Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

Riepilogo

Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.

Abstract

In entrambi i mammiferi e insetti informazioni neuronale viene elaborata in diversi centri cerebrali di ordine superiore e inferiore. Questi centri sono accoppiati tramite convergenti e divergenti connessioni anatomiche tra cui avanzamento e il cablaggio feedback. Inoltre, informazioni della stessa origine è parzialmente inviato attraverso vie parallele differenti e talvolta nelle stesse aree cerebrali. Per comprendere i vantaggi evolutivi, nonché i vantaggi computazionali di queste strategie di cablaggio e soprattutto i loro dipendenze temporali di ciascun altro, è necessario avere accesso simultaneo a singoli neuroni di differenti tratti o neuropiles nella stessa preparazione ad alta risoluzione temporale. Qui ci concentriamo sulle api dimostrando un unico accesso extracellulare lungo termine per registrare l'attività a più unità in due successive neuropiles ^1, il lobo antennale (AL), la prima fase di elaborazione olfattiva e il corpo del fungo (MB), un ordine superiore centro di integrazione involved nell'apprendimento e nella formazione della memoria, o due tratti neuronali parallele ² collegano il AL con la MB. Quest'ultimo è stato scelto come esempio e verrà descritta in dettaglio. Nel video di supporto è dimostrata la costruzione e l'inserimento permanente di elettrodi a filo multicanale flessibili. Amplificazione differenziale a coppie dei microcanali filo elettrodo riduce drasticamente il rumore e verifica che la sorgente del segnale è strettamente correlata alla posizione della punta dell'elettrodo. La flessibilità meccanica degli elettrodi a filo utilizzati permette registrazioni a lungo termine invasive stabili per molte ore fino a giorni, che è un chiaro vantaggio rispetto alle tradizionali tecniche di registrazione in più e intracellulari in vivo.

Introduzione

Le api così come la maggior parte degli altri insetti pesantemente affidamento su olfatto. Tra gli altri usano stimoli olfattivi per l'orientamento, l'accoppiamento, la comunicazione con i conspecifici, e foraggiamento. Il loro sistema olfattivo ben elaborato contribuisce ad un ricco repertorio di comportamenti di apprendimento relativi agli stimoli odori floreali. Questi comportamenti possono essere facilmente studiati in condizioni controllate di laboratorio (per la recensione vedi ^3-5). I loro "mini-cervelli" (cfr. ⁶⁾ con il loro numero relativamente piccolo di neuroni fanno le api di un organismo modello adatto per studiare la codifica olfattiva e di apprendimento durante il monitoraggio dell'attività neurale.

Il sistema olfattivo negli insetti e nei mammiferi mostra organizzazione analogo in gran parte (per una rassegna vedi ^7,8). In api circa 80.000 neuroni recettori ⁹ situati in sensillae lungo le antenne ^10,11 tradurre lo stimolo odore ambientale in un neursegnale onal. Assoni dai neuroni recettori olfattivi innervano il lobo antennale (AL), che ha un'organizzazione glomerulare paragonabile al bulbo olfattivo vertebrato. La AL comprende circa 164 glomeruli interconnessi tra loro da circa 4.000 interneuroni locali (LN) (per una rassegna vedi ^12). Soprattutto nel ape è stato dimostrato recentemente che LNs forniscono connettività laterale irregolare e che le diverse sottopopolazioni possiedono elementari e configural olfattive proprietà di codifica ^13,14. L'AL ha dimostrato di essere suddiviso in un lobo ventrale e dorsale hemi dando origine al mediale e il tratto lobo antenne laterali (-M e L-ALT; precedentemente definito-M e L-APT-mediale e laterale Lobe antenne protocerebral Tract ^{15 - 17).} Qui un nuovo tratto terminologia introdotta da una recente sforzo per una nomenclatura unificata del cervello dell'insetto verrà utilizzato ^18. Entrambi ALTs (l-e m-ALT) combinano sia 410 (l-ALT) o 510 (m-ALT) proge uniglomerularneuroni ction (PN), rispettivamente ^15,16,19. PN di entrambi i tratti sono stati recentemente dimostrato che gli odori di codice in parallelo ² (per la recensione vedi ^17,20), ed entrambi i tratti sinapticamente formare connessioni divergenti con celle Kenyon (KC), il corpo di funghi (MB) neuroni principali. Ogni MB contiene circa 172.000 KC ^21-23. MBS sono noti per essere coinvolti nella integrazione stimolo, l'apprendimento e la formazione della memoria. I dendriti AXO del KC formano il peduncolo (gambo del fungo), che ha due regioni di uscita principali: il vertica o alfa-lobo e orizzontale o beta-lobo ^22,24. L'uscita del MB converge a solo circa 400 neuroni estrinseci (EN) ^24. ENS responsabile per l'elaborazione delle informazioni olfattive soprattutto innervano l'aspetto ventrale del lobo verticale ^22. Recentemente, è stato dimostrato che ENs registrati in questa zona codificano l'associazione odore premio ^25.

Temporaleaspetti all'interno del sistema olfattivo di insetti e vertebrati sono diventati un aspetto importante e significativo come potenziale principio codifica ^26-29. Per essere in grado di registrare simultaneamente più neuroni da diversi siti ad alta risoluzione temporale, abbiamo stabilito matrimoniali tecniche multiple di registrazione dell'unità utilizzo di elettrodi su misura a filo multicanale introdotte diverse regioni bersaglio nel sistema olfattivo delle api. Questo approccio ci permette di analizzare e confrontare l'elaborazione temporale nel sistema olfattivo delle api a livello dei singoli neuroni e delle popolazioni di neuroni o tra le vie olfattive parallele, il duplice percorso olfattivo ² o tra i diversi neuropils successivi ^1. Recentemente con un approccio sperimentale simile nel sistema olfattivo locusta ³⁰ con una diversa configurazione degli elettrodi sono stati in grado di analizzare il meccanismo di codifica spazio-temporale per sfondo-invariante riconoscimento odore ^31. Thnoi, i doppi registrazioni stabiliti consentono la raccolta di informazioni spaziali sulle simultanei profili di attività neuronali.

Rispetto al campionamento spaziale più ampio ottenuto da immagini di calcio questo metodo permette di registrare da soli due punti. Tuttavia, il vantaggio rispetto alle tecniche di imaging calcio è l'elevata precisione temporale di potenziali registrazioni d'azione, che non possono essere forniti da una CCD convenzionale o acquisizione di immagini 2-fotone. Gli elettrodi extracellulari qui descritti vengono impiantati in modo permanente e fissi rispetto al cervello e testa capsula evitando elettrodo deriva. Questo è un chiaro vantaggio rispetto all'utilizzo di elettrodi intracellulari taglienti. Un altro vantaggio rispetto alle registrazioni intracellulari e immagini di calcio è il tempo di osservazione neurale estesa vanno da molte ore fino a giorni. Questo è un presupposto importante per indagare i correlati neurali di formazione di apprendimento e memoria. Ulteriori vantaggi di piùregistrazioni unità sono ulteriormente descritti nella sezione di discussione.

In questa visione metodologica verrà mostrato il processo di fabbricazione di elettrodi a filo design personalizzato, adattato da ^32,33 e adatto per lungo termine le registrazioni multi-unità nel cervello delle api. Inoltre, un esempio di come questi tipi di elettrodi sono impiantati in modo permanente in due differenti siti di registrazione all'interno del sistema olfattivo api per registrare simultaneamente è indicata la-l e m-ALT per lunghi periodi di tempo per consentire a molti protocolli di stimolazione ^2. Per la verifica delle posizioni di registrazione è fornito un esempio e un protocollo per la colorazione e post visualizzazione dei siti di registrazione.

Protocollo

1. Elettrodi edifici (Figura 1)

1. La produzione di un adattatore elettrodo che si inserisce la scheda di interfaccia elettrodo di commercio più sistemi di amplificazione dei canali ^1,2,25.
   1. Utilizzare una piccola piastra in plexiglas incollati alla base di un connettore 18 pin.
   2. Collegare la base con 3 brevi pezzi di filo isolato a 3 anse a saldare separati avvitati sulla piastra di plexiglas (Figura 1 A1-A3).
   3. Inserire una scanalatura nella piastra di plexiglas in cui un capillare di vetro può essere facilmente spostato ed essere trattenuto da una vite (Figura 1 B1).
   4. Ampliare la capillare di vetro di circa 5 mm con uno spillo minutien.
   5. Collegare i fili degli elettrodi micro lungo il perno minutien e la capillare di vetro per garantire la stabilizzazione e sostegno.
2. Multi-canale di produzione micro filo (adottato da Ryuichy Okada ^32,33)
   1. Span 3 micro fili (poliuretano rivestito in filo di rame, 15diametro micron) in modo che essi sono posti accanto all'altro (figura 1 B2).
   2. Utilizzare una saldatura ago 12 V per diffondere un sottile strato di cera dentale basso punto di fusione (50 ° C) in parte lungo i fili per incollare insieme (punta dell'elettrodo) (Figura 1 B3). Lascia pochi centimetri unglued (fine elettrodo), come questa sezione sarà utilizzato in seguito per collegare i cavi micro con l'adattatore elettrodo.
3. Collegare il micro canale filo più all'adattatore elettrodo
   1. Rimuovere il capillare di vetro dal supporto e fissarlo con il perno minutien alla punta dell'elettrodo. Portarlo in una posizione parallela al micro-elettrodo (Figura1 B3).
   2. Incollare la punta dell'elettrodo al perno minutien con cera dentale basso punto di fusione e tagliare il micro elettrodo sulla punta, sporgente 2-3 cm dal perno minutien e alla fine elettrodo (frecce piccole Figura 1 B3).
   3. Infilare il capillare slightly indietro nel adattatore dell'elettrodo. Utilizzare la vite per risolvere il problema (Figura 1 B4).
   4. Saldare le estremità dei tre fili alle alette di saldatura utilizzando un saldatore con una temperatura di circa 360 ° C per assicurare fusione dell'isolante (Figura 1 B4). Dopo la saldatura, assicurarsi che ci sia un adeguato contatto elettrico (~ 300 kOhm).
   5. Montare uno degli elettrodi (master) per la scheda di interfaccia elettrodo del headstage e fissare l'altro elettrodo multicanale (slave) su un adattatore separato. Collegare i canali dello slave all'elettrodo master (Figura 1 C1). Inoltre, saldare il riferimento nonché elettrodi muscolari all'elettrodo di base principale (Figura 1 C2).

2. Ape Preparazione (Figura 2)

In questi esperimenti descritti, l'ape (Apis mellifera), che è un animale invertebratoe quindi non richiede specifiche autorizzazioni etiche per l'utilizzo, viene utilizzato.

1. Cattura api bottinatrici (A. mellifera) presso l'ingresso dell'alveare al mattino, come mostrato da altri ^34,35.
2. Raffreddare le api su ghiaccio tritato fino immobilizzazione (da 5 a 10 min) e fissare una in un supporto di plexiglas standard o tubo metallico in modo che la testa è esposta (Figura 2). Per minimizzare i movimenti della testa usano cera a basso punto di fusione dentale (~ 50 ° C) e fissare la testa con attenzione al titolare intorno alla base degli occhi composti e del collo.
3. Utilizzare cera basso punto di fusione per fissare la SCAPI delle antenne sulla capsula testa (Figura 2 B) senza toccare il flagello. Il flagello dell'antenna deve essere rilevato in avanti. Assicurarsi che l'ape può liberamente muovere la sua proboscide.
4. Radere la capsula testa per garantire una vista indisturbata e accesso alla parte superiore della testa.
5. Alimentare l'ape con una soluzione di saccarosio del 30% fino saturatia garantire una sufficiente umidificazione del tessuto cerebrale e buona vitalità dell'animale (Figura 2 C).
6. Fai incisioni attenti verticalmente lungo i bordi degli occhi composti e orizzontalmente sopra le basi antennali così come sotto gli ocelli e togliere il pezzo allentato della cuticola (Figura 2 D).
7. Impostare con attenzione da parte delle ghiandole ipofaringee e rimuovere la trachea per garantire una visione chiara e l'accesso al cervello prima di inserimento dell'elettrodo (figure 2E, 2F).

3. Inserimento dell'elettrodo

Nel caso dell'esempio illustrato nella figura 2, un elettrodo è posizionato scopo la l-ALT, l'altro puntando sul m-ALT ^2. Utilizzando particolari punti di riferimento, in altre regioni di destinazione sono possibili anche, per esempio, le regioni uscita AL e ¹ MB.

1. Posizionare gli elettrodi usando micromanipolatori alla regione di interesse ( Figura 2G e 3A). Per indirizzare il posto m-ALT dell'elettrodo tra la AL e medialmente dal lobo verticale del MB. Assicurarsi che il sito di inserimento di essere al di sopra del punto di diramazione dei PN ALT mediolaterale. Sporgere l'elettrodo nel cervello con una profondità di circa 180 micron (Figura 2E). Per l-ALT PN posto l'elettrodo di registrazione sotto il protocerebro laterale (LH) nel mezzo di una linea immaginaria tra la parte laterale del lobo verticale e mezzo della AL. Inserire l'elettrodo con una profondità di circa 300 micron (figura 2E)
2. Inserire il riferimento (filo d'argento, circa 25 micron di diametro) nel occhio composto omolaterale attraverso un piccolo taglio nella cuticola. Inserire un altro filo d'argento nella regione proiezione muscolo sotto gli ocelli laterali. NOTA: Se necessario, il comportamento di apprendimento delle api può essere monitorato con alta precisione temporale registrando muscolo M17, che è coinvolto in risposta estensione proboscide (PER) del ape ³⁶ come descritto in ^25.
3. Per ancorare saldamente gli elettrodi nel cervello e la capsula testa, coprire l'intero spazio sopra il cervello con due silicio componente (Figura 2H), che impedirà il cervello si secchi. NOTA: le registrazioni possono durare per ore fino a giorni, e le api possono per esempio essere registrato durante una procedura di condizionamento classico (Figura 2H) o stimolate con un grande pannello di odori diversi.

4. Acquisizione e pre-elaborazione

1. Utilizzare un software di acquisizione adeguata che soddisfi i seguenti requisiti: frequenza di campionamento di almeno 25 kHz; analogico o digitale ^{1,25 2} differenziazione incrocio tra i canali elettrodi; filtro passa banda da 300 Hz a 8000 Hz per estrarre eventi spike.
2. Utilizzare disponibili spike ordinamento software per estrarre l'attività singola unità, per esempio template tecniche corrispondenti come incluso nel software Spike2 (Figura 3).
3. Per ulteriori analisi utilizzare i timestamp delle unità estratte per calcolare singola unità media cattivi odori (Figura 4) o per calcolare i vettori di popolazione per Analisi delle Componenti Principali (PCA) (Figura 5) utilizzando un software disponibile in commercio. Per analizzare ulteriormente singola unità e la popolazione latenza di risposta si prega di confrontare pubblicazioni recenti ^1,2,25.

5. Visualizzazione della relativa posizione degli elettrodi (Figura 4)

1. Immergere le punte degli elettrodi in una soluzione di 5% o Alexa idrazide 568 o 5% Alexa IDRAZIDE 488 che viene disciolto in soluzione di cloruro di 0,5 M di potassio prima degli esperimenti di registrazione.
2. Rimuovere gli elettrodi e il silicio rivestimento cura dopo gli esperimenti, lavare il cervello con la soluzione ape Ringer, rimuovere le ghiandole e trachea e inserire minuscoli cristalli di tetramethylrhodamin destrano o inserire una soluzione al 5% risolto in 1.0 M acetato di potassio in AL per etichettare i ALTs anterogradely. Effettuare le seguenti operazioni nel buio.
3. Lasciare il colorante da prendere e trasportato dai neuroni di proiezione lungo i tratti assonali (30-45 min) (Figura 4A), prima di lavare il cervello con soluzione Ringer ape tre volte per altri 30-45 min.
4. Raffreddare l'ape sul ghiaccio fino immobilizzazione e rimuovere con cautela il cervello dalla capsula testa. Fissare il cervello risciacquandola in una soluzione 0,1 M PBS contenente formaldeide al 4% e tenerlo notte a 4 ° C.
5. Attendere almeno 12 ore prima di lavare il cervello due volte in 0.1 M PBS (10 minuti ciascuno).
6. Lavare 3x cervello per 20 minuti in 0,2% Triton X-100 diluito in 0,1 M PBS prima disidratazione in una serie ascendente di alcool (30%, 50%, 70%, 90%, 95%, 3x 100% etanolo, 20 min ogni passo).
7. Incorporare il cervello disidratato in Methylsalicylate su un vetrino da microscopio e seal con un coperchio scorrevole.
8. Utilizzare un microscopio confocale a scansione laser e la scansione del cervello come sezioni ottiche ogni 2-5 micron utilizzando un composto Harmonic obiettivo di Piano Apochromat (10X 0.4 NA immersione). Eccitare il tessuto usando 568 nm per tetramethylrhodamin destrano e una lunghezza d'onda di 488 nm per la posizione degli elettrodi.
9. Ricostruire le strutture cerebrali colorati e percorsi elettrodi delle pile di immagini in 3D con il software di ricostruzione (ad es. AMIRA o Fiji) (Figura 4).

Risultati

"L'attuale protocollo consente registrazioni simultanee in due diverse fasi di lavorazione all'interno delle singole api e inoltre permette di testare sottostanti meccanismi di apprendimento e di memoria tramite ad esempio., PER condizionata all'interno api trattenuto." Questo è un prerequisito per analizzare gli aspetti temporali del processo neuronale. Il metodo è facilmente adattabile a diversi approcci scientifici per svelare la rete neuronale del sistema olfattivo delle api. Per esempio, questo metodo viene utilizzato (i) per analizzare l'elaborazione temporale di PN all'interno del percorso olfattivo doppio delle api,-l e m-ALT PN (Figura 5). In Figura 5A un esempio di PN l-ALT simultaneamente registrato con una PN del m-ALT è data come media dieci tentativi ed illustra la loro forza di risposta e la latenza rispetto a cinque diverse concentrazioni di odori come codice colore trama calore. In una media di sette api con 11-l e 13 mALT PN (figure 5B, 5C) illustra che sia la forza di risposta e la latenza di risposta, in una certa misura, riflette concentrazione di odorizzante. In tal modo PN in questo esempio aumentare la loro forza di risposta, mentre con l'aumentare della concentrazione di odorizzante la latenza di risposta è diminuita (figure 5B, 5C). Questo risultato è piuttosto limitata e valida solo per l'odorizzante analizzato, ma è comunque in linea con i recenti modelli computazionali della AL ^37. Sia codifica concentrazione di odore in AL dell'ape sottende calcoli non lineari o sottende altre proprietà di codifica deve ancora essere analizzati in futuro. Inoltre il metodo può essere utilizzato (ii) per confrontare aspetti temporali nell'attività popolazione in due fasi successive di trasformazione, la AL-e MB-uscita (Figura 6). Analisi delle componenti principali (PCA) dimostra che l'odore di calcolo è prolungata e sopravvivere alla intera presentazione odore a livello PN mentre in ENs solo l'odore e spegnimento set sono stati rappresentati nell'attività popolazione (Figura 6). In tal modo la popolazione EN raggiunto la loro massima attività già in un punto temporale in cui si sta ancora sviluppando l'attività PN (cfr. film 1).

