה זו היא להתגבר באורגניזמים מודל אחרים כמו פריזבוב באמצעות חיישני סידן הציגו גנטי ^63,64. עם זאת, באופן כללי, חיישני סידן עשויים להציג את מגבלות אחרות כפי שהם יכולים לשמש כמאגרי סידן שצפויה להשפיע על המאפיינים זמניים של תגובות ריח. הקלטות תאיים בו זמנית בשילוב עם הדמיה סידן או גישות חישוביות יכולות להוכיח הפתרון הזמני הנכון של תהליכי הדמיה ^65,66. עם זאת, ההחלטה הזמנית של תהליך ההדמיה עצמה היא Rather מוגבל. רכישת מערכות אופטיות בדרך כלל להשתמש CCD-הדמיה עם רזולוציה זמנית של 5-20 הרץ ^67, אם כי 2-Photon-Imaging יוכל לרכוש רצפים מהירים יותר ^68. עם זאת, קצב דגימת הגדלת תמיד הולך יחד עם הפסד ברזולוציה מרחבית. יתר על כן צבעי סידן רגיש לשימוש בדבורת הדבש לעבור הלבנת, אשר גם מפחיתה את זמן רכישה ^69.

בהשוואה לטכניקות הקלטה פיסיולוגיות אחרות בחרקי אלקטרודות מיקרו החוט שלנו גמישה רב הערוצים להבטיח גישה ארוך זמן ליחידה אחת ופעילות עצבית באוכלוסייה מתנהג דבורים.

הראינו כיצד להשתמש בשני אלקטרודות אלה בשלבי עיבוד שונים באותה החיה, המאפשרת הניתוח של היבטי קידוד זמניים בין אתרי הקלטה השונים. תלוי בבעית המחקר ומודל חרקים השיטה הבסיסית של בניין האלקטרודה הפגין כאן הוא להרחיב בקלותמסוגל ו / או יכול להיות מותאם. לדוגמא ניתן לשער להשתמש יותר משלושה חוטים אחד לייצר אלקטרודות רב ערוצית. בנוסף, מספר אתרי הקלטה ניתן להאריך והתבוננות היבטים זמניים של יותר משני שטחים או neuropils אינה ריאלי. התקווה שלנו היא כי שיטה זו תשמש השראה למדענים רבים ותתרום באופן חיובי להבנה של עיבוד עצבי מתוחכם במוח קטן.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin oil	Fluka	76235
Odors	Sigma Aldrich
PBS			pH 7.2
4% Formaldehyde	ThermoScientific	28908	Methanol free
Triton X	BioChemica	A1388
Methylsalicylate	Roth	4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)	Invitrogen	D7162	keep dark
Alexa 488 hydrazide	Invitrogen	A-10436	keep dark
Alexa 568 hydrazide	Invitrogen	A-10437	keep dark
Bee Ringer Solution	see 2
Polyurethane-coated copper wire	Elektrisola	15µm diameter & P155 insulation
Dental Wax	Densply Detrey	64103015S1	moderate melting point
Dental Wax	Flexaponal	124-202-00	low-melting Wax
KWIK SIl	WPI	03L
18 Pin Socket	Conrad Electronic	189634-62
Hot melting glue	Conrad Electronic	827673
soldering needle	Conrad Electronics	830283	12 V
Soldering terminal lug	Conrad Electronic	531901
Glaselectrodes	WPI	1B100F-3
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0.2 x 12 mm
switchable headstage	Tucer Davis Technologies	SH16
Headstage connection module	NPI	INT-03M
Amplifier Module	NPI	PDA-2F
Data Acquisition boards	National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software	National Instruments	Lab View 8.2	custom design
Spike-Sorting	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Micromanipulator	Leitz		manual
AG-wires	WPI	AGT05100
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	2/5/2000