Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Resumo

The transcriptional heterogeneity within human adipose-derived stromal cells can be defined on the single cell level using cell surface markers and osteogenic genes. We describe a protocol utilizing flow cytometry for the isolation of cell subpopulations with increased osteogenic potential, which may be used to enhance craniofacial skeletal reconstruction.

Resumo

Bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (BM-MSCs) are considered the gold standard for stem cell-based tissue engineering applications. However, the process by which they must be harvested can be associated with significant donor site morbidity. In contrast, adipose-derived stromal cells (ASCs) are more readily abundant and more easily harvested, making them an appealing alternative to BM-MSCs. Like BM-MSCs, ASCs can differentiate into osteogenic lineage cells and can be used in tissue engineering applications, such as seeding onto scaffolds for use in craniofacial skeletal defects. ASCs are obtained from the stromal vascular fraction (SVF) of digested adipose tissue, which is a heterogeneous mixture of ASCs, vascular endothelial and mural cells, smooth muscle cells, pericytes, fibroblasts, and circulating cells. Flow cytometric analysis has shown that the surface marker profile for ASCs is similar to that for BM-MSCs. Despite several published reports establishing markers for the ASC phenotype, there is still a lack of consensus over profiles identifying osteoprogenitor cells in this heterogeneous population. This protocol describes how to isolate and use a subpopulation of ASCs with enhanced osteogenic capacity to repair critical-sized calvarial defects.

Introdução

The heterogeneous nature of stem cell populations is not yet fully understood and remains a major impediment to the development of clinically effective stem cell-based therapeutic applications. One of the most common ways to characterize a heterogeneous population of stem cells is to employ a cell sorting method, such as fluorescence-activated cell sorting (FACS), to separate cells based on their surface marker expression profiles. As sorting methods become more complex, it becomes possible to identify more distinct functional subpopulations of cells. Microfluidic-based technologies are becoming more and more frequently utilized in analysis of gene expression at the single cell level. Multiplexed quantitative polymerase chain reaction (qPCR) within a microfluidic chip allows for effective and reliable high-resolution, single cell transcriptional analysis.^1-5

In a previous study using single cell transcriptional profiling of 48 genes, considerable transcriptional heterogeneity was observed among ASCs.⁶ However, the distribution of genes MSX2, BMP-5, BMP-7, ALP, OCN, RUNX2 exhibited a strong association with a cluster of cells possessing highly osteogenic transcriptional profiles. To isolate cells according to this osteogenic gene expression profile, surface antigen expression patterns were correlated with transcription patterns and surface marker expression of endoglin (CD105) was subsequently discovered to closely correlate with enhanced osteogenic differentiation potential of ASCs. Independent of CD105 expression, expression of surface receptor Thy-1 (CD90), a glycosyl-phosphatidylinositol-linked membrane protein previously shown by Chen et al. to be associated with osteoprogenitor cells, was also correlated with osteogenic gene expression.^6,7 These findings provide the opportunity to prospectively isolate subpopulations within the larger heterogeneous pool of ASCs with increased osteogenic capacity for cell-based bone tissue engineering applications.

Protocolo

NOTA: Todas as amostras dos pacientes foram obtidos com o consentimento informado, e os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pela Stanford University Institutional Review Board (Protocolo nº 2188 e # 9999).

1. Isolamento celular e Cultura:

1. Obter tecido adiposo subcutâneo humano de pacientes saudáveis ​​do sexo feminino submetidos a lipoaspiração eletiva do abdômen, flanco, e / ou região de coxa sob anestesia local / geral. Certifique-se de que Institutional Review Board (IRB) a aprovação foi obtida para o protocolo de isolar ASC de tecidos humanos, e siga as precauções de segurança institucionais ao trabalhar com esses materiais.
2. Para obter o SVF a partir do tecido adiposo lipoaspirated, lava-se a primeira lipoaspirado três vezes com volumes iguais de solução salina tamponada 1x com fosfato estéril (PBS). Aspirar cuidadosamente e descartar a camada aquosa inferior.
3. Preparar o tampão de digestão de colagenase: 0,075% de colagenase do Tipo I em HankBalanced Salt Solution (HBSS). Preparar tampão de FACS: 2% de FBS, 1% P188 e 1% de Pen-Strep em PBS. Filtrar ambas as soluções através de um tamanho de poro de 0,22 um fluxo rápido filtro polietersulfona disponível comercialmente.
4. Para digerir o tecido adiposo lavada, adicionar um volume igual de tampão de digestão com colagenase e colocar vaso de digestão de forma segura em um banho de água com agitação durante 60 min a 37 ° C (cerca de 180 agitações / min).
   NOTA: É melhor utilizar um vaso de digestão volume maior do que o necessário, pois isso permite uma digestão durante a agitação máxima (isto é, 250 ml de tampão de digestão com colagenase, de 250 ml de tecido adiposo lavado em um frasco estéril 1L).
5. Neutraliza-se a actividade enzimática por adição de um volume igual de tampão de FACS e permitindo a sentar-se à TA durante 5 min. Em seguida, centrifugar a 233 xg durante 20 min a 4 ° C.
6. Aspirar cuidadosamente e desprezar o sobrenadante, tomando cuidado para não perturbar o SVF pellet de alta densidade.
7. Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de RT vermelhocélulas de tampão de lise, com base no tamanho da pelota. Deixar a solução sentar à temperatura ambiente durante 5 min e centrifugar a 233 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento, adicionando 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho da pelota (Dulbecco Modified Eagle Medium [DMEM] / FBS a 10% / 1% de solução de penicilina-estreptomicina [pen-strep]).
9. Filtra-se a suspensão através de um filtro de células de 100 mm de nylon para remover os detritos celulares.
10. Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, e desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
11. Ressuspender o sedimento em 5-10 ml de meio de crescimento tradicional, com base no tamanho do sedimento.
12. Coloque 2 x 10 ⁶ células em uma placa de cultura de 15 centímetros padrão e estabelecer culturas primárias O / N a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO _2. Mantém-se a níveis sub-confluente para impedir a diferenciação espontânea a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO ₂ em meio de crescimento.
    A densidade celular em um plenamente: NOTAconfluente 15 centímetros da placa é de aproximadamente 4-6 x 10 ⁶ células.

2. Coloração

1. ASC Cultura em meio de crescimento tradicional, a 37 ° C / 21% _{de O2,} 5% de CO _2, por 36 horas antes da coloração / classificação.
2. ASC carona de placas de cultura utilizando Accutase (de acordo com o protocolo do fabricante).
3. Lave as células uma vez com tampão de FACS (PBS com 2% de FBS e 1% de pen-strep).
4. Centrifuga-se a 233 xg durante 5 min a 4 ° C.
5. Desprezar o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Ressuspender as células em 0,5-1 mL de tampão de FACS (dependendo do número de células e a quantidade de anticorpo desejado).
   NOTA: O volume da suspensão de células, de acordo com as recomendações do fabricante do anticorpo FACS, determina a concentração de anticorpos. No entanto, a titulação da concentração de anticorpo, utilizando uma concentração de partida de 1: 100, é normalmente aconselhada se é a primeira vez que a utilização de um anticorpo.
6. Contar o número total decélulas utilizando um hemocitómetro.
7. Reserva alíquotas de 100 ul em tubos de 1,5 ml de centrífuga a ser utilizado para uma amostra não corado e controlos de cor única (de acordo com o número de anticorpos fluorescentes utilizados).
8. Adicionar os anticorpos monoclonais marcados com fluorescência adequados (em concentrações pré-determinadas, segundo as instruções do fabricante) e incubar durante 20-30 minutos em gelo, protegida da luz.
   1. Para etiquetar subpopulação osteogénico: Diluir anti-CD90 (APC CD90 anti-humano (Thy1)) ou anti-CD105 (FITC anti-CD105 humano (endoglina)) em tampão de SCAF até uma concentração de 1:50.
   2. Para identificar as outras populações de células (por exemplo, hematopoiética e células endoteliais): Diluir anti-CD45 (anti-CD45 humano do Pacífico azul), anti-CD34 (anti-CD34 humano APC), e / ou anti-CD31 (anti-humano CD31 PE ) em tampão de FACS para uma concentração de 1:50.
   3. Se não utilizando anticorpos directamente conjugados, utilizar um anticorpo primário biotinilado com um segundo conjugado de estreptavidina-apropriadaanticorpo ária, tal como estreptavidina PE-Cy7, a uma diluição de 1: 100.
9. Após a incubação, lavar as células duas vezes: encher os tubos com tampão de SCAF e centrifugar a 233 xg durante 5 min a 4 ° C, o sobrenadante por aspiração.
10. Ressuspender as células em 400-500 amostras ul FACS tampão e filtro através de um 70 um filtro de células nylon para remover aglomerados de células.
11. Transferir células marcadas em tubos de FACS com topo do filtro e manter as amostras em gelo durante a duração da análise.

