בידוד וההעשרה של אדם שומן המופק מתאי סטרומה לOsteogenesis משופר

Summary

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Abstract

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Introduction

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

Protocol

הערה: כל דגימות המטופל התקבלו עם הסכמה מדעת, ופרוטוקולי ניסוי היו נבדקו ואושרו על ידי אוניברסיטת סטנפורד Institutional Review Board (פרוטוקול # 2,188 ו# 9999).

1. בידוד תא ותרבות:

1. רקמת שומן תת-עורי לקבל אדם ממטופלות בריאה עוברות lipoaspiration בחירה של הבטן, אגף, ו / או באזור הירך בהרדמה הכללית מקומית /. ודא שInstitutional Review Board אישור (IRB) אושר על הפרוטוקול של בידוד ASCs מרקמות אנושיות, ופעל אמצעי בטיחות מוסדי בעת שעבד עם חומרים כאלה.
2. כדי להשיג את SVF מרקמת שומן lipoaspirated, לשטוף ראשון lipoaspirate שלוש פעמים עם כמויות שווים של פוספט שנאגרו מלוח סטרילית 1x (PBS). בזהירות לשאוב וזורקים את השכבה המימית התחתונה.
3. הכן את חיץ עיכול collagenase: סוג 0.075% אני Collagenase בהאנק שלפתרון מאוזן מלח (HBSS). הכן חיץ FACS: 2% FBS, P188 1% לבין 1% פן-דלקת בPBS. סנן פתרונות הן באמצעות מסנן זמין מסחרי 0.22 מיקרומטר גודל נקבובית זרימה מהירה polyethersulfone.
4. לעכל את רקמת השומן נשטפה, להוסיף נפח שווה של חיץ עיכול collagenase ולמקם את כלי עיכול באופן מאובטח באמבט מים רועד במשך 60 דקות ב 37 ° C (כ 180 שייקים / min).
   הערה: עדיף להשתמש בכלי עיכול נפח גדול יותר מהנדרש, כמו זו מאפשרת לעיכול מקסימאלי במהלך רועד (כלומר, 250 מיליליטר של חיץ עיכול collagenase, 250 מיליליטר של רקמת שומן נשטפה בבקבוק 1 ליטר סטרילי).
5. לנטרל פעילות האנזימטית על ידי הוספת נפח שווה של חיץ FACS ומאפשר לשבת על RT במשך 5 דקות. בשלב הבא, צנטריפוגות ב 233 XG במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
6. בזהירות לשאוב וזורקים supernatant, נזהרים שלא להפריע את כדור SVF בצפיפות הגבוהה.
7. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של אדום RTתא תמוגה חיץ, המבוסס על גודל גלולה. השאר פתרון לשבת בRT עבור 5 דקות ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות בRT.
8. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ידי הוספת 5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוססים על גודל גלולה (הנשר בינוני השתנה Dulbecco [DMEM] / 10% FBS / 1% [עט-סטרפטוקוקוס] פניצילין, סטרפטומיצין פתרון).
9. סנן את ההשעיה באמצעות מסננת תא ניילון 100 מיקרומטר להסיר פסולת הסלולר.
10. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 ° C, וזורקים supernatant מבלי לשבש את גלולה.
11. Resuspend גלולה ב5-10 מיליליטר של תקשורת צמיחה המסורתית, המבוסס על גודל גלולה.
12. מקום 2 x 10 ⁶ תאים בצלחת תרבות 15 סנטימטר סטנדרטית ולהקים תרבויות עיקריות O / N ב 37 מעלות צלזיוס / 21% O _2, 5% CO _2. לשמור ברמות תת-ומחוברות למניעת התמיינות ספונטנית על 37 מעלות צלזיוס / 21% O _2, 5% CO ₂ בתקשורת צמיחה.
    צפיפות תאים באופן מלא: הערהצלחת 15 סנטימטר ומחוברות היא כ 4-6 x 10 ⁶ תאים.