.. Figura 1 Produzione elettrodi micro-wire a tre canali A1) Le terminazioni di tre fili sono saldati ad un connettore pin IC in posizioni 11, 13 e 16 A2) Quattro alette di saldatura sono avvitati su una piastra di base in plastica plexiglas.; un perno minutien viene inserito nella punta di un capillare di vetro che viene poi attaccato alla piastra di plastica. A3) La piastra di plastica è incollato su di un pin IC e l'estremità libera di ciascun filo è saldato uno della saldatura superiore alette. B1) Per dotare il portaelettrodo con i fili sottili di rame, il capillare deve essere presa una volta di più. B2) La base del supporto viene poi fissato in una misura dispositivo di allineamento. Tre rame micro fili sono allineati lungo la scanalatura e fissati con del nastro adesivo ad ogni fine B3) I micro fili paralleli sono incollati insieme con la cera dentale e il capillare viene messo a posto (lunghe frecce).; micro fili incollati sono poi attaccati alla capillare con impronte dentarie e le sue estremità sono tagliate (frecce corte). B4) Le tre estremità dei fili di rame sono saldati alle tre alette di saldatura migliori portandoli così in contatto elettrico con la pin IC. C1) Due elettrodi completamente assemblati possono essere collegati tra loro per l'uso con un singolo headstage. C2) A tal fine i perni di un elettrodo (a sinistra, slave) sono collegati tramite conduttori isolati per l'altro elettrodo (a destra, alberoer), che è collegato alla fase testa; l'elettrodo headstage collegato può anche raccogliere input da un muscolo (M17) e l'elettrodo di riferimento (Ref).

Figura 2. Preparazione e inserimento elettrodo permanente nel cervello ape. A) Un ape è inserito in un supporto di plexiglas dopo immobilizzazione su ghiaccio. Antenne con Flagello (FL) e Scapus (SC) sono indicati. B) La testa e le antenne sono fissati con cera dentale. C) La capsula testa è rasata e l'ape è alimentato con acqua e zucchero. D) La capsula testa è aperto. E) Dopo aver rimosso ghiandole e trachea dalla parte superiore del cervello, le diverse neuropiles e limiti importanti essere facilmente distinte. Le traiettorie dei ALTs sono indicati conun segno dove sono inseriti gli elettrodi. (MB: corpo del fungo, AL: lobo antenne, OL: lobo ottico, α: Alpha lobo o lobo verticale, ALT: tratto lobo antenne, E1: lato di inserimento degli elettrodi per le registrazioni m-ALT, E2: lato di inserimento dell'elettrodo per l-ALT registrazioni). F) Riferimento (Ref) ed elettrodi muscolari (M17) sono inseriti nella capsula testa attraverso piccoli fori nella cuticola o l'occhio composto. G) Gli elettrodi a filo sono inseriti nel cervello presso i siti appropriati. H) dopo che fissa gli elettrodi in atto utilizzando due componenti di silicio, l'ape mostra ancora PER e può essere condizionato (ad es., usando acqua e zucchero).

Figura 3. Extracellulare registrazione in due tratti neurali ed estrazione singola unità (spike ordinamento). A ) Schema del setup sperimentale. L'ape è fissata in un supporto di plexiglas. Stimolazione odore è fornito tramite un tubo di vetro. Due gambi elettrodi registrano dal cervello delle api esposte. B) registrazioni simultanee dal l-e m-ALT PN (verde e viola tracce) che mostra le risposte eccitatorie su entrambi i tratti di una stimolazione 500 msec odore di miele in soluzione acquosa ad una concentrazione 1:100 a 33 ° C. Ogni linea tracciata rappresenta i canali differenziati come etichetta color-coded dall'elettrodo alette di saldatura in A. Bar:. 50 mV C) Dopo le procedure di picco classificare singoli potenziali d'azione sono ordinati e colore codificati. Sovrapposizione delle unità ordinate illustra la separazione delle forme d'onda. D) Spike intervallo istogramma indica la qualità separazione delle unità ordinate come prova della sufficiente ordinamento picco. Nota: non vi è alcun picco nel periodo refrattario dell'unità. E) Due viste (E1, E2) daun raggruppamento 3D dell'unità ordinato con analisi del componente principale che indica la distanza delle unità ordinati l'uno all'altro. Cerchi indicano l'2,5 volte la distanza di Mahalanobis che ricorda l'SD nello spazio e indica una differenziazione significativa dei cluster nella principale componente spaziale F) Colore unità codificate raffigurano i potenziali d'azione visibili in un ingrandimento di tre canali da una registrazione tratto. Cliccate qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4. Visualizzazione post-registrazione e 3D-ricostruzione della posizione di registrazione. A) proiezione di orto-fette lungo gli assi Z con allineamento massima intensità di un anteroe colmata retrograda dei neuroni di proiezione uniglomerular sporgenti dalla AL al MB e LH. Il tracciante intracellulare Microruby (tetramethylrhodamin destrano) è stato inserito nel AL dopo gli esperimenti di registrazione. Glomeruli all'interno del tinto AL prova adeguata colorazione PN. B) in proiezione delle fette orto lungo gli assi Z con allineamento massima intensità da una colorazione dei due elettrodi con Alexa hydrazide 488 che indica il posizionamento degli elettrodi per l'm-ALT (E1, freccia ) e l-ALT (E2, freccia). Il tracciante Alexa Hydrazide 488 migra verso il tessuto circostante elettrodo e colora il sito di inserimento dell'elettrodo. Nota, la colorazione di rilievo nel AL è un manufatto superficiale. C) ricostruzioni 3D delle cellule bersaglio colorate (PN) e il sito di inserimento dell'elettrodo da A, B (a destra) insieme a una visione schematica del sistema olfattivo delle api (di sinistra lato) con l'indicazione delle traiettorie-L e M-alt. Nota, solo uniglomersono mostrati tratti colare PN. AN: nervo antenne, AL: lobo antenne, LH: corno laterale, MB: il corpo del fungo, E1, E2: siti di inserzione di elettrodi, m-ALT: mediale tratto lobo antenne, l-ALT: laterale tratto lobo antenne, c: caudale, r: rostrale, m: mediale, l:. laterale cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Figura 5. Esempio di odore codifica concentrazione ai duplice via olfattiva. A) Trame calore illustrano la risposta di un singolo l-ALT (verde) e singoli m-ALT PN (viola) acquistare contemporaneamente da un individuo ape in risposta al odorizzante esanale a concentrazioni crescenti di odori (da 1: 10 ^-6 a 1:100). Ogni linea è una media di dieci stim provamento. La frequenza di scarica è indicata come cambiamento intensità relativa, che è la frequenza di scarica in relazione all'attività spontanea sottratto. B) latenza di risposta Popolazione di 11-l e 13 m-ALT PN da 7 api registrate. In ogni ape sono state registrate contemporaneamente i PN di entrambe le vie. La latenza di risposta della popolazione mostra una latenza decrescente con l'aumentare della concentrazione di odore in PN da entrambi i tratti. L'insorgenza risposta odore Allo antenne a 99 msec è stato registrato tramite electroantennograms e viene sottratto dai latenze di risposta PN. Si noti che le concentrazioni più basse risposte sono troppo deboli per misure di latenza e, di conseguenza, sono stati esclusi risposta. C) Popolazione sparare tasso di PN stesse come in B. Con l'aumento della concentrazione di odore la forza di risposta è in aumento. Il l-ALT mostra una resistenza più forte risposta. In B, C la media e la deviazione standard sono dati.

Figura 6. Confronto attività popolazione in due successive fasi di lavorazione lungo percorso olfattivo della api. Dati sono stati registrati in 20 animali che sono stati stimolati con 1-esanolo e 2-octanone. A) Ogni linea rappresenta il colore falso codificata media frequenza di scarica di una proiezione neurone (PN) calcolata su 10 ripetizioni odore di 1-esanolo. Presentazione Odore inizia al tempo 0 ed è durato tre secondi. B) mostra lo stesso in A), ma per il corpo fungo neuroni estrinseci (EN). La matrice mostrata in A) può essere visto come un vettore PN popolazione durante la stimolazione odore con 1-esanolo. Abbiamo calcolato lo stesso tipo di popolazione vettore durante la stimolazione odore con 2-octanone e usato entrambi i vettori in una analisi delle componenti principali (PCA) mantenendo la dimensione temporale. C) Le prime tre componenti principali (PC1, 2 e 3) sono statitracciata contro l'altro per illustrare la separazione odore nell'attività complesso PN all'uscita lobo antenne. Il tempo prima odore esordio è segnato in nero. Attività durante tre secondi di stimolazione con 1-esanolo è mostrata in blu. L'attività durante la stimolazione con 2-ottanolo è mostrato in rosso. Inoltre, vi mostriamo 1,5 secondi (post) dell'attività dopo l'odore di serie di 1-esanolo (luce blu) e 2-octanonen (rosa). Si noti che, a livello corale PN, sia gli odori che evocano traiettorie molto diverse stabilirsi in un "punto fisso", che sopravvive tutto il periodo di stimolazione odore. Solo dopo aver compensato l'odore le traiettorie si spostano di nuovo l'attività di base senza stimolazione odore. D) La stessa analisi è stata fatta a livello corale IT che rappresenta l'attività in uscita corpo fungo. Rispetto all'attività PN odori evocano una traiettoria meno distinta. Inoltre, un "punto fisso" non è osservabile. Le inizialmente odore traiettorie indotte Interrmingle con l'attività basale anche se l'odore è ancora presente. Solo l'offset odore evocato una traiettoria supplementare.

. Movie 1 ora risolto valutazione di una traiettoria odore indotto dopo analisi delle componenti principali di un vettore PN popolazione (a sinistra) e un EN popolazione vettore. (destra,. cp Figura 6) Le parti superiori sono i primi tre componenti principali (PC1, 2 e 3) tracciata contro l'altro. I pannelli inferiori illustrano la valutazione di PC1, 2 e 3 nel tempo. Stimolazione odore è segnato dalla barra grigia. Tutti i pannelli sono stati sincronizzati. Si noti che la EN dell'attività popolazione inizia poco prima dell'attività popolazione PN, un fenomeno che sembra essere contraintuitive ma può essere spiegato con la connettività e le proprietà degli strati in questione, che è descritto in precedenza ^1.

Discussione

Questo articolo illustra la produzione e l'utilizzo di multi micro canale filo-elettrodi progettati su misura. Gli elettrodi descritti sono adatti per la registrazione sia per singola unità e l'attività della popolazione che è particolarmente utile per le misurazioni di latenza e altre proprietà di risposta temporale di diversi neuroni e diverse neuropils all'interno di un unico esemplare (per i dettagli vedi ^1,2,25). Inoltre, abbiamo mostrato come implementare in modo permanente gli elettrodi a filo micro per consentire registrazioni stabili a lungo termine comportarsi api che durano per ore fino a giorni.

Extracellulari registrazioni multi-unit è diventato uno strumento favorevole per raggiungere alta risoluzione temporale combinata con informazioni spaziali. Nel nostro caso, questi sono o tratti neuronali in parallelo ² o due differenti neuropils ^1. Diverse neuroni possono essere registrati e analizzati a livello neuronale singola parallelamente e ad alta risoluzione temporale. Multi-unit registrazioneIngs sono stati applicati prima nei mammiferi ³⁸ e successivamente anche negli insetti ^39-41. Notevoli progressi è stato raggiunto con lo sviluppo e il miglioramento delle extracellulari tecniche di registrazione multicanale ^42,43. Questo, per esempio, comprende lo sviluppo di nuovi elettrodi ⁴⁴ o nuove picco di ordinamento e di clustering algoritmi ^45. Metodi generali di tecniche di registrazione multi-unit extracellulari sono ben descritti ^46-48. Gli elettrodi auto costruita mostrati in questo video inoltre possono essere adattati aggiungendo più microfili per elettrodo o micro fili possono essere intrecciati per ottenere misurabili distanze costanti tra le punte. Entrambe le procedure sarebbero, tuttavia, portare a diminuire la flessibilità e aumento dello spessore dell'elettrodo.

Rispetto alle sonde di silicio comunemente utilizzati per le registrazioni extracellulari in insetti molto più grandi, come il falco falena, locuste e scarafaggi ^{40,49 - 51} micro filo-elettrodi descritte sono più piccoli, flessibili e in grado di affrontare facilmente con i potenziali movimenti del cervello e, quindi, possono essere utilizzate in modo affidabile in piccoli insetti sociali come le api e le formiche che mostrano un repertorio comportamentale molto più ampio. La maggior parte delle sonde silicone hanno gambo appuntito come strutture di taglio assoni e tessuto neurale lungo il canale d'inserimento, mentre le micro fili descritti sono rotondi, flessibile e più piccole e sono quindi meno dannosi per il tessuto circostante che è un chiaro vantaggio se l'obiettivo è quello di studiare lungo plasticità termine in un animale intatto e di comportarsi. Un altro vantaggio di elettrodi a filo micro è la produzione a basso costo e la maneggevolezza. Invece di pulire accuratamente una sonda silicone costosi i fili elettrodi sono appena tagliato prima dell'inserimento cervello e, quindi, problemi mancanza di congestione. Inoltre è possibile utilizzare più di un filo elettrodo micro nella stessa preparazione sia inserita in diversi neuropiles ¹ otratti r ² come ci mostrano qui. Questo approccio è particolarmente favorevole per analizzare e confrontare aspetti temporali come latenze di risposta e interazioni a diversi livelli di elaborazione neurale.

Siamo consapevoli del fatto che un segnale registrato extracellulare non riflette l'attività della cellula singola per sé. E 'sempre un composto di attività tensione attorno alla punta dell'elettrodo. Per individuare la sorgente del segnale differenza dei due canali fili micro limitrofi entro un elettrodo viene sempre calcolata. Così la sorgente per i segnali spike utilizzati per estrarre l'attività singola unità era sempre molto vicino a uno o l'altro canale elettrodo conseguente forme d'onda spike facilmente distinguibili. I segnali provenienti da più lontano, come attività muscolare o attività di neuropils limitrofi, raggiungono entrambi gli elettrodi allo stesso tempo evocando forme e ampiezze comparabili e vengono scartati da questa procedura. Utilizzando la tecnica del modello corrispondente di Spike2,siamo molto fiduciosi di ottenere l'attività singola unità, che non è lo stesso, ma molto vicino all'attività singolo neurone. Tuttavia, la questione del picco ordinamento potrebbe essere evitato utilizzando tecniche di registrazione intracellulare.

Registrazioni cella singola sia con elettrodi taglienti o pipette di patch consentono conoscenza approfondita sulle proprietà fisiologiche di un singolo neurone. Tuttavia, a causa delle piccole dimensioni dei neuroni degli insetti e delle loro neuriti (ad es., Meno di 1 micron per le api PN ⁵²⁾ le registrazioni solo a breve termine sono gestibili. Inoltre, le registrazioni intra cellulari potrebbero essere invasivi e potrebbero danneggiare la cellula che è forse un altro motivo per i limiti temporali. Nel vivo registrazioni intracellulari negli insetti raramente sopravvivono un'ora. Una finestra di tempo che è stato sufficiente per il lavoro pionieristico di Martin Hammer ^53, che ha registrato intracellulare da un singolo neurone identificato, il ventrale spaiato maxilar neurone # 1 (VUMmx1). Poteva linchiostro sua attività direttamente al percorso premio. Juliane Mauelshagen ⁵⁴ registrato intracellulare l'attività di un fungo identificato corpo estrinseca neurone, il peduncolo neurone estrinseca # 1 (PE1) durante il condizionamento classico. Lo stesso neurone era nel fuoco di Menzel e Manz ⁵⁵ quando hanno trovato LTP dopo la stimolazione elettrica delle cellule Kenyon. Tuttavia, Okada e colleghi ⁵⁶ potrebbero usare l'innalzamento della intracellulare ben caratterizzato (punte doppie e triple) per l'identificazione del PE1 durante le registrazioni extracellulari. Dopo tutto una combinazione di entrambi i metodi, registrazioni intracellulari da neuroni identificati e registrazioni extracellulari lungo termine potrebbero essere un potente strumento per le indagini future.

Tuttavia, utilizzando elettrodi appuntiti per registrare più cellule (unità) simultaneamente a diversi livelli di elaborazione oltre molte ore fino a giorni per analizzare le loro relazioni risposta temporali e / o anche i cambiamenti plasticis quasi impossibile.

Con la prima rappresentazione di calcio si avvicina nel ape ^57,58 con coloranti calcio-sensibile l'analisi dei modelli spaziali di risposte odori erano accessibili ^59-62. Tuttavia, in molti casi i coloranti sensibili calcio devono essere introdotti al tessuto cerebrale tramite manipolazioni invasive che limitano nuovamente vita delle api e le proprietà intrinseche delle cellule analizzate. Questo problema è stato superato in altri organismi modello come il moscerino della frutta utilizzando sensori di calcio geneticamente introdotte ^63,64. Tuttavia, in generale, i sensori di calcio possono introdurre altre limitazioni in quanto possono agire come buffer di calcio che possono influenzare le proprietà temporali dei cattivi odori. Registrazioni intracellulari simultanee combinate con immagini di calcio o approcci computazionali in grado di dimostrare la risoluzione temporale corretta delle immagini processi ^65,66. Tuttavia, la risoluzione temporale del processo di imaging in sé è piuttosto cr limitato. Sistemi di acquisizione ottica di solito usano CCD-imaging con una risoluzione temporale di 5-20 Hz ^67, anche se 2-Photon-imaging potrebbe essere in grado di acquisire sequenze veloci ^68. Tuttavia, aumentando la frequenza di campionamento va sempre con una perdita in risoluzione spaziale. Inoltre i coloranti calcio-sensibile utilizzato nelle api subiscono sbianca, che riduce anche il tempo di acquisizione ^69.

Rispetto ad altre tecniche di registrazione fisiologiche negli insetti nostri elettrodi micro-filo multicanale flessibili garantiscono l'accesso a lungo tempo per singola unità e la popolazione l'attività neuronale nel comportarsi api.

Abbiamo dimostrato come utilizzare due di questi elettrodi in diverse fasi di lavorazione nello stesso animale, che facilita l'analisi degli aspetti codifica temporali tra i vari siti di registrazione. A seconda del problema di ricerca e il modello di insetti il ​​metodo di base della costruzione dell'elettrodo dimostrato qui è facilmente estenderegrado e / o possono essere adattati. Ad esempio è concepibile utilizzare più di tre fili singoli per produrre elettrodi multicanale. Inoltre, il numero di siti di registrazione può essere estesa e osservando aspetti temporali più di due tratti o neuropils è fattibile. La nostra speranza è che questo metodo ispirerà molti scienziati e contribuirà positivamente alla comprensione di sofisticata elaborazione neuronale in piccoli cervelli.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Paraffin oil	Fluka	76235
Odors	Sigma Aldrich
PBS			pH 7.2
4% Formaldehyde	ThermoScientific	28908	Methanol free
Triton X	BioChemica	A1388
Methylsalicylate	Roth	4529.1
Tetramethylrhodamin dextran, 10,000 MW (Microruby)	Invitrogen	D7162	keep dark
Alexa 488 hydrazide	Invitrogen	A-10436	keep dark
Alexa 568 hydrazide	Invitrogen	A-10437	keep dark
Bee Ringer Solution	see 2
Polyurethane-coated copper wire	Elektrisola	15µm diameter & P155 insulation
Dental Wax	Densply Detrey	64103015S1	moderate melting point
Dental Wax	Flexaponal	124-202-00	low-melting Wax
KWIK SIl	WPI	03L
18 Pin Socket	Conrad Electronic	189634-62
Hot melting glue	Conrad Electronic	827673
soldering needle	Conrad Electronics	830283	12 V
Soldering terminal lug	Conrad Electronic	531901
Glaselectrodes	WPI	1B100F-3
Minutien Pins	Fine Science Tools	26002-20	V2A 0.2 x 12 mm
switchable headstage	Tucer Davis Technologies	SH16
Headstage connection module	NPI	INT-03M
Amplifier Module	NPI	PDA-2F
Data Acquisition boards	National Instruments	NI-6123, Ni-6143
Acquisition Software	National Instruments	Lab View 8.2	custom design
Spike-Sorting	CED	Spike 2 v7.11
Matlab	Mathworks	R2008B
Micromanipulator	Leitz		manual
AG-wires	WPI	AGT05100
Confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP2 AOBS
AMIRA	Mercury Computer Systems	2/5/2000