3. activadas por fluorescência celular

NOTA: Os passos seguintes mandato conhecimento prévio em células activadas por fluorescência (FACS) ou a assistência de um técnico especializado.

1. Usando o software FACS adequadas, parcelas de análise de projeto para examinar dispersão para a frente (FSC), dispersão lateral (SSC), ficoeritrina (PE) -Texas Red, Blue Pacific, Fluorescein Isothiocyanate (ITCF), aloficocianina (APC) e qualquer outro uso fluorophored para marcar as células.
2. Antes de carregar no separador de células, brevemente vórtice cada amostra para voltar a suspender as células.
3. Começar com a análise da amostra não corado, de modo a definir portas para a população total de células, para excluir os detritos celulares, e para determinar a linha de base da autofluorescência.
4. Adiciona-se iodeto de propídio (PI) para a amostra não corado e analisá-lo, a fim de visualizar a população de células vivas na população total de células. Construir um portão em torno desta população.
5. Analisar uma amostra de controlo de cor única para cada fluorocromo, a fim de definir a compensação de fluorescência.
6. Analisar a amostra corada para definir a posição de portas para a classificação.
7. Adicionar PI para a amostra corada de forma a corar as células mortas.
8. Organize as populações de células marcadas. Separar por quer tubos de 1,5 ml de centrífuga ou tubos cónicos (15 ml) contendo meio de cultura.
9. Cessar a triagem manual, uma vez a quantidade necessária de células foi obtido.
10. Nósing FACS, executar uma verificação de pureza por análise de uma pequena fracção (por exemplo., células 500) da população de células obtidas.
    NOTA: Este passo confirma a pureza das populações de células classificadas. Idealmente, a pureza deverá ser superior a 90-95%.
11. Centrifugar células a 233 xg durante 5 min a 4 ° C imediatamente após a conclusão de triagem e ressuspender em 1 ml de meio fresco contendo 10% de FBS.
    NOTA: A quantidade de material utilizado pode ser aumentado com base no tamanho do sedimento celular.
12. Placa em placas revestidas com gelatina para melhorar a viabilidade celular. Dependendo do rendimento celular final, a placa de 300.000 células por cavidade em uma placa de 6 poços, 100000 células por poço numa placa de 12 poços.

Resultados

Usando CD90 como um marcador para células com melhores resultados de osteogénese no isolamento de uma população altamente enriquecidas de ASC humanos (Figura 1A, 1B). ASC foram coradas com azul-Pacífico CD45 conjugado anti-humano, conjugado com FITC anti-CD105 humano, e CD90 anti-humano conjugado com APC. Após a separação, o nível de pureza foi superior a 98%, tal como quantificado por análise post-tipo.

Definição de grupos de células com base em perfis de trans...

Discussão

Actualmente, o isolamento de subpopulações homogéneas de ASC de SVF de tecido adiposo humano continua a ser um desafio embora objectivo desejável. Isolamento de subpopulações ASC pró-osteogénicas é particularmente desejável, uma vez que tais células podem ser utilizadas para estudar a formação e a homeostase do tecido esquelético. No entanto, o SVF de tecido adiposo abriga heterogeneidade significativa no que diz respeito a conter capacidade celular e potencial de diferenciação. ¹¹ A base mole...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Disposable 250 ml Conical Tubes	Corning (Thomas Scientific)	2602A43
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml)	Gibco	15140-122
DMEM, high glucose, GlutaMAX Supplement	Gibco	10566-016
PBS, pH 7.4	Gibco	10010-023
Betadine - Antiseptic Povidone/Iodine Solution	Purdue	PFC-67618015017
Hank's Balanced Salt Solution, 1X	Cellgro	21-023-CV
Fetal Bovine Serum, Certified, US Origin	Gibco	16000-044
Collagenase from Clostridium histolyticum	Sigma-Aldrich	C0130-5G
ACCUTASE Cell Detachment Solution	Stem Cell Technologies	7920
APC Mouse Anti-Human CD90	BD Pharmingen	559869
FITC Mouse anti-Human CD105 (Endoglin)	BD Pharmingen	561443
Anti-Human CD45 eFluor 450 (Pacific Blue replacement)	eBioscience	48-9459-41
Anti-Human CD34 APC	eBioscience	17-0349-41
Anti-Human CD31 (PECAM-1) PE	eBioscience	12-0319-41
Streptavidin PE-Cy7	eBioscience	25-4317-82
BD FACS Aria II instrument	BD Biosciences
BD FACSDiva Software	BD Biosciences