2. מכתים

1. ASCs תרבות במדיום גידול מסורתי על 37 מעלות צלזיוס O / 21% _2, 5% CO _2, 36 שעות לפני מכתים / מיון.
2. ASCs Lift מצלחות התרבות באמצעות Accutase (לפי הפרוטוקול של היצרן).
3. לשטוף את תאי פעם עם חיץ FACS (PBS עם FBS 2% לבין 1% עט-סטרפטוקוקוס).
4. צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
5. בטל supernatant מבלי לשבש את גלולה. Resuspend התאים 0.5-1 מיליליטר של חיץ FACS (תלוי במספר תאים וכמות הנוגדנים הרצויים).
   הערה: הנפח של ההשעיה התא, בהתאם להמלצות יצרן נוגדני FACS, קובעת ריכוז נוגדן. עם זאת, טיטרציה של ריכוז נוגדנים, באמצעות ריכוז התחלתי של 1: 100, בדרך כלל מומלץ אם זה בפעם הראשונה להשתמש נוגדן.
6. לספור את המספר הכולל שלתאים באמצעות hemocytometer.
7. שמורת 100 aliquots ul בצינורות 1.5 מיליליטר צנטריפוגות כדי לשמש למדגם בלא כתם ובקרות חד-צבע (לפי מספר נוגדני ניאון בשימוש).
8. הוסף את הנוגדנים חד-שבטיים fluorescently שהכותרת המתאימים (בריכוזים שנקבעו מראש, לפי הוראות יצרן) ו דגירה של 20-30 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
   1. לתייג תת-אוכלוסיית osteogenic: לדלל אנטי CD90 (CD90 APC אנטי-אנושי (Thy1)) או אנטי-CD105 (FITC אנטי אנושי CD105 (endoglin)) במאגר FACS לריכוז של 1:50.
   2. לתייג אוכלוסיות תאים אחרות (לדוגמא, hematopoietic ותאי האנדותל): לדלל אנטי CD45 (Anti-האדם CD45 Pacific Blue), אנטי-CD34 (Anti-אדם CD34 APC), ו / או אנטי-CD31 (Anti-האדם CD31 PE ) בFACS חיץ לריכוז של 1:50.
   3. אם לא באמצעות נוגדנים מצומדות ישירות, להשתמש נוגדן ראשוני biotinylated עם שנייה streptavidin מצומדות- מתאימהנוגדן האר"י, כגון streptavidin PE-Cy7, בדילול של 1: 100.
9. לאחר דגירה, לשטוף את התאים פעמיים: למלא צינורות עם חיץ FACS ו צנטריפוגות ב 233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס, aspirating supernatant.
10. Resuspend התאים 400-500 דגימות μl FACS חיץ ומסנן דרך מסננת תא ניילון 70 מיקרומטר להסיר גושי תא.
11. העבר את התאים שכותרתו לתוך צינורות FACS עם ראש המסנן ולשמור על דגימות קרח למשך ניתוח.

3. מיון תא הקרינה המופעל

הערה: השלבים הבאים מחייבים ידע קודם בתא הקרינה המופעל מיון (FACS) או סיוע של טכנאי מיומן.

1. שימוש בתוכנת FACS המתאים, מגרשי ניתוח העיצוב לבחון פיזור קדימה (FSC), פיזור צד (SSC), Phycoerythrin (PE) -טקסס אדום, פסיפיק הכחול, והעמסת isothiocyanate (FITC), Allophycocyanin (APC) וכל שימוש אחר fluorophoreד לתייג תאים.
2. לפני הטעינה לסדרן התא, בקצרה מערבולת מדגם זה לresuspend התאים.
3. להתחיל עם ניתוח של המדגם בלא כתם כדי להגדיר שערים לכלל אוכלוסיית התא, להוציא פסולת הסלולר, ולקבוע autofluorescence תחילת המחקר.
4. להוסיף יודיד propidium (PI) למדגם בלא כתם ולנתח אותו כדי להמחיש את האוכלוסייה של תאי חיים בתוך כלל אוכלוסיית התא. לבנות שער סביב אוכלוסייה זו.
5. ניתוח מדגם שליטה יחיד צבע עבור כל fluorochrome כדי להגדיר פיצוי הקרינה.
6. לנתח את המדגם המוכתם כדי לקבוע את המיקום של שערים למיון.
7. להוסיף PI למדגם המוכתם כדי להכתים תאים מתים.
8. למיין את אוכלוסיות תאים שכותרתו. מיין לתוך או 1.5 מיליליטר צינורות צנטריפוגה או צינורות חרוטי (15 מיליליטר) המכילים מדיום התרבות.
9. באופן ידני להפסיק מיון פעם אחת הכמות הנדרשת של תאים הושגה.
10. שלנוing FACS, לבצע בדיקת טוהר על ידי ניתוח חלק קטן (למשל., 500 תאים) של אוכלוסיית התא שנרכשה.
    הערה: שלב זה מאשר את טוהר של אוכלוסיות תאים הממוינים. באופן אידיאלי, טוהר צריך להיות גדול מ 90-95%.
11. תאי צנטריפוגה ב233 XG במשך 5 דקות על 4 מעלות צלזיוס מייד לאחר השלמת מיון וגלול ב 1 מיליליטר של מדיום טרי המכיל 10% FBS.
    הערה: הסכום של תקשורת המשמשת עשוי להיות מוגבר המבוסס על גודלו של התא גלולה.
12. צלחת על צלחות מצופים ג'לטין כדי לשפר את כדאיות תא. בהתאם לתשואה סופית תא, צלחת 300,000 תאים לכל גם בצלחת 6-היטב, 100,000 תאים לכל גם בצלחת 12 גם.

תוצאות

באמצעות CD90 כסמן לתאים עם תוצאות משופרות Osteogenesis בבידוד של אוכלוסיות מועשרות של ASCs האנושי (איור 1 א, 1 ב '). ASCs הוכתמו CD45 פסיפיק בלו-מצומדות אנטי-אנושי, CD105 אנטי אנושי FITC מצומדות-, וCD90 אנטי אנושי APC-מצומדות. לאחר המיון, רמת טוהר הייתה גדול יותר מ- 98%, כפי שלכמת ידי ני...

Discussion

נכון לעכשיו, את בידודה של תת-אוכלוסיות הומוגניות של ASCs מSVF של רקמת שומן אנושית נותר מאתגר אף מטרה רצויה. בידוד של אוכלוסיות ASC פרו-osteogenic במיוחד רצוי, כפי שניתן להשתמש בם תאים כאלה כדי ללמוד את ההיווצרות והומאוסטזיס של רקמות שלד. עם זאת, SVF של רקמת שומן נמלי הטרוגניות משמ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences